Summary
该协议描述了一种对成年小鼠进行骨折并监测愈合过程的方法。
Abstract
骨折修复是骨骼的基本功能,无法在 体外可靠地建模。小鼠损伤模型是测试基因,基因产物或药物是否影响骨修复的有效方法,因为小鼠骨骼概括了在人类骨折愈合期间观察到的阶段。当小鼠或人类骨折时,炎症反应被启动,骨膜,围绕骨骼本身的干细胞生态位,被激活并扩张。然后,居住在骨膜中的细胞分化形成血管化的软愈伤组织。从软愈伤组织到硬愈伤组织的转变发生在新募集的骨骼祖细胞分化成矿化细胞时,骨折末端的桥接导致骨愈合。然后,矿化的愈伤组织进行重塑,以恢复愈合骨的原始形状和结构。已经使用各种损伤模型在小鼠中研究了骨折愈合。尽管如此,概括整个生物过程的最佳方法是突破包含两个皮质的长骨的横截面。该协议描述了如何安全地进行稳定的横贯性股骨骨折以评估成年小鼠的愈合情况。还提供了手术方案,包括详细的收获和成像技术,以表征骨折愈合的不同阶段。
Introduction
骨折,骨表面连续性的断裂,发生在人群的所有部分。由于衰老或疾病而骨骼脆弱的人,它们变得严重,脆性骨折的医疗保健费用预计将在5年内超过250亿美元1,2,3,4,5。了解骨折修复所涉及的生物学机制将是开发旨在增强愈合过程的新疗法的起点。以前的研究表明,骨折后,会发生四个重要步骤,使骨骼愈合:(1)血肿的形成;(2)形成纤维软骨愈伤组织;(3)软愈伤组织矿化形成骨骼;(4)愈合骨的重塑6,7。许多生物过程被激活以成功愈合骨折。首先,在骨折后立即启动急性促炎反应6,7。然后,骨膜被激活并扩张,骨膜细胞分化成软骨细胞以形成软骨愈伤组织,其生长以填充被破坏的骨节段6,7,8,9留下的间隙。神经和血管细胞侵入新形成的愈伤组织以提供促进修复所需的额外细胞和信号分子6,7,8,9,10。除了有助于愈伤组织形成外,骨膜细胞还分化成成成骨细胞,在桥接愈伤组织中铺设编织骨。最后,破骨细胞重塑新形成的骨骼以恢复到其原始形状和层状结构7,8,9,10,11。许多小组开发了骨折修复的小鼠模型。小鼠早期和最常用的骨折模型之一是Einhorn方法,其中重量从特定的高度12下降到腿上。缺乏对角度和用于诱导骨折的力的控制,导致骨不连续性的位置和大小产生很多可变性。随后,它导致观察到的特定骨折愈合反应的变化。其他流行的方法是手术干预以产生胫骨单皮质缺损或应力性骨折,这些手术诱导相对温和的愈合反应10,13。这些模型中的可变性主要是由于执行该过程的人14。
在这里,详细的小鼠股骨损伤模型允许控制断裂,以提供可重复的损伤,并允许对股骨骨折修复进行定量和定性评估。具体而言,在成年小鼠的股骨中引入完全突破并稳定骨折末端,以解释物理负荷在骨骼愈合中的作用。还详细介绍了使用组织学和显微计算断层扫描(microCT)采集组织和成像愈合过程不同步骤的方法。
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Protocol
所有描述的动物实验都得到了哈佛医学区机构动物护理和使用委员会的批准。该方案使用12周龄的C57BL / 6J小鼠(雄性和雌性)。C57BL / 6J雄性和雌性小鼠在12周龄左右达到峰值骨量,股骨宽度足以适合稳定针,使它们成为用于该方案的适当菌株15。
1. 手术准备
- 高压灭菌手术设备,包括手术剪刀、直钳、弯曲镊子、手术夹具和金刚石切割轮(见 材料表),以最大限度地降低感染风险。
- 将干净的小鼠笼放在加热垫上,以方便术后恢复。将加热垫设置为达到37-45°C之间的温度。
- 使用异氟醚室将小鼠置于麻醉状态。将诱导氧流量设置为2 L /min,异氟醚诱导量设置为2-4%,维持鼻锥氧气设置为2 L / min,维持异氟醚为1.4%。
- 确认鼠标的呼吸是稳定的,并且它们对脚趾捏合没有反应。在每只眼睛上涂抹一层薄薄的眼药膏,以防止角膜刮伤。将小鼠转移到无菌垫上,并使用鼻锥保持麻醉,以与步骤1.3相同的速率连续输送异氟醚。
注意:建议使用12周龄或更大的小鼠,因为年轻小鼠的股骨可能太薄而无法容纳稳定针。 - 皮下注射小鼠0.05mg / kg体重的缓释丁丙诺啡(见 材料表)。
- 使用电动修剪器,在两条大腿上剃除一个2 x 2厘米的正方形,对应于股骨的位置。
- 使用无菌纱布或拭子对剃须区域进行消毒,以铺上一层碘,然后用70%乙醇冲洗(图1A)。
2. 手术
- 使用无菌手术刀,在剃光的消毒区域做一个5毫米的切口,剥开皮肤以暴露下面的筋膜。
- 使用直镊子和细剪刀巧妙地抓住并切割直接覆盖股骨的筋膜,以暴露肌肉。筋膜切口 5 mm 足以进入下层肌肉。
- 使用一对直镊子,轻轻地将肌肉与股骨分开,将组织损伤降至最低。
- 一旦可以看到股骨,在分离的肌肉和骨骼之间滑动股骨下方的弯曲镊子。让镊子慢慢打开以保持肌肉分离并固定股骨,以促进干净的切口。
注意:当镊子未握住时,股骨必须保持暴露并与肌肉和皮肤分开,如图 1B所示。 - 使用低功率设置的手持锯在股骨轴中间进行横向切割(参见刀片和所用旋转工具套件 的材料表 )。
注意:一旦股骨被完全切开,就会产生两个骨折末端:近端部分(附着在髋骨上)和远端部分(连接到膝盖,也称为窒息关节)。避免在一次运动中切割股骨。相反,进行3-5次传递,直到股骨完全切开。这对于避免周围组织过热并产生大量骨碎片,从而对愈合产生负面影响至关重要。 - 将导针(23 G x 1 TW IM,0.6 mm x 25 mm)(参见 材料表)插入远端部分的骨髓腔中。当您推动穿穿膝关节时,用手指轻轻地扭转针头(图1C)。
- 从远端取出导针,并在近端重复,使用相同的轻柔扭转运动将导针推过髋关节。将导针留在近端,其尖端从皮肤中出现(图1D)。
注:为了稳定骨折末端,首先使用导针来形成穿过骨折末端的路径,然后将稳定销穿过该通道以固定骨折末端14。
- 从远端取出导针,并在近端重复,使用相同的轻柔扭转运动将导针推过髋关节。将导针留在近端,其尖端从皮肤中出现(图1D)。
- 将稳定销(针,27 G x 1 1/4,0.4 mm x 30 mm)(参见 材料表)插入导针的尖端(图1E)。轻轻推动,使稳定针在导针离开近端骨髓腔时进入。
- 丢弃导针。使用镊子将远端与近端保持并对齐,并继续将稳定销穿过远端骨髓腔,直到它使用2.6中形成的通路离开膝关节(图1F)。
注意:稳定销现在应从髋关节和膝关节突出。
- 丢弃导针。使用镊子将远端与近端保持并对齐,并继续将稳定销穿过远端骨髓腔,直到它使用2.6中形成的通路离开膝关节(图1F)。
- 使用手术钳,拉动针尖以使近端和远端部分靠近在一起,因此它们几乎不接触。如果需要,用镊子重新对齐骨折末端,并使用手术夹具将稳定销的末端朝向骨折部位折叠( 参见材料表)。
- 使用线切割器从针的底座上取下塑料。使用夹子,扭转销钉的两端直至钝化,以避免内部组织损伤。
注意:骨折末端现在锁定到位,以便鼠标可以减轻受伤腿部的重量。如果断裂端无法分离,则固定销钉。线切割机也可用于钝化末端。稳定针必须在整个研究期间保持在原位,直到小鼠被安乐死。试图移开针可能会破坏骨折反应的稳定性,并对动物造成伤害。插针可以在解剖时取下。
- 使用线切割器从针的底座上取下塑料。使用夹子,扭转销钉的两端直至钝化,以避免内部组织损伤。
- 使用直镊子将肌肉重新定位到股骨上。使用弯曲的镊子,将皮肤的末端捏在一起,并使用伤口夹子关闭开口。
注意:不要用夹子太紧地闭合皮肤,否则鼠标会避免将重量放在这条腿上。在恢复过程中限制物理负载可能会延迟修复过程。 - 在另一条腿上重复步骤2.2至2.4,并在不进行股骨骨折的情况下关闭伤口。
注意:这种假手术的股骨作为对侧对照。 - 撤回异氟醚暴露,将小鼠置于加热的笼子中,并确保它们在10-15分钟内恢复意识。
- 手术后5天每天监测小鼠的活动和切口部位,以发现窘迫或感染的迹象。
注意:如果动物表现出疼痛迹象,不进食和/或犹豫不决,请咨询兽医人员并给予额外的镇痛药。 - 手术后10天取下伤口夹。
注意:如果伤口在10天后似乎没有闭合,请在取下夹子之前咨询兽医人员和IACUC。
3. 组织收获
- 通过CO2吸入对小鼠实施安乐死,然后进行宫颈脱位。
注:该程序与美国兽医协会安乐死小组一致。 - 使用剪刀和镊子,从两条小鼠腿上取下皮肤,将股骨头从髋骨上脱臼,并切开相邻的肌肉以释放腿部。
注意:避免去除股骨周围的太多肌肉,因为愈伤组织可能会脱落或受损。 - 避免使用稳定针,切开膝关节,将股骨与胫骨分开。
- 在股骨远端和近端周围解剖,以暴露稳定针的末端。
- 使用硬线切割器,切割销的折叠钝端,以便仅保留销的直端。使用镊子缓慢而轻柔地将稳定销滑出股骨。
注意:如果针脚不容易滑出,请勿用力,因为这可能会移开愈伤组织并损坏样品。相反,请尝试旋转针脚并将其小心地取下。固定后,拔下针脚也可能更容易。
4. 组织学 - 阿尔西安蓝/曙红/橙G染色
注意:阿尔西安蓝/橙色G/曙红染色通常用于可视化软骨(蓝色)和骨骼(粉红色)。软骨面积可以量化为总愈伤组织面积的比例(图2A,B)。
- 将股骨固定在10%中性缓冲福尔马林中,在4°C下过夜。
- 在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤固定样品。
- 将样品置于0.5M EDTA中,pH 8.0在缓慢旋转的摇摇杯上2周。每隔一天更换一次EDTA溶液,以确保有效的脱钙。
注:摇床不需要特定的转速;确保液体在容器中流动以覆盖所有样品。完全脱钙可以通过股骨的X射线进行测试。 - 为了处理用于包埋石蜡的样品,将它们孵育在以下溶液中(每个1小时):70%EtOH,95%EtOH,100%EtOH,100%EtOH,二甲苯,二甲苯,石蜡,石蜡。
- 将样品嵌入石蜡中进行切片。
- 使用切片机切割5-7μm厚的骨折股骨纵向切片。
- 通过将切片在2个二甲苯浴中孵育(每个5分钟)来脱烷蜡。
- 通过在以下乙醇梯度(每个2分钟)中孵育切片来重新水合:100%EtOH,100%EtOH,80%EtOH,70%EtOH。
- 将滑梯放入自来水中1分钟。
- 制作Alcian蓝,酸性醇,铵水和Eosin / Orange G的溶液用于组织学,如 补充文件1中所述。
注意:每种溶液的建议体积应足以完全浸没载玻片进行染色。 - 将载玻片置于酸性酒精中30秒,并在Alcian Blue中孵育40分钟。
- 在流动的水龙头下轻轻清洗,直到水清澈约2分钟。
- 将载玻片在酸性酒精中快速浸渍1秒。
- 按照步骤 4.9 中所述冲洗。
- 在铵水中孵育15秒。
- 按照步骤 4.9 中所述冲洗。
- 置于95%EtOH中1分钟,并在Eosin / Orange G中孵育90秒。
- 在70%EtOH,80%EtOH和100%EtOH中浸渍,快速脱水载玻片。
- 将载玻片置于二甲苯中1分钟以清除载玻片。
- 应用安装介质和盖玻片进行成像。
注意:对于分子分析,可以从愈伤组织中分离RNA和蛋白质。在解剖镜下仔细解剖肌肉,并使用手术刀将愈伤组织与下层骨骼分开。
5. 微细胞核酸
注意:在愈合的后期阶段,可以进行microCT来成像和量化硬愈伤组织和骨折间隙中的矿化。在C57BL / 6J小鼠中,愈伤组织通常在骨折后10天(dpf)后通过microCT矿化和检测(图2C)。
- 将股骨固定在10%中性缓冲福尔马林中,在4°C下过夜。
注意:MicroCT可以在用于组织学的相同股骨上进行,只要在EDTA脱钙之前进行(步骤4.3)。当对两种技术使用相同的股骨时,执行microCT,检索样本并转到步骤4.3。 - 在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤固定样品并储存在70%EtOH中。
- 在55 kVP的能级和145μA的强度下,以7μm的各向同性体素尺寸进行microCT(参见 材料表)。
- 勾勒出 microCT 切片的轮廓,以包括愈伤组织并排除皮质骨。
注意:随着愈伤组织随着时间的推移矿化程度越来越高,可以调整阈值以可视化和测量不同阶段的愈伤组织体积。 - 获得愈伤组织轮廓中包含的骨体积作为愈伤组织体积的测量值。
注意:断裂间隙可以直接在microCT切片上测量为断裂所占据的距离。
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Representative Results
在C57BL / 6J小鼠中,成功的手术完成了前面提到的愈合步骤,几乎没有局部炎症反应或假手术对侧股骨的骨膜受累。术后几小时形成血肿,骨膜被激活以招募骨骼祖细胞进行软骨发育。各种细胞群,如Prx1 + 间充质祖细胞,可以在修复过程中使用市售荧光报告小鼠模型进行追踪(图3)。在骨折后5天(dpf),Alcian Blue染色可用于可视化软愈伤组织,随后量化软骨区域(图2A,B)。通过microCT在28 dpf下可检测到矿化(图2C)。矿化愈伤组织体积、骨折间隙的距离以及通过机械测试测量的骨强度通常用作骨折修复的可量化结果。基因改造或药物干预可以改变恢复过程,因此建议进行时程研究以表征不同修复阶段的骨折。可以解剖整个愈伤组织进行分子分析,并且可以将对侧骨干用作对照。 如果骨折末端未与销钉对齐或未充分固定,则生成的图像将显示骨折部位的所有或一侧没有形成愈伤组织(图4)。
图 1:稳定针的断裂和插入。 (A) C57BL/6J 鼠标右腿上的正方形被剃光。(B)在皮肤和筋膜上做切口后,弯曲的镊子固定在股骨下方,以分离肌肉,皮肤和骨骼。(C)切口后,产生两个骨折末端:股骨的近端部分附着在髋骨上,远端部分附着在膝盖上。导针(绿色)插入远端部分并穿过膝关节。(四)将导针从远端截面取出,插入近端节,推过髋关节。(五)将稳定针(灰针)插入从髋关节突出的导针中。(F)稳定针被推过近端部分,进入远端部分,并使用C中导针形成的路径穿过膝关节 。
(A)在5,10和28 dpf处收集股骨骨折的福尔马林固定石蜡切片,并用Alcian Blue /Eosin/Orange G染色。(B)使用ImageJ软件以5,10和28 dpf定量软骨面积。(C)在28 dpf时观察到矿化,并通过microCT测量愈伤组织体积和裂缝间隙。比例尺 = 1,000 μm。数据显示为 SEM ±平均值。矿化愈伤组织体积是通过在骨折部位的皮质骨周围轮廓测量的。深灰色区域描绘了图像上的矿化愈伤组织,而皮质骨(浅灰色)不包括在测量中。数据显示为“SEM±平均值。请单击此处查看此图的放大版本。
图3:荧光报告基因模型用于可视化骨折后Prx1 + 骨膜细胞的扩张。 Prx1CreER;Rosa26td番茄 小鼠每日注射5天,给予80mg/ kg体重的他莫昔芬诱导tdTomato表达。最后注射后三天,开始股骨骨折,并以7或14 dpf处死小鼠以跟踪表达Prx1的细胞及其后代(Prx1 +)位于骨折愈伤组织内的位置和扩张的骨膜。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4:由于手术问题导致的不规则愈合示例。 在本例中,骨折末端未正确对齐,稳定针刺穿股骨近端部分。这些错误导致股骨形成,其中股骨被刺穿(黄色盒子)而不是在切割部位。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1:组织学所需溶液的组成。请点击此处下载此文件。
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Discussion
该协议中详述的损伤模型包括在自发性骨折愈合期间观察到的所有四个重要步骤,包括(1)随着血肿的形成而引起的促炎反应,(2)骨骼祖细胞从骨膜中募集形成软愈伤组织,(3)成骨细胞矿化愈伤组织,以及(4)破骨细胞重塑骨骼。
本手稿中描述的外科手术针对至少12周大的成年小鼠进行了优化。27 G x 1 1/4 (0.4 mm x 30 mm) 针头用作稳定针,因为它是这个年龄段骨髓腔宽度的理想尺寸。如果需要,如果使用更薄的稳定针,则可以对幼年动物的方案进行修改。稳定针是手术成功的重要组成部分,因为已知不稳定会显着影响骨折愈合16。已经审查了其他稳定方法,所有方法都有其优点和局限性17,18,19。理想的稳定性应根据研究问题和实验目标进行选择。这里描述的稳定性的一个限制是针穿过生长板和关节。如果关节或生长板软骨的贡献值得关注,我们建议考虑另一种稳定方法。
在进行这种手术时,手术技术和动物之间的可变性是一个问题。因此,建议使用充足的数字,特别是对于定量读数,并比较不同组的相似类型的骨折。将股骨部分紧紧地固定在一起以避免超过2 mm的间隙至关重要。各段之间间隙的可变性会极大地影响愈伤组织的大小和修复的时间。这些部分也应正确对齐。松散和未对齐的骨折将导致样本之间更显着的变异性,并可能损害愈合。
负重对于骨骼愈合的时间也至关重要,并且可以在小鼠之间引入变异性。大多数小鼠在手术后几个小时内将体重放在受伤的腿上,但第二天应该正常行走。验证鼠标是否正常移动并且负载均匀分布在两条腿上至关重要,特别是当使用对侧股骨作为假操作的控件时。此外,手术可以引发影响对侧腿的全身性炎症。因此,建议在建立该技术时将假手术的股骨与未手术的小鼠进行比较。对于可量化的结果(例如对RNA或蛋白质表达的影响)而言,具有非手术对照也可能是优选的。
骨折几何形状的一致性可能与其他方法20具有挑战性,但使用锯子可以为外科医生提供更多的控制,并减轻随后骨折的可变性。锯切方法也已成功用于创建小鼠股骨近端的干骺端骨折21。
雄性和雌性小鼠对骨折愈合的反应差异很少被观察到。然而,性别可能成为年龄和药物干预的一个因素,因此强烈建议在合并样本之前比较同性动物或进行统计学以询问性别差异。此外,该协议是为C57BL6 / J小鼠设计的。使用其他小鼠菌株的研究人员应比较雄性和雌性小鼠的愈合情况,以识别任何性别差异。
我们相信这种股骨骨折手术是一种有效的模型,可以概括小鼠的重要愈合步骤,并可用于测试遗传修饰或治疗干预对人类骨折恢复的影响。
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Disclosures
作者没有任何利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢Vicki Rosen博士对该项目的财政支持和指导。我们还要感谢哈佛医学院的兽医和IACUC工作人员就无菌技术,动物福祉以及用于开发该协议的材料进行咨询。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
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