Summary

Fluorescence interphasique hybridation in situ des frottis de moelle osseuse du myélome multiple

Published: April 15, 2022
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Summary

Nous présentons ici un protocole pour améliorer le succès de la détection de l’hybridation in situ par fluorescence interphasique sur les frottis de moelle osseuse de patients atteints de myélome multiple.

Abstract

La détection de l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une méthode indispensable dans la stratification du risque génétique dans le myélome multiple (MM), qui est l’une des tumeurs malignes hématologiques les plus courantes. La caractéristique d’identification du MM est l’accumulation de plasmocytes malins dans la moelle osseuse. Les rapports FISH pour MM se concentrent principalement sur les plasmocytes clonaux purifiés ou identifiés, plutôt que sur toutes les cellules nucléées, en triant avec des billes magnétiques anti-CD138 ou en marquant avec une chaîne légère d’immunoglobuline cytoplasmique κ ou λ. Les noyaux interphasiques de la moelle osseuse sont généralement obtenus à partir de cellules fraîches de la moelle osseuse. Cependant, un enrichissement satisfaisant des échantillons de plasmocytes nécessite de grandes quantités de moelle osseuse fraîche anti-coagulée à l’héparine, ce qui ne peut être obtenu en cas d’extraction difficile de la moelle osseuse ou d’un robinet sec de moelle osseuse. Ici, nous établissons une nouvelle méthode pour améliorer le succès de la détection de FISH sur les frottis de moelle osseuse colorés ou non colorés. Les frottis de moelle osseuse sont plus faciles à obtenir que les échantillons de moelle osseuse anticoagulés.

Introduction

Le myélome multiple (MM) est une maladie maligne à plasmocytes (PC) avec une forte hétérogénéité biologique et de grandes différences individuelles dans l’efficacité clinique, avec des périodes de survie allant de mois à des décennies. Les caractéristiques cytogénétiques sont des indicateurs pronostiques importants de la MM. Le système de stratification des risques et les traitements individualisés basés sur les caractéristiques génétiques sont devenus des sujets d’intérêt intense dans la recherche clinique sur le MM1. Les aberrations des PC testés dans un panel d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) de moelle osseuse (BM) comprennent del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) gain/amplification et 1p (CDKN2C).

La cytogénétique métaphasique standard doit être incluse dans l’évaluation initiale des patients atteints de MM. Bien que le caryotypage conventionnel à bande G offre l’avantage d’une analyse chromosomique entière, le faible rendement de cette méthode conduit à de nombreux résultats faussement négatifs2. Traditionnellement, les PC ont été considérés comme largement incapables de se diviser parce qu’ils sont les produits finaux de la différenciation des lymphocytes B. Cela rend difficile l’obtention d’images fractionnées. L’amélioration de l’analyse cytogénétique dans la MM avec des cultures à long terme (6 jours) et la stimulation des cultures par des cytokines peuvent être une méthode prometteuse pour identifier les anomalies cytogénétiques chez les patients atteints de MM nouvellement diagnostiqués3. Même lorsque le temps de culture a été prolongé à 6 jours, cependant, des anomalies cytogénétiques ont été rapportées avec précision chez 30% à 50% des patients atteints de MM4. De plus, le MM est caractérisé par des aberrations cytogénétiques complexes qui reflètent son hétérogénéité pronostique. Cependant, la résolution de la technologie traditionnelle de bandes chromosomiques est faible, ce qui peut facilement conduire à une détection manquée d’anomalies chromosomiques dans le MM.

Le FISH interphasé, de préférence après tri ou marquage à base de billes magnétiques CD138 positif à base de billes magnétiques avec une chaîne légère d’immunoglobuline cytoplasmique κ/λ, est indispensable dans l’analyse de MM5,6. Un échantillon sélectionné CD138 positif est fortement recommandé pour le rendement optimisé des cellules tumorales. Cependant, une quantification précise des aberrations cytogénétiques nécessite au moins 4 mL de BM anticoagulé pour le tri PC. De plus, les combinaisons de tri immunomagnétique de billes CD138 avec FISH ou d’immunoglobuline cytoplasmique à chaîne légère κ/λ avec test FISH (cIg-FISH) augmentent de nombreux coûts expérimentaux et prennent beaucoup de temps.

Habituellement, le rapport PC est d’abord évalué à partir de l’examen morphologique des frottis BM colorés ou des sections de biopsie BM7,8. Les échantillons BM de la plus haute qualité (premiers échantillons d’aspiration de moelle) sont utilisés pour les tests morphologiques, tandis que ceux envoyés pour FISH ou autre détection sont souvent les échantillons d’aspiration secondaire avec des rapports élevés de dilution avec le sang périphérique.

Dès les années 1990, de nombreuses études ont montré que les frottis de BM peuvent être directement utilisés pour les examens interstitiels FISH, ce qui s’est avéré être une méthode fiable et reproductible9. Une étude élégante basée sur la morphologie cellulaire et la cytochimie de l’estérase combinée à FISH de sang périphérique et à des frottis de BM a confirmé sa grande importance clinique pour élucider les anomalies chromosomiques chez les patients atteints de leucémie granulocytaire et lymphocytaire10.

Ici, nous fournissons une nouvelle méthode pour améliorer le succès de la détection interphasée fish chez les patients MM.

Protocol

Cette étude a été menée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan (n° 2019065). Les échantillons ont été prélevés sur un patient MM du département d’hématologie de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan (Chine). 1. Préparation des frottis BM Placez les premiers 0,2 mL de solution BM sur une lame de verre jetable propre. …

Representative Results

Lors de l’évaluation morphologique initiale d’un patient atteint de MM nouvellement diagnostiqué, 15 % des PC d’un frottis de BM présentaient des noyaux plus gros et plus sombres ainsi que de plus grandes quantités de cytoplasme que les PC normaux (Figure 2A). Le premier tube de BM anti-coagulé à l’héparine détecté par la technique de l’immunophénotype n’a révélé que 2,3% des PC aberrants monoclonaux. Le tri immunomagnétique des billes CD138 en combinaison avec FISH…

Discussion

L’application de FISH à la stratification des risques génétiques dans le MM est essentielle. La partie critique des rapports FISH n’est pas toutes les cellules nucléées, mais les PC clonaux spécifiquement purifiés ou identifiés par tri avec des billes magnétiques anti-CD138 ou marquage avec une chaîne légère d’immunoglobuline cytoplasmique κ ou λ. L’interphase FISH après le tri PC ou cIg-FISH s’est avérée significative dans le diagnostic de MM en raison de la proportion relativement plus faible…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce projet a été soutenu par le Fonds d’innovation de WNLO 2018WNLOKF023.

Materials

automatic FISH machine Leica  Corporation S500-24 FINAL Assy Thermobrite 240V
DAPI Abbott Molecular Inc. 06J49-001 DAPI Counterstain
FISH Analysis Software IMSTAR  Corporation IMSTAR FISH Analysis Software
FISH Probe Abbott Molecular Inc. 05N56-020 Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit
Fixed volume pipette Eppendorf China Ltd. M33768H 10  microliter
Fluorescence Microscope Olympus Corporation BX53 Forward Fluorescence Microscope
Karyotype Analysis Software IMSTAR  Corporation IMSTAR Karyotype Analysis Software
Light Microscope Olympus  Corporation BX41 Forward Light Microscope
NP-40 Abbott Molecular Inc. 07J05-001 NP-40
Plastic staining dyeing rack Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. RSJ-501  24 slides
Plastic staining dyeing tank Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. RSJ-516  24 slides
Rubber Cement Marabu GmbH & Co. KG FixoGum  Rubber Cement
SSC Abbott Molecular Inc. 02J10-032 20×SSC
Water bath Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. DK-8D Multiple Temperature Water bath

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Cite This Article
Yu, Y., Shen, H., Liu, L., Luo, P., Wu, S., He, J., Tong, X., Shang, Y., Shao, L., Zhou, F. Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma. J. Vis. Exp. (182), e63083, doi:10.3791/63083 (2022).

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