Summary
यह प्रोटोकॉल टेप विधि को रेखांकित करता है कि अलग-अलग गहराई के एफएफपीई दाता ब्लॉकों का उपयोग करके मैन्युअल रूप से एक ऊतक माइक्रोएरे का निर्माण कैसे किया जाए।
Abstract
ऊतक माइक्रोएरे (टीएमए) एक महत्वपूर्ण शोध उपकरण है जिसमें कई फॉर्मेलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) नमूनों को एक एकल पैराफिन ब्लॉक में दर्शाया जा सकता है। यह विभिन्न दाता एफएफपीई ब्लॉकों के हित के क्षेत्र से निकाले गए ऊतक कोर का उपयोग करके और उन्हें एक एकल टीएमए पैराफिन ब्लॉक में व्यवस्थित करके प्राप्त किया जाता है। एक बार निर्माण के बाद, पूर्ण टीएमए के वर्गों का उपयोग इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री, क्रोमोजेनिक, प्रतिदीप्ति इन सीटू संकरण (फिश) और आरएनए आईएसएच अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है ताकि प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ-साथ कई नमूनों में जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का आकलन किया जा सके, इस प्रकार ऊतक के उपयोग को कम किया जा सके और अभिकर्मक लागत को कम किया जा सके। कई अलग-अलग टीएमए निर्माण तकनीकें हैं। सबसे आम निर्माण विधियों में से एक प्राप्तकर्ता विधि है, जो उसी लंबाई के कोर के साथ सबसे अच्छा काम करती है जिसके लिए 4 मिमी की न्यूनतम लंबाई की सिफारिश की जाती है। दुर्भाग्य से, नैदानिक प्रक्रिया के दौरान ऊतक ब्लॉकों को भारी उच्छेदन किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर 4 मिमी से कम की "गैर-आदर्श" दाता ब्लॉक मोटाई होती है। वर्तमान लेख और वीडियो डबल-साइडेड चिपकने वाला टेप विधि पर ध्यान केंद्रित करते हैं; एक वैकल्पिक मैनुअल, कम लागत, उपयोग करने में आसान, और कम घनत्व (<50 कोर) टीएमए का निर्माण करने के लिए तेजी से विधि जो इन गैर-आदर्श दाता ब्लॉकों के साथ अत्यधिक संगत है। यह प्रोटोकॉल इस विधि का उपयोग करके टीएमए का निर्माण करने के तरीके पर एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करता है, जिसमें पैथोलॉजिकल समीक्षा और निर्माण के बाद सत्यापन के महत्वपूर्ण महत्व पर ध्यान केंद्रित किया जाता है।
Introduction
फॉर्मेलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतकों का उपयोग रूपात्मक और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रोटीन अभिव्यक्तिअध्ययनों में बड़े पैमाने पर किया जाता है। हालांकि, खोज अनुसंधान के लिए अक्सर बड़ी संख्या में ऊतकों पर कई मार्करों की परीक्षा की आवश्यकता होती है, जो कीमती ऊतकों को समाप्त कर सकते हैं। 1 9 80 के दशक में पेश किया गया, ऊतक माइक्रोएरे (टीएमए) एक महत्वपूर्ण शोध उपकरण है जो कई अलग-अलग एफएफपीई ऊतक ब्लॉकों से ब्याज के छोटे अनुकरणीय क्षेत्रों को एक ही पैराफिन ब्लॉक में इकट्ठा करता है, जिससे कई ऊतक नमूनों की एक साथ परीक्षा की अनुमति मिलतीहै। इस प्रकार, टीएमए अत्यधिक कीमती, और अक्सर दुर्लभ, ऊतक के नमूनों के अत्यधिक उपयोग से बचते हैं, जबकि कई व्यक्तिगत नमूनों पर डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के प्रदर्शन से जुड़ी लागतों को भी कम करते हैं।
टीएमए 5 के निर्माण के लिए कई अलग-अलग तकनीकें मौजूदहैं, जिनमें स्वचालित और अर्ध-मैनुअल दृष्टिकोण 6,7 शामिल हैं। इनमें से अधिकांश बाद के दृष्टिकोण प्राप्तकर्ता विधि का उपयोग करते हैं, जिसमें दाता ब्लॉकों से छिद्रित ऊतक कोर को प्रीकास्ट मोल्ड में डाला जाता है। हालांकि, यह अनुशंसा की जाती है कि "आदर्श" दाता ब्लॉक जो कम से कम 4 मिमी मोटे होते हैं, उनका उपयोग इस विधि 6,7 के लिए किया जाता है। दुर्भाग्य से, दाता ब्लॉक, विशेष रूप से वे जो अनुसंधान के लिए उपलब्ध कराए जाने से पहले नैदानिक नैदानिक उद्देश्यों के लिए बड़े पैमाने पर विभाजित किए गए हैं, अक्सर 4 मिमी से कम मोटे होते हैं, जो उन्हें प्राप्तकर्ता विधि का उपयोग करके टीएमए निर्माण में उपयोग से बाहर कर सकते हैं, यदि 4 मिमी की गहराई प्राप्त करने के लिए फिर से एम्बेड करना संभव या वांछनीय नहीं है। इसके अलावा, ये प्रक्रियाएं अक्सर एक बेंचटॉप मैनुअल ऊतक माइक्रोएरेयर या महंगे स्वचालित उपकरणों का उपयोग कर सकती हैं जो औसत अनुसंधान प्रयोगशाला के लिए आसानी से सुलभ या सस्ती नहीं हैं। इसके विपरीत, डबल-साइडेड चिपकने वाला टेप विधि या टेप विधि, एक मैनुअल टीएमए निर्माण विधि है जो गैर-आदर्श दाता ब्लॉकों के साथ संगत है जो सस्ती, व्यापक रूप से उपलब्ध, पुन: प्रयोज्य या डिस्पोजेबल हाथ से आयोजित ऊतक माइक्रोएरेयर 8,9,10 का उपयोग करती है। यह विधि उल्टे सीधे कोर के चारों ओर ब्लॉक कास्टिंग द्वारा निर्माण प्रक्रिया को उलट देती है जो पूरा होने पर कोर लंबाई के बावजूद टीएमए के शीर्ष के साथ फ्लश होती है। नतीजतन, सभी नमूने टीएमए वर्गों में मौजूद होते हैं जब पहली बार विभाजित किया जाता है, जो कन्स्ट्रक्टर को शुरुआत से ही इन गैर-आदर्श ब्लॉकों में से सबसे अधिक प्राप्त करने की अनुमति देता है। इस प्रकार, टेप विधि गैर-विशेष अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए एक लागत प्रभावी और व्यवहार्य विकल्प का प्रतिनिधित्व करती है।
टीएमए निर्माण इसकी चुनौतियों के बिना नहीं है, और कोर निकालने के लिए ऊतक क्षेत्रों का चयन करते समय सावधानी बरती जानी चाहिए, जिससे पैथोलॉजिकल समीक्षा टीएमए निर्माण प्रक्रिया11,12 का एक महत्वपूर्ण हिस्सा बन जाती है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य टीएमए निर्माण से जुड़े कुछ पैथोलॉजिकल नुकसानों को उजागर करके टीएमए निर्माण में पैथोलॉजिकल समीक्षा के गहन महत्व को रेखांकित करना है जो टीएमए का निर्माण और उपयोग करने वाले व्यक्तियों को पता होना चाहिए, और क्यों पैथोलॉजी समीक्षा को टीएमए ब्लॉक के जीवनकाल के माध्यम से जारी रखना चाहिए।
यह प्रोटोकॉल एड्स और कैंसर नमूना संसाधन (ACSR) तकनीकी कोर प्रयोगशाला में उठाए गए कदमों को रेखांकित करता है ताकि टेप विधि का उपयोग करके गैर-आदर्श दाता ब्लॉकों से टीएमए का निर्माण किया जा सके; जहां ACSR एक एनआईएच वित्त पोषित biorepository एचआईवी कैंसर के ऊतकों से biospecimens के संग्रह और न्यायसंगत वितरण के लिए समर्पित है ताकि एचआईवी दुर्दमता अनुसंधान को बढ़ावा देने के लिए।
Protocol
सभी दाता ब्लॉकों को संग्रह के दौरान पहचाना गया था और अनुमोदित मेयो क्लिनिक आईआरबी प्रोटोकॉल (PR16-000507 और PR2207-02) के अनुपालन में टीएमए निर्माण के लिए उपयोग किया गया था।
1. पैथोलॉजी की समीक्षा
- टीएमए निर्माण में उपयोग किए जाने वाले एफएफपीई ऊतक दाता ब्लॉकों को पुनः प्राप्त करें।
- निदान की पुष्टि करने और ऊतक को एनोटेट करने के लिए बोर्ड-प्रमाणित रोगविज्ञानी द्वारा हिस्टोलॉजिकल समीक्षा के लिए चुने गए प्रत्येक एफएफपीई ऊतक दाता ब्लॉक के लिए एक ताजा उत्पन्न हेमाटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) सना हुआ स्लाइड13 प्रस्तुत करें।
नोट: एच एंड ई धुंधला घर में प्रदर्शन किया जा सकता है या धुंधला करने के लिए एक पैथोलॉजिकल कोर सेवा प्रयोगशाला में भेजा जा सकता है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में मामला था। टीएमए का निर्माण करते समय याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण अवधारणाओं में से एक यह है कि एफएफपीई दाता ब्लॉकों में ऊतक 3-आयामी (3 डी) संरचनाएं हैं जिनके आकार, ट्यूमर सामग्री और ऊतक व्यवहार्यता ब्लॉक गहराई में वृद्धि के साथ काफी बदल सकते हैं। रोगविज्ञानी को एच एंड ई दाग ऊतक अनुभाग की समीक्षा के आधार पर निर्धारित करना चाहिए, जो 3 डी ऊतक का 2-आयामी प्रतिनिधित्व है, ऊतक कोर को निकालने के लिए सबसे अच्छा क्षेत्र है। - हिस्टोलॉजिकल समीक्षा के दौरान, सुनिश्चित करें कि रोगविज्ञानी एच एंड ई दाग स्लाइड पर ब्याज के ऊतकों / ब्याज के ऊतकों की पहचान करता है और एनोटेट करता है। स्लाइड को एनोटेट करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें.
- ब्याज के ऊतक को घेरने के लिए स्लाइड मार्किंग पेन का उपयोग करें।
- एक ही अंकन पेन का उपयोग करके, सर्कल किए गए क्षेत्र के भीतर के क्षेत्रों को धब्बा करें जिनसे बचा जाना चाहिए।
- कोर नमूनाकरण और निष्कर्षण के लिए आदर्श माने जाने वाले क्षेत्रों को चिह्नित करने के लिए मार्किंग पेन का उपयोग करें।
नोट: यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि ऊतक आकार और संरचना ब्लॉक में ऊतक की गहराई के साथ बदल सकती है। इस प्रकार, ऊतक कोर की संरचना इस बात पर निर्भर करती है कि कोर कहां निकाला गया था, जो निरंतर पैथोलॉजिकल मार्गदर्शन की आवश्यकता पर जोर देता है। - रोग की समीक्षा में सहायता करने के लिए एच एंड ई के साथ रोग विशिष्ट इम्युनोहिस्टोकेमिकल दाग के लिए अतिरिक्त ऊतक प्रस्तुत करें, यदि आवश्यक हो, तो। इस तरह के दाग के उदाहरणों में HER2 सकारात्मक स्तन कैंसर14 के लिए ERBB2 धुंधला, कपोसी सार्कोमा15 के लिए HHV-8, बी-सेल लिंफोमा16 के लिए CD20, आरएनए गुणवत्ता17 के लिए वैश्विक मार्कर के रूप में U6, Epstein-Barr वायरस सकारात्मकता18 निर्धारित करने के लिए EBER, और मेसेनकाइमल मूल और ऊतक गुणवत्ता नियंत्रण मार्कर19,20 की पुष्टि के रूप में विमेंटिन शामिल हैं।
2. टीएमए निर्माण के लिए तैयारी
- एक बार पैथोलॉजी समीक्षा पूरी हो जाने के बाद, टीएमए निर्माण में उपयोग किए जाने वाले दाता ब्लॉकों की अंतिम सूची संकलित करें और एक टीएमए मानचित्र (चित्रा 1 ए) बनाएं। टीएमए मानचित्र एक योजनाबद्ध रूपरेखा है जहां कोर पूर्ण टीएमए में स्थित होंगे और परिणामी टीएमए से प्राप्त माउंटेड ऊतक नमूनों को स्लाइड करेंगे।
- अभिविन्यास उद्देश्यों के लिए, सुनिश्चित करें कि टीएमए मानचित्र 3 x 3 या 4 x 4 मैट्रिक्स जैसे एक सम मैट्रिक्स में कोर रखने से बचता है और इसमें कम से कम 1 अभिविन्यास मार्कर शामिल है।
नोट: अभिविन्यास कोर ऊतक मुक्त रंगीन अभिविन्यास उपकरण21, या टीएमए के विषय से स्पष्ट रूप से अलग ऊतकों वाले ऊतक ब्लॉकों से लिए गए कोर हो सकते हैं। प्राप्तकर्ता विधि के विपरीत जहां ईमानदार कोर को एक पूर्व-कास्ट मोम मोल्ड में डाला जाता है, टेप विधि उल्टे, खड़े कोर के चारों ओर पिघले हुए मोम डालकर एक टीएमए बनाती है। निर्माण प्रक्रिया के इस व्युत्क्रम के लिए एक दूसरे मानचित्र की आवश्यकता होती है जिसे निर्माण मानचित्र के रूप में जाना जाता है। - TMA मानचित्र (चित्रा 1B) की दर्पण छवि बनाकर निर्माण मानचित्र बनाएँ। निर्माण मानचित्र से पता चलता है कि पूर्ण टीएमए में सही स्थान पर दिखाई देने के लिए निर्माण के दौरान प्रत्येक कोर को कहां रखा जाना चाहिए। निर्माण मानचित्र सहेजें.
- एक बार मानचित्र बनाए जाने के बाद, धातु टीएमए बेस मोल्ड तैयार करें। कोर प्लेसमेंट का मार्गदर्शन करने और कोर पृथक्करण को विनियमित करने के लिए डिस्पोजेबल पेपर चेकर ग्रिड का उपयोग करें।
नोट: 26 मिमी x 20 मिमी के आंतरिक आयामों के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धातु आधार मोल्ड्स के साथ उपयोग के लिए 40 कोर (प्लस दो अभिविन्यास कोर / अंतराल के लिए) की अधिकतम के लिए एक 6 x 7 (42 स्पॉट) टेम्पलेट ग्रिड पूरक पीडीएफ में प्रदान किया गया है। प्रिंट और कागज ग्रिड को काटें। - चेकर्ड ग्रिड को आकार में काटें और ग्रिड के पीछे डबल-साइडेड स्टिक टेप (DSST) का एक टुकड़ा चिपकाएं। ग्रिड और DSST टेप धातु ट्रे में जगह और ग्रिड के शीर्ष पर DSST का एक दूसरा टुकड़ा जोड़ें, यानी, धातु आधार मोल्ड (चित्रा 2A) में कागज ग्रिड के शीर्ष पर।
3. कोर प्लेसमेंट
- पैथोलॉजिकल रूप से समीक्षा किए गए एच एंड ई को अपने संबंधित ऊतक ब्लॉक पर ओवरले करें और यह पहचानने के लिए पैथोलॉजिस्ट चिह्नों का उपयोग करें कि ऊतक ब्लॉक को कहां छिद्रित किया जाना है (चित्रा 2 बी)।
- उचित स्थान पर एक मैनुअल कोर पंच (चित्रा 2 सी) का उपयोग करके एफएफपीई दाता ब्लॉक को पंच करें।
नोट: कोर घूंसे व्यास की एक किस्म में उपलब्ध हैं। यह विधि एक 2 मिमी व्यास हैंडहेल्ड कोर पंच को नियोजित करती है।- यदि पुन: प्रयोज्य कोर पंच का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि इसे प्रत्येक ऊतक पंच से पहले और बाद में साफ किया जाता है।
- कोर पंच से कोर को बाहर निकालें और DSST कवर ग्रिड (चित्रा 2 डी) के crosshairs पर निकाले गए कोर को रखने के लिए एक सुई पिक का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि जब कोर को ग्रिड पर रखा जाता है, तो यह उलटा और सीधा होता है जैसे कि कोर का ऊतक अंत डीएसएसटी (ऊतक-फेस-डाउन) से संपर्क करता है। यह भी सुनिश्चित करें कि कोर को ग्रिड पर उचित स्थिति में रखा गया है जैसा कि निर्माण मानचित्र द्वारा दर्शाया गया है।
- तब तक दोहराएं जब तक कि सभी दाता ब्लॉकों को कोर नहीं किया जाता है और कोर को उनके उपयुक्त पदों पर रखा जाता है।
4. TMA को पूरा करना
- बेंच-टॉप ओवन को चालू करें, 78 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, और तापमान तक पहुंचने के लिए पर्याप्त समय दें।
- प्रत्येक टीएमए के निर्माण के लिए, एक ओवन-प्रूफ कंटेनर में पैराफिन छर्रों के 45 ग्राम पिघलाएं।
- एक प्लास्टिक कैसेट लेबल करें और इसे कोर (चित्रा 2 ई) वाले धातु बेस मोल्ड के शीर्ष पर रखें। कोर की ऊंचाई धातु ट्रे की गहराई से अधिक नहीं होनी चाहिए क्योंकि कैसेट को जगह में रखे जाने पर लंबे कोर को झुकाया या गिरा दिया जाएगा।
- ओवरफ्लो को पकड़ने के लिए एक ट्रे पर कैसेट के साथ मोल्ड रखें और धीरे से कैसेट के माध्यम से पिघले हुए पैराफिन को कोर की ट्रे में डालें (चित्रा 2 एफ)।
- पिघले हुए पैराफिन को ओवरफ्लो करने की अनुमति दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि टीएमए के शरीर में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं। सुनिश्चित करें कि पैराफिन कैसेट के शीर्ष पर भरता है ताकि पैराफिन को ठोस होने के बाद पैराफिन ब्लॉक में एम्बेडेड और दृढ़ता से बाध्य किया जा सके।
- ब्लॉक को स्थानांतरित या परेशान न करें और इसे 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करने की अनुमति दें। फिर, पूरी तरह से ठोस करने के लिए अतिरिक्त 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रशीतित करें।
- एक बार पूरी तरह से ठोस होने के बाद, धीरे से कोर के कैसेट बाउंड पैराफिन ब्लॉक से धातु बेस मोल्ड को अलग करें।
नोट: DSST निर्माण प्रक्रिया के माध्यम से अपनी चिपकने की क्षमता को बनाए रखता है और अक्सर नवगठित पैराफिन ब्लॉक से जुड़ा होता है। यदि लागू हो, तो धीरे से DSST और ग्रिड को अब पूरा TMA ब्लॉक के शीर्ष से निकालें।
5. टीएमए मान्य करना
- एक बार जब टीएमए का निर्माण हो जाता है, तो नए पूर्ण टीएमए को अनुभाग करने के लिए एक माइक्रोटोम का उपयोग करें। एक या अधिक पूर्ण-चेहरे वाले ऊतक अनुभाग को काटें।
- अनुभागों को पूर्व-सशस्त्र जल स्नान में स्थानांतरित करें और अनुभागों को स्लाइड माउंट करें।
नोट: नवनिर्मित ब्लॉकों को अक्सर ब्लॉक फेसिंग (अतिरिक्त पैराफिन को काटने) की आवश्यकता होती है ताकि पूर्ण चेहरे के ऊतक वर्गों को प्राप्त किया जा सके जिसमें सभी कोर होते हैं। - एक बार सूखने के बाद, एच एंड ई धुंधला13 और किसी भी अतिरिक्त इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग के लिए एक ताजा कट स्लाइड-माउंटेड टीएमए अनुभाग सबमिट करें, यदि आवश्यक हो।
- पैथोलॉजिकल समीक्षा के लिए दाग टीएमए एच एंड ई अनुभागों को सबमिट करें।
नोट: टीएमए पैथोलॉजी समीक्षा के दौरान, एक बोर्ड-प्रमाणित रोगविज्ञानी, अधिमानतः एक ही रोगविज्ञानी जिसने टीएमए दाता ब्लॉकों की समीक्षा की, यह सुनिश्चित करने के लिए टीएमए एच एंड ई दाग कोर की समीक्षा करता है कि ब्याज के वांछित ऊतक वास्तव में मौजूद हैं। यदि चरण 1.3.4 में दाता ब्लॉक की समीक्षा के लिए किसी भी अतिरिक्त ऊतक या रोग-विशिष्ट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल दाग प्रस्तुत किए गए थे, तो इन दागों को टीएमए वर्गों पर दोहराया जाना चाहिए और पैथोलॉजिकल समीक्षा के लिए टीएमए एच एंड ई के साथ प्रस्तुत किया जाना चाहिए। - TMA पैथोलॉजिकल सत्यापन समीक्षा के परिणामों को रिकॉर्ड करें।
Representative Results
यहां वर्णित टीएमए निर्माण की टेप विधि ऊतकों के संरक्षण के लिए एसीएसआर तकनीकी कोर प्रयोगशाला में नियोजित पसंद की विधि है, जो बदले में शोधकर्ताओं को अत्यधिक कीमती ऊतकों के मितव्ययी और न्यायसंगत वितरण की अनुमति देती है।
निर्माण प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक किसी दिए गए दाता ब्लॉक में ब्याज के ऊतक की पहचान करना है जहां से टीएमए कोर प्राप्त किया जाना चाहिए। यह पैथोलॉजिकल समीक्षा द्वारा निर्धारित किया जाता है जिसमें एक प्रशिक्षित रोगविज्ञानी एक ताजा उत्पन्न एच एंड ई स्लाइड (चित्रा 3) की समीक्षा करता है। एक मार्कर का उपयोग करते हुए, रोगविज्ञानी एच एंड ई स्लाइड पर क्षेत्र को घेरता है, जो इंगित करता है कि कोर को इस सर्कल के अंदर दाता ब्लॉक से प्राप्त किया जाना चाहिए (चित्रा 3)। रोगविज्ञानी अतिरिक्त क्षेत्रों को भी चिह्नित कर सकता है जैसे कि परिगलित क्षेत्रों, जिनसे बचा जाना चाहिए, या सौम्य क्षेत्रों से जहां से अतिरिक्त ऊतक कोर प्राप्त किए जा सकते हैं (चित्रा 3)। कोर को तब संकेतित क्षेत्रों से छिद्रित किया जाता है और टीएमए के निर्माण में शामिल किया जाता है।
टेप विधि द्वारा एक टीएमए के सफल समापन के लिए दो प्रमुख मीट्रिक हैं। पहला एक दूसरे के अलावा अपेक्षित पदों और दूरी पर ऊतक कोर डॉट्स की उपस्थिति है, जिसका मूल्यांकन दृश्य निरीक्षण द्वारा किया जाता है। चित्रा 4A, B दो सफलतापूर्वक पूरी तरह से टेप विधि TMAs और उनके संबंधित H & E स्लाइड को दर्शाता है। टीएमए ब्लॉकों के दृश्य निरीक्षण से पता चलता है कि कोर मौजूद हैं और प्रत्येक टीएमए में नियमित रूप से स्थान रखते हैं। टेप विधि निर्माण प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न होने वाले कुछ प्रमुख निर्माण मुद्दों में मोम ठोसीकरण (चित्रा 4 सी) से पहले धातु के आधार को समय से पहले हटाने के कारण ब्लॉक और कैसेट का पृथक्करण शामिल है। टेप विधि निर्मित टीएमए के साथ मनाया जाने वाला एक और संभावित मुद्दा कोर टॉपलिंग और या एम्बेडेड कोर (चित्रा 4 डी) के प्लेसमेंट बहाव है; एक मुद्दा जो पिघले हुए पैराफिन के अत्यधिक अशांत डालने से उत्पन्न हो सकता है, जिसे खराब चिपकने वाले डीएसएसटी द्वारा आगे बढ़ाया जा सकता है। चित्रा 5 TMA1 के कोर के लिए H & E छवियों को दर्शाता है। सभी लेकिन एक कोर (स्पॉट 1) TMA1 के H & E में मौजूद है। चित्रा 5 से यह भी पता चलता है कि कुछ कोर पूर्ण परिपत्र ऊतक बिंदुओं (यानी, स्पॉट 4, 6, 13, 17) के रूप में मौजूद हैं, जबकि अन्य पूरी तरह से मौजूद नहीं हैं (यानी, स्पॉट 3, 8, 9, 12)। इन बाद के मामलों में अनुभव किया गया ऊतक हानि असामान्य नहीं है और सभी कोर को पूर्ण रूप से प्रकट करने के लिए आवश्यक अपर्याप्त सेक्शनिंग के कारण हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, अपूर्ण की उपस्थिति, या ऊतक की कुल अनुपस्थिति (यानी, स्पॉट 1), उस कोर की खराब ऊतक गुणवत्ता से स्टेम हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप धुंधला प्रक्रिया के दौरान ऊतक हानि हो सकती है।
सफलता के दूसरे मीट्रिक का मूल्यांकन इस संदर्भ में किया जाता है कि टीएमए कोर ने ब्याज के ऊतकों पर कब्जा कर लिया है या नहीं। यह पैथोलॉजिकल समीक्षा और व्यक्तिगत टीएमए एच एंड ई कोर (चित्रा 5) के सत्यापन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है, जो पूर्व-छिद्रित दाता ब्लॉक एच एंड ई (चित्रा 3) की तुलना में होता है, और जहां आवश्यक / प्रदर्शन किया जाता है किसी भी अन्य अतिरिक्त इम्यूनोहिस्टोकेमिकल दाग। चित्रा 6 TMA1 पर किए गए अनुकरणीय दागों को दर्शाता है, जिसमें विमेंटिन, U6, EBER और CD20 शामिल हैं। विमेंटिन सकारात्मक ऊतक (भूरे रंग के दाग) से संकेत मिलता है कि सभी ऊतक मेसेनकाइमल मूल के होते हैं और अच्छी गुणवत्ता वाले होते हैं जिन्हें दाग दिया जा सकता है। U6 सकारात्मकता (गहरे बैंगनी / नीले रंग का दाग) इंगित करता है कि ऊतक में आरएनए गुणवत्ता अच्छी है और ईबीईआर जैसे सीटू संकरण (आईएसएच) दाग में आरएनए की प्रशंसा करती है, जो जीन टेपों को लक्षित करती है। चित्रा 5 में U6 परिणाम इंगित करते हैं कि आरएनए की गुणवत्ता लिम्फोमा ऊतक (स्पॉट 9) और सामान्य टॉन्सिल ऊतक अभिविन्यास नियंत्रण (स्पॉट 22) में उच्च है, लेकिन स्पॉट 19 पर सामान्य ऊतक में नहीं। इस EBER धुंधला से निम्नलिखित सामान्य ऊतक और अभिविन्यास नियंत्रण में नकारात्मक था, लेकिन लिम्फोमा ऊतक (स्पॉट 9) में दृढ़ता से सकारात्मक था। जैसा कि लिम्फोइड मूल के ऊतकों के लिए अपेक्षित था, दोनों स्पॉट 9 और 22 बी-सेल मार्कर सीडी 20 के लिए सकारात्मक थे, लेकिन स्पॉट 19, जो सामान्य रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से उपजा है, ने नहीं किया। सभी टीएमए कोर के लिए धुंधला परिणाम तालिका 1 में संक्षेप में दिए गए हैं और इन टीएमए ऊतक कोर के लिए ऊतक एनोटेशन की पुष्टि करते हैं।
चित्रा 1: TMA नक्शे. एक बार जब सभी एफएफपीई ब्लॉक और अभिविन्यास नियंत्रणों का चयन किया जाता है, तो एक विस्तृत मानचित्र, जिसे टीएमए मानचित्र (ए) के रूप में जाना जाता है, यह रेखांकित करता है कि प्रत्येक दाता ब्लॉक कोर तैयार ब्लॉक में कहां स्थित होगा, बनाया गया है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टेप विधि का उपयोग करके एक टीएमए का निर्माण करते समय, निर्माण मानचित्र (बी) टीएमए मानचित्र की एक दर्पण छवि है क्योंकि यह विधि निर्माण प्रक्रिया को उलट देती है, कोर को प्रीकास्ट मोल्ड में डालने के बजाय सीधे ऊतक कोर के चारों ओर पिघला हुआ पैराफिन डालती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: टेप विधि का उपयोग करके टीएमए का निर्माण करना। (ए) परत 2 डबल-साइडेड स्टिक टेप (डीएसएसटी) के टुकड़े और धातु आधार मोल्ड के नीचे अनुवर्ती क्रम में एक पेपर ग्रिड; DSST (2A सम्मिलित करें) का पहला टुकड़ा रखें, डिस्पोजेबल पेपर ग्रिड के बाद, और फिर धातु आधार मोल्ड के नीचे DSST का दूसरा टुकड़ा। (बी) प्रत्येक दाता ब्लॉक के लिए, एक नया एच एंड ई एक रोगविज्ञानी द्वारा उत्पन्न और समीक्षा की जाती है जो एच एंड ई को ब्याज के ऊतक को निरूपित करने के लिए चिह्नित करता है, जहां ब्लॉक को पंच करना है और यदि लागू होता है तो ऊतक कोर को निकालने के लिए छिद्रण से कहां बचना है। (सी) एक निपटान या पुन: प्रयोज्य हैंडहेल्ड टीएमए पंच के साथ दाता ब्लॉक पंच पंच। (डी) एक सुई लेने का उपयोग करते हुए, प्रत्येक कोर को सीधे खड़े रखा जाता है, ग्रिड को कवर करने वाले डीएसएसटी पर ट्यूमर का सामना करना पड़ता है। (ई) ध्यान से धातु ट्रे के शीर्ष पर एक पूर्व-लेबल प्लास्टिक कैसेट रखें जिसमें सीधे कोर होते हैं। (एफ) पिघले हुए पैराफिन को धीरे से कैसेट जाली के माध्यम से ट्रे में डाला जाता है ताकि कैसेट के नीचे सीधे कोर को घेर सकें और डुबो सकें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: दाता ब्लॉक एच एंड ई दाग. प्रत्येक दाता ब्लॉक से एच एंड ई दाग वर्गों को एक प्रशिक्षण रोगविज्ञानी के साथ क्यूसी समीक्षा के अधीन किया जाता है जो कोर संग्रह के लिए ब्याज के क्षेत्रों / ऊतकों (यानी, व्यवहार्य कैंसर (सीए) या सौम्य (बीएन) ऊतकों) को इंगित करने के लिए एक मार्कर के साथ एच एंड ई सना हुआ स्लाइड को एनोटेट करता है, साथ ही साथ उन क्षेत्रों से भी बचा जाना चाहिए जिनसे बचा जाना चाहिए (यानी, परिगलित ऊतक क्षेत्र)। ऊतक ब्लॉक के उपयुक्त क्षेत्रों, जैसा कि एनोटेटेड एच एंड ई द्वारा इंगित किया गया है, फिर पहचानकी जाती है, छिद्रित किया जाता है, और टीएमए में शामिल किया जाता है। परिणामी टीएमए कोर पंच एच एंड ई को तब दाता ब्लॉक एच एंड ई के अनपंच किए गए क्षेत्र में वापस संदर्भित किया जा सकता है ताकि यह पुष्टि की जा सके कि ब्याज के ऊतक को कोर पंच में कब्जा कर लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: प्रतिनिधि परिणाम ( A, B) सफलतापूर्वक टेप विधि TMAs और रोग की समीक्षा के लिए उनके साथ H & Es पूरा किया। (C) प्लास्टिक कैसेट और पैराफिन ब्लॉक का पृथक्करण जब कैसेट को समय से पहले धातु के आधार मोल्ड से हटा दिया जाता है। (घ) पूर्ण टेप विधि टीएमए पिघले हुए पैराफिन के अशांत डालने के परिणामस्वरूप गिराए गए और माइग्रेट किए गए कोर दिखा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: टीएमए कोर एच एंड ई। टीएमए 1 के लिए एच एंड ई सना हुआ अनुभाग, टीएमए (स्पॉट 1-21) के साथ-साथ अभिविन्यास कोर (स्पॉट 22 और 23) के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक ऊतक कोर के लिए व्यक्तिगत एच एंड ई दिखा रहा है। दिखाए गए चित्रों को 4x उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, जो इमेजिंग सॉफ़्टवेयर से जुड़े डिजिटल कैमरे के साथ फिट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: अनुकरणीय इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और आरएनए आईएसएच। TMA1 से पूर्ण चेहरे वर्गों का मूल्यांकन IHC द्वारा vimentin और CD20 अभिव्यक्ति के लिए और RNA ISH द्वारा EBER ISH के माध्यम से RNA गुणवत्ता (U6) और EBV स्थिति का आकलन करने के लिए किया गया था। छवियां तीन कोर के लिए अनुकरणीय छवियां दिखाती हैं, जिसमें एक ट्यूमर ऊतक (स्पॉट 9), एक सामान्य ऊतक (स्पॉट 19), साथ ही साथ दो अभिविन्यास नियंत्रणों (स्पॉट 22) में से एक शामिल है। Vimentin सकारात्मकता भूरे रंग के दाग द्वारा दर्शाया जाता है, U6 सकारात्मकता नीले / बैंगनी धुंधला द्वारा, EBER नीले / बैंगनी धुंधला और CD20 भूरे रंग के दाग द्वारा दर्शाया जाता है। दिखाए गए चित्रों को 4x उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, जो इमेजिंग सॉफ़्टवेयर से जुड़े डिजिटल कैमरे के साथ फिट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 1: निर्मित टीएमए ऊतकों और दाग का अवलोकन किया गया: तालिका में रेखांकित किया गया है कि (ए) ऊतक प्रतिनिधि टीएमए धब्बों में से प्रत्येक में मौजूद है या नहीं (बी) ट्यूमर प्रत्येक एच एंड ई दाग ऊतक स्पॉट में मौजूद है और (सी) आसन्न टीएमए वर्गों पर किए गए किसी भी अतिरिक्त इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल दाग के परिणाम: "-" नकारात्मक इंगित करता है, एन / डी = नहीं किया गया। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
टीएमए निर्माण प्रक्रिया के सबसे महत्वपूर्ण घटकों में से एक एफएफपीई दाता ब्लॉकों की पैथोलॉजी समीक्षा है जिसमें से टीएमएकोर प्राप्त किए जाएंगे। समीक्षा के दौरान, एक बोर्ड-प्रमाणित रोगविज्ञानी प्रत्येक दाता ब्लॉक से एक प्रतिनिधि एच एंड ई दाग ऊतक अनुभाग की जांच करता है। यह आवश्यक है कि एच एंड ई को एक ताजा कटे हुए ऊतक अनुभाग का उपयोग करके उत्पन्न किया जाए ताकि यह अपने संबंधित दाता ब्लॉक का सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व हो। पुराने एच एंड ई के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है कि एफएफपीई ऊतक 3-आयामी संरचनाएं हैं जिनके ऊतक प्रोफ़ाइल ब्लॉक गहराई और व्यापक सेक्शनिंग के साथ काफी बदल सकते हैं; यह तब से हो सकता है जब से एच एंड ई उत्पन्न किया गया था, संभावित रूप से एफएफपीई ब्लॉक के अपने प्रतिनिधित्व को गलत बना रहा है। समीक्षा प्रक्रिया उपयुक्त मामलों के चयन और ऊतक क्षेत्रों की पहचान के लिए आवश्यक है जहां से कोर प्राप्त किया जाना चाहिए, साथ ही उन क्षेत्रों की पहचान भी है जिन्हें कोर एकत्र करते समय टाला जाना चाहिए। पैथोलॉजिकल समीक्षा की अनुपस्थिति में, अनुपयुक्त ऊतकों को शामिल करने की संभावना काफी बढ़ जाती है। इस तरह के ऊतकों को शामिल करने से निर्मित टीएमए को अप्रभावी और अपने इच्छित उद्देश्य के लिए अनुपयुक्त बनाने की क्षमता होती है। महत्वपूर्ण रूप से, अनजाने में इस तरह के अप्रभावी टीएमए का उपयोग करने से झूठे और भ्रामक डेटा के परिणामस्वरूप भारी क्षमता होती है। यह ज्ञान के साथ संयुक्त है कि एफएफपीई ऊतकों की प्रोफ़ाइल, और इस प्रकार उनके व्युत्पन्न कोर, बढ़ती गहराई के साथ काफी बदल सकते हैं, एक निर्मित टीएमए ब्लॉक के जीवनकाल में निरंतर पैथोलॉजी समीक्षा के महत्व पर प्रकाश डाला गया है। आदर्श रूप से एच एंड ई को प्रत्येक 15वें या 20वें अनुभाग का उपयोग करके उत्पन्न किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोर के ऊतक प्रोफाइल में कोई भी परिवर्तन कैप्चर और रिकॉर्ड किया जाता है। कम से कम, एच एंड ई को इन संभावित परिवर्तनों की निगरानी के लिए एक परियोजना की शुरुआत और अंत में उत्पन्न और समीक्षा की जानी चाहिए। इन बिंदुओं और एक शोध उपकरण के रूप में टीएमए के महत्व के प्रकाश में, यह आवश्यक है कि पैथोलॉजिकल समीक्षा टीएमए निर्माण प्रक्रिया में और टीएमए ब्लॉक के पूरे जीवन में दृढ़ता से एम्बेडेड हो।
एफएफपीई ब्लॉकों को अक्सर अनुसंधान उद्देश्यों के लिए जारी किए जाने से पहले नियमित नैदानिक प्रसंस्करण के दौरान बड़े पैमाने पर विभाजित किया जाता है। नतीजतन, दाता ब्लॉक गहराई और इस प्रकार दाता ब्लॉक कोर लंबाई अक्सर 4 मिमी के प्राप्तकर्ता विधि आदर्श से कम होती है। यहां हमने दिखाया है कि टेप विधि निर्माण प्रोटोकॉल का उपयोग करके टीएमए का निर्माण कैसे किया जाए, जिसका मुख्य लाभ गैर-आदर्श एफएफपीई ऊतक ब्लॉकों से कोर के साथ इसकी संगतता है। यद्यपि टेप विधि महान अनुसंधान मूल्य की है और टीएमए ब्लॉकों के निर्माण के लिए एक सस्ती, सुविधाजनक और सुलभ विधि प्रदान करती है, यह इसकी चुनौतियों और सीमाओं के बिना नहीं है। स्वचालित और मैनुअल प्राप्तकर्ता दोनों विधियों की तुलना में, जो एकल टीएमए ब्लॉक में कोर के 100-1,000 को समायोजित कर सकते हैं, टेप विधि9 का उपयोग करके निर्मित टीएमए के लिए अधिकतम 40 कोर की सिफारिश की जाती है। एक और सीमा निर्माण में आसानी के संबंध में है। प्राप्तकर्ता विधि में, छिद्रित कोर को केवल एक प्रीकास्ट मोल्ड में डाला जाता है, जो प्रत्येक कोर को अपने स्वयं के व्यक्तिगत रूप से अच्छी तरह से एनकैस करके कोर स्थिरता प्रदान करता है, जिससे कोर माइग्रेशन को रोका जा सकता है और साथ ही अत्यधिक नियमित कोर प्लेसमेंट और अलगाव को बढ़ावा दियाजाता है। इसके अलावा, प्राप्तकर्ता विधि पूरी तरह से मैनुअल, अर्ध-मैनुअल और पूरी तरह से स्वचालित होने की वैकल्पिक सुविधा प्रदान करती है। इसके विपरीत, मैनुअल टेप विधि को सुई लेने का उपयोग करके हाथ से प्रत्येक कोर के सावधान, कोमल प्लेसमेंट की आवश्यकता होती है। यद्यपि टेप विधि में एक प्रीकास्ट मोल्ड की अनुपस्थिति प्राप्तकर्ता विधि के साथ अनुभव किए गए अत्यधिक नियमित प्लेसमेंट और अलगाव को रोकती है, इस कमी को एक चेकर्ड ग्रिड को शामिल करने के माध्यम से दूर किया जाता है। यह महत्वपूर्ण है कि चेकर्ड ग्रिड को ब्लॉक-एज प्लेसमेंट से बचने के लिए धातु ट्रे के केंद्र में चिपकाया जाता है, जो कोर को जगह में रखने वाले अपर्याप्त पैराफिन होने पर कोर हानि के जोखिम को बढ़ाता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्राप्तकर्ता विधि के साथ संभव छोटे कोर पृथक्करणों को मैनुअल कोर प्लेसमेंट के कारण टेप विधि के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है और आसन्न कोर के बीच फिट होने के लिए सुई लेने की आवश्यकता है। कोर को सबसे छोटी सतह क्षेत्र या डीएसएसटी कवर ग्रिड से संपर्क करने वाले कोर के पदचिह्न के साथ एक फ्रीस्टैंडिंग खड़े फैशन में रखा जाता है। यह सेटअप प्राप्तकर्ता विधि की तुलना में काफी कम कोर स्थिरता प्रदान करता है और पिघले हुए पैराफिन डालते समय कोर टॉपलिंग और या माइग्रेशन के लिए एक बढ़ाया जोखिम प्रदान करता है। दरअसल, प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक पिघला हुआ पैराफिन डाल रहा है। यह आवश्यक है कि यह ओवन से हटाने पर जल्दी से किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पैराफिन पूरी तरह से तरल है और यह कि डालने को कम से कम अशांति के साथ धीरे से किया जाता है। दिलचस्प बात यह है कि चेन एट अल ने एक अत्यधिक उपन्यास सहायक उपकरण विकसित किया, जो 7 x 11 समान रूप से वितरित 2 मिमी व्यास के छेद के साथ एक स्टेंसिल के समान है, जिसे प्राप्तकर्ता ब्लॉक बनाते समय सुइयों का मार्गदर्शन करने के लिए एक खाली पैराफिन ब्लॉक के शीर्ष पर रखा जाता है और जब दाता ब्लॉक कोर23 सम्मिलित किया जाता है। यद्यपि प्राप्तकर्ता ब्लॉक निर्माण में सहायता के लिए डिज़ाइन किया गया है, इस तरह के डिवाइस को आसानी से प्लेसमेंट का मार्गदर्शन करने, अलगाव को विनियमित करने और निर्माण प्रक्रिया के दौरान कोर स्थिरता बढ़ाने के लिए टेप विधि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
कोर स्थिरता के सबसे महत्वपूर्ण प्रभावकों में से एक टेप विधि टीएमए में शामिल कोर की संख्या है। ऐसा इसलिए है क्योंकि जैसे-जैसे कोर की संख्या बढ़ती है, कोर का व्यास कोर की बढ़ती संख्या को समायोजित करने के लिए कम होना चाहिए, जो बदले में डीएसएसटी का पालन करने वाले कोर पदचिह्न को कम करता है। टेप विधि टीएमए निर्माण के लिए 1 मिमी के न्यूनतम कोर व्यास की सिफारिश की जाती है, क्योंकि हमने पाया है कि छोटे व्यास वाले कोर विशेष रूप से अस्थिर होते हैं और बहुत कोमल पैराफिन डालने के साथ भी टॉपलिंग के लिए प्रवण होते हैं। दो अलग-अलग इन-हाउस तरीकों की जांच करने वाले एक हालिया अध्ययन में 16 जी सुइयों (1.1 मिमी के कोर व्यास) और 4 मिमी व्यास के पंच का उपयोग किया गया था, जिसमें 1.1 मिमी (26.5%) के साथ पर्याप्त ऊतक नुकसान का अनुभव हुआ था, लेकिन 4 मिमी कोर24 नहीं। यह इंगित करने के लिए प्रतीत होता है कि छोटे कोर के साथ काम करने के लिए समस्याग्रस्त हो सकते हैं और न केवल निर्माण के दौरान। इसके अलावा, छोटे व्यास मूल दाता ब्लॉक के साथ-साथ बड़े कोर का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं, जिससे पैथोलॉजिकल व्याख्या मुश्किल हो जाती है और गलत दाता ऊतक प्रतिनिधित्व की संभावना बढ़ जाती है।
अभिविन्यास ब्लॉकों को शामिल करना और प्लेसमेंट टीएमए निर्माण में गहरा महत्व का है। हालांकि, यह टेप विधि निर्मित टीएमए के लिए विशेष महत्व का है। यह इस तथ्य से उपजा है कि टेप विधि निर्माण प्रक्रिया को उलट देती है जिससे स्थानिक विचलन का खतरा बढ़ जाता है। हम प्रत्येक ब्लॉक में तीन ओरिएंटेशन कोर तक शामिल करने की सलाह देते हैं, और ब्लॉक को सर्वोत्तम उन्मुख करने के लिए उन्हें नमूना कोर से दूर रखा जाता है। अभिविन्यास कोर ऊतक ब्लॉकों से लिए गए कोर हो सकते हैं जिनमें निर्मित टीएमए या ऊतक-मुक्त-रंगीन अभिविन्यास उपकरण21 के विषय से स्पष्ट रूप से अलग-अलग ऊतक होते हैं, जहां उत्तरार्द्ध गैर-रोगविज्ञानियों के लिए विशेष रूप से सहायक होता है। गैर-नियमित मैट्रिक्स पैटर्न वाले कोर प्लेसमेंट के साथ संयुक्त, अभिविन्यास कोर विचलन के लिए जोखिम को कम करते हैं।
टेप और प्राप्तकर्ता विधियों का उपयोग करके निर्मित टीएमए के बीच कोर लंबाई में स्पष्ट अंतर निर्माण विधि का चयन करते समय निर्णय लेने की प्रक्रिया में दाता ब्लॉक गहराई को शामिल करने से उपजा है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल एक थ्रेशोल्ड को नियोजित करता है जहां टीएमए का निर्माण टेप और प्राप्तकर्ता विधियों का उपयोग करके किया जाता है जब दाता ब्लॉकों में क्रमशः <4 मिमी और 4 मिमी की गहराई होती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि निर्माण विधि विकल्प में दाता ब्लॉक गहराई को शामिल करना सार्वभौमिक नहीं है। यद्यपि टीएमए के लिए दाता ब्लॉक की गहराई के बावजूद या तो विधि का उपयोग करके निर्माण करना संभव है, लंबे कोर टेप विधि का उपयोग करके टीएमए निर्माण के दौरान प्लास्टिक के कैसेट के प्लेसमेंट के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, और या गिरा या झुकाए जा सकते हैं। निर्णय लेने की प्रक्रिया में मानदंडों को शामिल करने या छोड़ने का विकल्प प्रयोगशाला, लागत और वांछित अंतिम उत्पाद के लिए उपलब्ध सुविधाओं पर निर्भर करता है। इस प्रोटोकॉल के मापदंडों के तहत, स्लाइड माउंटेड टीएमए अनुभागों की संख्या जो टेप विधि निर्मित टीएमए से प्राप्त की जा सकती है, प्राप्तकर्ता विधि निर्मित टीएमए से प्राप्त होने वाली तुलना में काफी कम है। यद्यपि दाता ब्लॉक की गहराई को बढ़ाने और उन्हें प्राप्तकर्ता विधि के साथ संगत बनाने के लिए एफएफपीई ऊतकों को फिर से ब्लॉक करना संभव है, फिर से ब्लॉक के भीतर एक ही ऊतक अभिविन्यास प्राप्त करने की संभावना कम है। बदले में, इसके लिए एक पूर्ण-चेहरा अनुभाग प्राप्त करने के लिए व्यापक ब्लॉक की आवश्यकता हो सकती है, जिसमें संभवतः महत्वपूर्ण ऊतक हानि शामिल होगी। ब्लॉक फेसिंग के बाद, एक टेप विधि का निर्माण किया गया टीएमए सभी कोर के साथ लगभग 50 स्लाइड माउंटेड टीएमए वर्गों की पैदावार करता है। हालांकि, सटीक संख्या ब्लॉक से ब्लॉक में भिन्न होगी और टीएमए के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले कोर की लंबाई और कटे हुए वर्गों की मोटाई (5 μm बनाम 4 μm) पर निर्भर करती है। इसके अलावा, यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि उनकी अलग-अलग कोर लंबाई के कारण, कोर अलग-अलग समय पर समाप्त हो जाएंगे क्योंकि टीएमए को उत्तरोत्तर विभाजित किया गया है; एक विशेषता है कि निरंतर रोग की समीक्षा के लिए की आवश्यकता reemphasizes.
यद्यपि प्राप्तकर्ता विधि टेप विधि पर महत्वपूर्ण लाभ और लाभ प्रदान करती है, जिसमें कम थकाऊ और अधिक त्वरित निर्माण प्रक्रियाएं शामिल हैं, टेप विधि का उद्देश्य अनुभवी उच्च थ्रूपुट प्रयोगशालाओं के लिए नहीं है। इसका उद्देश्य औसत प्रयोगशाला है, विशेष रूप से संसाधन सीमित सेटिंग्स में, चर गहराई के दाता ब्लॉकों तक पहुंच के साथ, लेकिन टीएमए निर्माण सेवाओं के लिए नहीं। हालांकि, भविष्य के अनुप्रयोगों को उच्च थ्रूपुट प्रयोगशालाओं में पात्र नमूनों के पूल को बढ़ाने और दाता ब्लॉकों को फिर से अवरुद्ध करने की आवश्यकता को समाप्त करने के लिए इस विधि के स्वचालन को देखा जा सकता है। अंत में, वर्णित टीएमए टेप विधि निर्माण प्रोटोकॉल को महंगे उपकरणों की आवश्यकता के बिना गैर-विशेष प्रयोगशालाओं में आसानी से स्थापित किया जा सकता है। हालांकि, यह सलाह दी जाती है कि नए उपयोगकर्ताओं को बिना किसी मूल्य के एफएफपीई ऊतक ब्लॉकों को नियोजित करना चाहिए, ऊतक मुक्त रंगीन अभिविन्यास उपकरण21 या यहां तक कि रंगीन पैराफिन ब्लॉकों को बिना किसी ऊतक के पहले ऊतक के साथ पहले से ही उपयोग करने के लिए खुद को टीएमए निर्माण में आगे बढ़ने से पहले खुद को परिचित करने के लिए कीमती ऊतकों का उपयोग करके टीएमए निर्माण के लिए आगे बढ़ने से पहले। यद्यपि उनका निर्माण संभावित नुकसान के बिना नहीं है, जो टीएमए ब्लॉकों का निर्माण और उपयोग करने वाले दोनों लोगों को पता होना चाहिए, यह प्रतीत होता है कि अनपॉलिश्ड "होममेड" टीएमए निर्माण विधि अनुसंधान के लिए उच्च गुणवत्ता, जैविक रूप से प्रासंगिक टीएमए उत्पन्न कर सकती है। दरअसल, टेप विधि से उपजी टीएमए अनुभागों का निर्माण टीएमए एसीएसआर बायोरैपोसिटरी में सबसे अधिक अनुरोधित ऊतक नमूनों में से एक है।
Disclosures
हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम के लिए धन एनआईएच द्वारा वित्त पोषित एड्स और कैंसर नमूना संसाधन (एसीएसआर) बायोरैपोसिटरी (www.acsr1.com), यूएम 1सीए 181255 द्वारा प्रदान किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
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