Summary
Este protocolo describe el método de cinta sobre cómo construir manualmente un microarray de tejido utilizando bloques de donantes FFPE de diferentes profundidades.
Abstract
El microarray tisular (TMA) es una importante herramienta de investigación en la que muchas muestras de parafina fija de formalina incrustada (FFPE) se pueden representar en un solo bloque de parafina. Esto se logra mediante el uso de núcleos de tejido extraídos de la región de interés de diferentes bloques FFPE donantes y disponiéndolos en un solo bloque de parafina TMA. Una vez construidas, las secciones de la TMA completa se pueden utilizar para realizar estudios inmunohistoquímicos, cromogénicos, de hibridación fluorescente in situ (FISH) y arn ISH para evaluar la expresión de proteínas, así como las alteraciones genómicas y transcripcionales en muchas muestras simultáneamente, minimizando así el uso de tejidos y reduciendo los costos de reactivos. Hay varias técnicas de construcción de TMA diferentes. Uno de los métodos de construcción más comunes es el método receptor, que funciona mejor con núcleos de la misma longitud para los que se recomienda una longitud mínima de 4 mm. Desafortunadamente, los bloques de tejido pueden resecarse en gran medida durante el proceso de diagnóstico, lo que con frecuencia resulta en espesores de bloque de donante "no ideales" de menos de 4 mm. El artículo actual y el video se centran en el método de cinta adhesiva de doble cara; un método manual alternativo, de bajo costo, fácil de usar y rápido para construir TMA de baja densidad (<50 núcleos) que es altamente compatible con estos bloques de donantes no ideales. Este protocolo proporciona una guía paso a paso sobre cómo construir una TMA utilizando este método, con un enfoque en la importancia crítica de la revisión patológica y la validación posterior a la construcción.
Introduction
Los tejidos incrustados en parafina fija de formalina (FFPE) se utilizan ampliamente en estudios morfológicos e inmunohistoquímicos de expresión de proteínas1. Sin embargo, la investigación de descubrimiento a menudo requiere el examen de varios marcadores en una gran cantidad de tejidos, que pueden agotar tejidos preciosos. Introducido en la década de 1980, el microarray tisular (TMA) es una importante herramienta de investigación que ensambla pequeñas regiones ejemplares de interés a partir de muchos bloques de tejido FFPE diferentes en un solo bloque de parafina, lo que permite el examen de muchas muestras de tejido simultáneamente2. Por lo tanto, los TMA evitan el uso excesivo de muestras de tejido altamente preciosas, y a menudo raras, al tiempo que reducen los costos asociados con la realización de aplicaciones posteriores en muchas muestras individuales 3,4.
Existen varias técnicas diferentes para la construcción de TMA5, incluyendo enfoques automatizados y semimanuales 6,7. La mayoría de estos últimos enfoques utilizan el método receptor, en el que los núcleos de tejido perforados a partir de bloques de donantes se insertan en un molde prefabricado. Sin embargo, se recomienda que para este métodose utilicen bloques de donante "ideales" que tengan al menos 4 mm de espesor. Desafortunadamente, los bloques de donantes, particularmente aquellos que han sido ampliamente seccionados con fines de diagnóstico clínico antes de estar disponibles para la investigación, con frecuencia tienen menos de 4 mm de espesor, lo que podría excluirlos del uso en la construcción de TMA utilizando el método receptor, si la reincrustación para lograr una profundidad de 4 mm no es posible o deseable. Además, estos procedimientos a menudo pueden usar un microarrayer de tejido manual de sobremesa o costosos instrumentos automatizados que no son fácilmente accesibles o asequibles para el laboratorio de investigación promedio. Por el contrario, el método de cinta adhesiva de doble cara o método de cinta, es un método de construcción manual de TMA que es compatible con bloques de donantes no ideales que utiliza microarrayers de tejido de mano de bajo costo, ampliamente disponibles, reutilizables o desechables 8,9,10. Este método invierte el proceso de construcción lanzando el bloque alrededor de núcleos verticales invertidos que al finalizar se enjuagan con la parte superior del TMA, independientemente de la longitud del núcleo. Como resultado, todas las muestras están presentes en las secciones TMA cuando se seccionan por primera vez, lo que permite al constructor aprovechar al máximo estos bloques no ideales desde el principio. Por lo tanto, el método de cinta representa una alternativa rentable y factible para los laboratorios de investigación no especializados.
La construcción de TMA no está exenta de desafíos, y se debe tener precaución al seleccionar las regiones de tejido para extraer los núcleos, lo que hace que la revisión patológica sea una parte crítica del proceso de construcción de TMA11,12. Por lo tanto, este protocolo tiene como objetivo subrayar la profunda importancia de la revisión patológica en la construcción de TMA al resaltar algunas de las trampas patológicas asociadas con la construcción de TMA que las personas que construyen y usan TMA deben conocer, y por qué la revisión de patología debe continuar durante la vida útil de un bloque de TMA.
Este protocolo describe los pasos tomados en el Laboratorio Técnico Básico del Recurso de Muestras de SIDA y Cáncer (ACSR) para construir TMA a partir de bloques de donantes no ideales utilizando el método de cinta; donde el ACSR es un biorepositorio financiado por los NIH dedicado a la recolección y distribución equitativa de bioespecímenes de tejidos cancerosos del VIH con el fin de promover la investigación de la malignidad del VIH.
Protocol
Todos los bloques de donantes se desidentificaron durante la recolección y se utilizaron para la construcción de TMA de conformidad con los protocolos IRB aprobados de Mayo Clinic (PR16-000507 y PR2207-02).
1. Revisión patológica
- Recuperar los bloques donantes de tejido FFPE para ser utilizados en la construcción de TMA.
- Envíe una diapositiva13 teñida de hematoxilina y eosina (H&E) recién generada para cada bloque de donante de tejido FFPE seleccionado para revisión histológica por un patólogo certificado por la junta para confirmar el diagnóstico y anotar el tejido.
NOTA: La tinción de H&E puede realizarse en casa o enviarse a un laboratorio de servicios básicos patológicos para la tinción, como fue el caso en este protocolo. Uno de los conceptos más importantes a recordar al construir TMA es que los tejidos en los bloques donantes ffPE son estructuras tridimensionales (3D) cuya forma, contenido tumoral y viabilidad del tejido pueden cambiar significativamente con el aumento de la profundidad del bloque. El patólogo debe determinar, basándose en la revisión de la sección de tejido teñido de H&E, que es una representación en 2 dimensiones del tejido 3D, la mejor región para extraer el núcleo del tejido. - Durante la revisión histológica, asegúrese de que el patólogo identifique y anote los tejidos de interés / no de interés en las diapositivas teñidas de H& E. Para anotar la diapositiva, siga los pasos que se indican a continuación.
- Use un lápiz de marcado deslizante para rodear el tejido de interés.
- Usando el mismo lápiz de marcado, borre las áreas dentro de la región rodeada de círculos que deben evitarse.
- Utilice la pluma de marcado para marcar las áreas que se consideren ideales para el muestreo y la extracción del núcleo.
NOTA: Es importante recordar que la forma y composición del tejido pueden cambiar con la profundidad del tejido en el bloque. Por lo tanto, la composición del núcleo del tejido puede cambiar dependiendo de dónde se extrajo el núcleo, lo que enfatiza la necesidad de una guía patológica continua. - Envíe tejido adicional para tinciones inmunohistoquímicas específicas de la enfermedad junto con el H&E, si es necesario, para ayudar a la revisión patológica. Ejemplos de tales tinciones incluyen tinción ERBB2 para el cáncer de mama HER2 positivo14, HHV-8 para el sarcoma de Kaposi15, CD20 para los linfomas de células B16, U6 como marcador global para la calidadde ARN 17, EBER para determinar la positividad del virus de Epstein-Barr18 y Vimentina como confirmación de los orígenes mesenquimales y marcador de control de calidad tisular19,20.
2. Preparación para la construcción de TMA
- Una vez completada la revisión patológica, compile la lista final de bloques de donantes que se utilizarán en la construcción de TMA y cree un mapa de TMA (Figura 1A). El mapa TMA es un esquema que describe dónde se ubicarán los núcleos en el TMA completado y las muestras de tejido montadas en diapositivas obtenidas del TMA resultante.
- Para fines de orientación, asegúrese de que el mapa TMA evite colocar núcleos en una matriz uniforme, como una matriz de 3 x 3 o 4 x 4 e incluya al menos 1 marcador de orientación.
NOTA: Los núcleos de orientación pueden ser núcleos tomados de herramientas de orientación de color libre de tejido21, o bloques de tejido que contienen tejidos claramente diferentes del tema de la TMA. A diferencia del método receptor donde los núcleos verticales se insertan en un molde de cera prefabricado, el método de cinta crea un TMA vertiendo cera fundida alrededor de núcleos invertidos y erectos. Esta inversión del proceso de construcción requiere un segundo mapa conocido como el mapa de construcción. - Cree el mapa de construcción creando una imagen reflejada del mapa TMA (Figura 1B). El mapa de construcción muestra dónde se debe colocar cada núcleo durante la construcción para aparecer en la ubicación correcta en el TMA completado. Guarde el mapa de construcción.
- Una vez creados los mapas, prepara el molde base TMA metálico. Use una rejilla de papel a cuadros desechable para guiar la colocación del núcleo y regular la separación del núcleo.
NOTA: En el pdf complementario se proporciona una cuadrícula de plantilla de 6 x 7 (42 puntos) para un máximo de 40 núcleos (más dos núcleos / huecos de orientación) para su uso con moldes base de metal disponibles comercialmente con dimensiones internas de 26 mm x 20 mm. Imprima y recorte la cuadrícula de papel. - Corte la rejilla a cuadros a medida y coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara (DSST) en la parte posterior de la rejilla. Coloque la rejilla y la cinta DSST en la bandeja de metal y agregue una segunda pieza de DSST en la parte superior de la rejilla, es decir, en la parte superior de la rejilla de papel en el molde base de metal (Figura 2A).
3. Colocación del núcleo
- Superponga el H&E revisado patológicamente en su bloque de tejido correspondiente y use las marcas del patólogo para identificar dónde se va a perforar el bloque de tejido (Figura 2B).
- Perfore el bloque donante FFPE usando un punzón de núcleo manual (Figura 2C) en el lugar apropiado.
NOTA: Los punzones de núcleo están disponibles en una variedad de diámetros. Este método emplea un punzón de núcleo de mano de 2 mm de diámetro.- Si usa un punzón de núcleo reutilizable, asegúrese de que se limpie antes y después de cada punzón de tejido.
- Expulse el núcleo del punzón del núcleo y use un pico de aguja para colocar el núcleo expulsado en el punto de mira de la rejilla cubierta por DSST (Figura 2D). Asegúrese de que cuando el núcleo se coloca en la rejilla, está invertido y erguido de tal manera que el extremo del tejido del núcleo entre en contacto con el DSST (tejido boca abajo). También asegúrese de que el núcleo se coloque en la posición adecuada en la cuadrícula como se indica en el mapa de construcción.
- Repita hasta que todos los bloques donantes estén agrupados y los núcleos se coloquen en sus posiciones apropiadas.
4. Completar el TMA
- Encienda el horno de sobremesa, ajuste a 78 °C y deje tiempo suficiente para alcanzar la temperatura.
- Para cada TMA que se construya, derrita 45 g de pellets de parafina en un recipiente a prueba de horno.
- Etiquete un casete de plástico y colóquelo sobre el molde de base metálica que contiene los núcleos (Figura 2E). La altura de los núcleos no debe exceder la profundidad de la bandeja de metal, ya que los núcleos altos se inclinarán o derribarán cuando se coloque el cassette en su lugar.
- Coloque el molde con el cassette en una bandeja para atrapar el desbordamiento y vierta suavemente la parafina derretida a través del cassette en la bandeja de núcleos (Figura 2F).
- Permita que la parafina fundida se desborde para asegurarse de que no haya burbujas de aire en el cuerpo de la TMA. Asegúrese de que la parafina se llene en la parte superior del cassette para que esté incrustada y firmemente unida al bloque de parafina una vez que la parafina se haya solidificado.
- No mueva ni moleste el bloque y deje que se enfríe a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, refrigere a 4 ° C durante 30 minutos adicionales para solidificarse por completo.
- Una vez completamente solidificado, separe suavemente el molde de base de metal del bloque de núcleos de parafina unido al cassette.
NOTA: El DSST conserva su adhesividad a través del proceso de construcción y con frecuencia se adhiere al bloque de parafina recién formado. Si corresponde, retire suavemente el DSST y la cuadrícula de la parte superior del bloque TMA ahora completado.
5. Validación de la TMA
- Una vez que se construye el TMA, use un microtomo para seccionar el TMA recién completado. Cortar una o más secciones de tejido de cara completa.
- Transfiera las secciones al baño de agua precalentado y monte las secciones de deslizamiento.
NOTA: Los bloques recién construidos a menudo requieren una cara de bloque (corte del exceso de parafina) para obtener secciones de tejido de cara completa que contienen todos los núcleos. - Una vez seco, envíe una sección TMA montada en un portaobjetos recién cortada para la tinción H&E13 y cualquier tinción inmunohistoquímica adicional, si es necesario.
- Envíe las secciones de TMA H&E teñidas para su revisión patológica.
NOTA: Durante la revisión de la patología de TMA, un patólogo certificado por la junta, preferiblemente el mismo patólogo que revisó los bloques de donantes de TMA, revisa los núcleos teñidos de TMA H & E para garantizar que los tejidos deseados de interés estén realmente presentes. Si se enviaron tinciones inmunohistoquímicas adicionales de tejido o enfermedad específicas para la revisión del bloque del donante en el paso 1.3.4, estas tinciones deben repetirse en las secciones de TMA y enviarse junto con la TMA H&E para su revisión patológica. - Registrar los resultados de la revisión de validación patológica de TMA.
Representative Results
El método de cinta de construcción de TMA descrito aquí es el método de elección empleado en el Laboratorio técnico de núcleo de ACSR para conservar tejidos, lo que a su vez permite la distribución frugal y equitativa de tejidos altamente preciosos a los investigadores.
Un componente crítico del proceso de construcción es la identificación del tejido de interés en un bloque donante dado de donde se debe obtener el núcleo de TMA. Esto se determina mediante una revisión patológica en la que un patólogo capacitado revisa una diapositiva de H&E recién generada (Figura 3). Usando un marcador, el patólogo rodea el área en la diapositiva de H&E, lo que indica que el núcleo debe obtenerse del bloque donante dentro de este círculo (Figura 3). El patólogo también puede marcar áreas adicionales, como áreas necróticas, que deben evitarse, o áreas benignas de donde se pueden obtener núcleos de tejido adicionales (Figura 3). Los núcleos se perforan desde las áreas indicadas y se incluyen en la construcción de la TMA.
Hay dos métricas principales para completar correctamente un TMA por el método de cinta. El primero es la presencia de puntos del núcleo de tejido en las posiciones y distancias esperadas entre sí, que se evalúa mediante inspección visual. La Figura 4A, B muestra dos TMA de método de cinta completamente exitosos y sus correspondientes diapositivas de H&E. La inspección visual de los bloques TMA muestra que los núcleos están presentes y espaciados regularmente en cada TMA. Algunos de los principales problemas de construcción que pueden surgir durante el proceso de construcción del método de cinta incluyen la separación del bloque y el cassette debido a la eliminación prematura de la base metálica antes de la solidificación de la cera (Figura 4C). Otro problema potencial observado con los TMA construidos por el método de cinta es el derribo del núcleo y/o la deriva de colocación de los núcleos incrustados (Figura 4D); un problema que puede surgir del vertido excesivamente turbulento de la parafina fundida, que puede verse reforzado aún más por el DSST mal adhesivo. La Figura 5 muestra las imágenes de H&E para los núcleos de TMA1. Todos menos un núcleo (punto 1) están presentes en el H&E de TMA1. La Figura 5 también muestra que algunos núcleos están presentes como puntos de tejido circulares completos (es decir, puntos 4, 6, 13, 17) mientras que otros no están completamente presentes (es decir, puntos 3, 8, 9, 12). La pérdida de tejido experimentada en estos últimos casos no es infrecuente y puede deberse a una sección insuficiente necesaria para revelar todos los núcleos en su totalidad. Alternativamente, la presencia de tejido incompleto, o la ausencia total de tejido (es decir, el punto 1), puede deberse a la mala calidad del tejido de ese núcleo, lo que puede provocar la pérdida de tejido durante el proceso de tinción.
La segunda métrica de éxito se evalúa en términos de si los núcleos de TMA capturaron o no el tejido de interés. Esto se logra a través de la revisión patológica y la validación de los núcleos individuales de TMA H&E (Figura 5) en comparación con el bloque de donante preperforado H&Es (Figura 3), y donde sea necesario / realizado cualquier otra tinción inmunohistoquímica adicional realizada. La Figura 6 muestra manchas ejemplares realizadas en TMA1, incluyendo Vimentin, U6, EBER y CD20. Los tejidos positivos de vimentina (tinción marrón) indican que todos los tejidos son de origen mesenquimal y son de buena calidad que se pueden teñir. La positividad de U6 (tinción púrpura / azul oscuro) indica que la calidad del ARN en el tejido es buena y complementa las tinciones de hibridación in situ de ARN (ISH) como EBER, que se dirigen a las transcripciones de genes. Los resultados de U6 en la Figura 5 indican que la calidad del ARN es alta en el tejido del linfoma (punto 9) y el control normal de la orientación del tejido de las amígdalas (punto 22), pero no en el tejido normal en el punto 19. A raíz de esta tinción EBER fue negativa en el tejido normal y el control de orientación, pero fuertemente positiva en el tejido del linfoma (punto 9). Como era de esperar para los tejidos de origen linfoide, tanto los puntos 9 como los 22 se tiñeron positivos para el marcador de células B CD20, pero el punto 19, que proviene del tejido normal de la médula espinal, no lo hizo. Los resultados de tinción para todos los núcleos de TMA se resumen en la Tabla 1 y confirman la anotación tisular para estos núcleos de tejido de TMA.
Figura 1: Mapas TMA. Una vez que se han seleccionado todos los bloques FFPE y los controles de orientación, se crea un mapa detallado, conocido como mapa TMA (A), que describe dónde se ubicará cada núcleo de bloque donante en el bloque terminado. Es importante tener en cuenta que al construir un TMA utilizando el método de cinta, el mapa de construcción (B) es una imagen especular del mapa TMA porque este método invierte el proceso de construcción, vertiendo parafina fundida alrededor de núcleos de tejido vertical en lugar de insertar los núcleos en un molde prefabricado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Construcción del TMA utilizando el método de cinta. (A) Capas 2 de cinta adhesiva de doble cara (DSST) y una rejilla de papel en orden siguiente en la parte inferior del molde de base metálica; Coloque la primera pieza de DSST (inserto 2A), seguida de la rejilla de papel desechable, y luego la segunda pieza de DSST en la parte inferior del molde de base de metal. (B) Para cada bloque donante, un patólogo genera y revisa un nuevo H&E que marca el H&E para denotar el tejido de interés, dónde perforar el bloque y, si corresponde, dónde evitar el punzonado para extraer un núcleo de tejido. (C) Perfore el bloque donante con un punzón TMA de mano reutilizable o de eliminación. (D) Usando un pico de aguja, cada núcleo se coloca de pie, el tumor boca abajo en el DSST que cubre la rejilla. (E) Coloque cuidadosamente un cassette de plástico preetiquetado en la parte superior de la bandeja de metal que contiene los núcleos verticales. (F) La parafina fundida se vierte suavemente en la bandeja a través de la celosía del cassette para rodear y sumergir los núcleos verticales debajo del cassette. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tinción de H&E en bloque donante. Las secciones teñidas de H&E de cada bloque donante se someten a revisión de control de calidad con un patólogo de capacitación que anota la diapositiva teñida de H&E con un marcador para indicar las áreas / tejidos de interés (es decir, cáncer viable (CA) o tejidos benignos (BN)) para la recolección del núcleo, así como las áreas que deben evitarse (es decir, áreas de tejido necrótico). Las áreas apropiadas del bloque de tejido, según lo indicado por el H&E anotado se identifican, perforan e incorporan al TMA que se está construyendo. El punzón central TMA resultante H&E se puede referenciar de nuevo al área no perforada del bloque donante H&E para confirmar que el tejido de interés fue capturado en el punzón central. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos. (A,B) Finalización exitosa de los TMA del método de cinta y sus H&Es acompañantes para la revisión patológica. (C) Separación del cassette de plástico y el bloque de parafina cuando el cassette se retira prematuramente del molde de base metálica. (D) Método de cinta TMA completado que muestra núcleos derribados y migrados resultantes del vertido turbulento de la parafina fundida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: TMA core H&Es. Sección teñida de H&E para TMA1, que muestra los H&E individuales para cada núcleo de tejido utilizado para construir el TMA (puntos 1-21), así como los núcleos de orientación (puntos 22 y 23). Las imágenes mostradas se obtuvieron utilizando un objetivo 4x, equipado con una cámara digital conectada al software de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Inmunohistoquímica ejemplar y ARN ISH. Las secciones de cara completa de TMA1 fueron evaluadas por IHC para la expresión de vimentina y CD20 y por ARN ISH para evaluar la calidad del ARN (U6) y el estado del VEB a través de EBER ISH. Las imágenes muestran imágenes ejemplares para tres núcleos, incluido un tejido tumoral (punto 9), un tejido normal (punto 19), así como uno de los dos controles de orientación (punto 22). La positividad de la vimentina se denota por la tinción marrón, la positividad U6 se denota por la tinción azul / púrpura, EBER por la tinción azul / púrpura y CD20 por la tinción marrón. Las imágenes mostradas se obtuvieron utilizando un objetivo 4x, equipado con una cámara digital conectada al software de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Visión general de los tejidos de TMA construidos y las tinciones realizadas: La tabla describe si (a) el tejido está presente o no en cada una de las manchas representativas de TMA (b) el tumor está presente en cada mancha de tejido teñida de H&E y (c) los resultados de cualquier tinción inmunohistológica adicional realizada en las secciones adyacentes de TMA: "-" indica negativo, n / d = no hecho. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Expediente complementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
Uno de los componentes más críticos del proceso de construcción de TMA es la revisión patológica de los bloques donantes de FFPE de los que se obtendrán los núcleos de TMA4. Durante la revisión, un patólogo certificado por la junta examina una sección representativa de tejido teñido de H&E de cada bloque donante. Es imperativo que el H&E se genere utilizando una sección de tejido recién cortada para que sea la mejor representación de su bloque donante correspondiente. No se recomienda el uso de H&E más antiguos dado que los tejidos FFPE son estructuras de 3 dimensiones cuyo perfil tisular puede cambiar significativamente con la profundidad del bloque y la sección extensa; esto puede haber ocurrido desde que se generó el H&E, lo que podría hacer que su representación del bloque FFPE sea inexacta. El proceso de revisión es esencial para la selección de casos adecuados y la identificación de áreas de tejido de donde se deben obtener los núcleos, así como la identificación de áreas que deben evitarse al recolectar núcleos. En ausencia de revisión patológica, la probabilidad de incluir tejidos inadecuados aumenta significativamente. La inclusión de tales tejidos tiene el potencial de hacer que la TMA construida sea ineficaz e inadecuada para su propósito previsto. Es importante destacar que, sin saberlo, el uso de tales TMA ineficaces tiene un enorme potencial para dar lugar a datos falsos y engañosos. Esto, combinado con el conocimiento de que el perfil de los tejidos FFPE, y por lo tanto sus núcleos derivados, puede cambiar significativamente con una profundidad cada vez mayor, destaca la importancia de la revisión continua de la patología a lo largo de la vida útil de un bloque TMA construido. Idealmente, los H&Es deben generarse utilizandocada sección 15 o 20 para garantizar que se capturen y registren los cambios en los perfiles tisulares de los núcleos. Como mínimo, H&E debe generarse y revisarse al comienzo y al final de un proyecto para monitorear estos cambios potenciales. A la luz de estos puntos y la importancia de la TMA como herramienta de investigación, es imperativo que la revisión patológica esté firmemente arraigada en el proceso de construcción de la TMA y durante toda la vida útil del bloque TMA.
Los bloques FFPE a menudo se seccionan ampliamente durante el procesamiento de diagnóstico de rutina antes de ser liberados con fines de investigación. Como resultado, la profundidad del bloque del donante y, por lo tanto, las longitudes del núcleo del bloque del donante a menudo son menores que el ideal del método receptor de 4 mm. Aquí hemos demostrado cómo construir TMA utilizando el protocolo de construcción del método de cinta, cuya principal ventaja es su compatibilidad con núcleos de bloques de tejido FFPE no ideales. Aunque el método de cinta es de gran valor de investigación y ofrece un método económico, conveniente y accesible para construir bloques TMA, no está exento de desafíos y limitaciones. En comparación con los métodos de receptores automáticos y manuales, que pueden acomodar 100-1,000 núcleos en un solo bloque TMA, se recomienda un máximo de 40 núcleos para los TMA construidos utilizando el métodode cinta 9. Otra limitación es con respecto a la facilidad de construcción. En el método receptor, los núcleos perforados simplemente se insertan en un molde prefabricado, que proporciona estabilidad al núcleo al envolver cada núcleo en su propio pozo individual, evitando así la migración del núcleo y promoviendo la colocación y separación del núcleo altamente regular22. Además, el método de destinatario ofrece la comodidad opcional de ser completamente manual, semimanual y totalmente automatizado. Por el contrario, el método de cinta manual requiere una colocación cuidadosa y suave de cada núcleo a mano utilizando una púa de aguja. Aunque la ausencia de un molde prefabricado en el método de cinta impide la colocación y separación altamente regulares experimentadas con el método receptor, esta deficiencia se supera mediante la inclusión de una rejilla a cuadros. Es importante que la rejilla a cuadros se fije en el centro de la bandeja de metal para evitar la colocación del borde del bloque, lo que aumenta el riesgo de pérdida del núcleo si no hay suficiente parafina que mantenga el núcleo en su lugar. También debe tenerse en cuenta que las pequeñas separaciones de núcleos posibles con el método receptor no se pueden lograr con el método de cinta debido a la colocación manual del núcleo y la necesidad de que la selección de la aguja encaje entre los núcleos adyacentes. Los núcleos se colocan de manera erecta independiente con la menor superficie o huella del núcleo que entra en contacto con la rejilla cubierta por DSST. Esta configuración proporciona significativamente menos estabilidad del núcleo que el método receptor y confiere un mayor riesgo de derribo del núcleo y/o migración al verter la parafina fundida. De hecho, uno de los pasos más críticos en el protocolo es verter la parafina fundida. Es esencial que esto se haga rápidamente al retirarla del horno para garantizar que la parafina sea completamente líquida y que el vertido se realice suavemente con una turbulencia mínima. Curiosamente, Chen et al. desarrollaron un dispositivo auxiliar altamente novedoso, similar a una plantilla con orificios de 7 x 11 distribuidos uniformemente de 2 mm de diámetro, que se coloca sobre un bloque de parafina en blanco para guiar las agujas al crear el bloque receptor y al insertar los núcleos del bloque donante23. Aunque está diseñado para ayudar a la construcción de bloques receptores, dicho dispositivo podría adaptarse fácilmente al método de cinta para guiar la colocación, regular la separación y aumentar la estabilidad del núcleo durante el proceso de construcción.
Uno de los efectores más importantes de la estabilidad del núcleo es el número de núcleos incluidos en un método de cinta TMA. Esto se debe a que a medida que aumenta el número de núcleos, el diámetro del núcleo debe reducirse para acomodar el creciente número de núcleos, lo que a su vez reduce la huella del núcleo que se adhiere al DSST. Se recomienda un diámetro mínimo del núcleo de 1 mm para la construcción de TMA con método de cinta, ya que hemos encontrado que los núcleos con diámetros más pequeños son particularmente inestables y propensos a derrumbarse incluso con un vertido de parafina muy suave. Un estudio reciente que investigó dos métodos internos diferentes que utilizaron agujas de 16 G (diámetro del núcleo de 1,1 mm) y un punzón de 4 mm de diámetro experimentó pérdidas sustanciales de tejido con los 1,1 mm (26,5%) pero no con los núcleos de 4 mm24. Esto parece indicar que los núcleos pequeños pueden ser problemáticos para trabajar y no solo durante la construcción. Además, los diámetros más pequeños pueden no representar el bloque original del donante, así como los núcleos más grandes, lo que dificulta la interpretación patológica y aumenta la probabilidad de una representación inexacta del tejido del donante.
La inclusión y colocación de bloques de orientación es de profunda importancia en la construcción de TMA. Sin embargo, esto es de particular importancia para los TMA construidos por el método de cinta. Esto se debe al hecho de que el método de cinta invierte el proceso de construcción, lo que aumenta el riesgo de desorientación espacial. Aconsejamos incluir hasta tres núcleos de orientación en cada bloque, y que se coloquen lejos de los núcleos de muestra para orientar mejor el bloque. Los núcleos de orientación pueden ser núcleos tomados de bloques de tejido que contienen tejidos claramente diferentes del tema de la TMA construida o herramientas de orientación de color libre de tejido21, donde esta última es particularmente útil para los no patólogos. Combinados con la colocación de núcleos con patrones de matriz no regulares, los núcleos de orientación minimizan el riesgo de desorientación.
La pronunciada diferencia en la longitud del núcleo entre los TMA construidos utilizando la cinta y los métodos receptores se deriva de la inclusión de la profundidad del bloque donante en el proceso de toma de decisiones al seleccionar el método de construcción. El protocolo descrito aquí emplea un umbral donde los TMA se construyen utilizando los métodos de cinta y receptor cuando los bloques del donante tienen profundidades de <4 mm y 4 mm, respectivamente. Es importante tener en cuenta que la inclusión de la profundidad del bloque donante en la elección del método de construcción no es universal. Aunque es posible que los TMA se construyan utilizando cualquiera de los métodos, independientemente de la profundidad del bloque donante, los núcleos más altos pueden interferir con, y o ser derribados o inclinados por, la colocación del cassette de plástico durante la construcción de TMA utilizando el método de cinta. La elección de incluir u omitir criterios en el proceso de toma de decisiones depende de las comodidades disponibles para el laboratorio, el costo y el producto final deseado. Bajo los parámetros de este protocolo, el número de secciones TMA montadas en diapositivas que se pueden obtener de un método de cinta construido TMA es significativamente menor que el obtenido de un método receptor construido TMA. Aunque es posible volver a bloquear los tejidos FFPE para aumentar la profundidad del bloque donante y hacerlos compatibles con el método receptor, la probabilidad de lograr la misma orientación tisular dentro del rebloqueo es baja. A su vez, esto puede requerir una extensa cara de bloque para obtener una sección de cara completa, lo que probablemente incluiría una pérdida significativa de tejido. Después de la orientación del bloque, un método de cinta construido TMA produce aproximadamente 50 secciones TMA montadas en diapositivas con todos los núcleos presentes. Sin embargo, el número exacto variará de un bloque a otro y depende de la longitud de los núcleos utilizados para construir el TMA y del grosor de las secciones que se cortan (5 μm frente a 4 μm). Además, también debe tenerse en cuenta que debido a sus diferentes longitudes de núcleo, los núcleos se agotarán en diferentes momentos a medida que el TMA se seccione progresivamente; un atributo que vuelve a enfatizar la necesidad de una revisión patológica continua.
Aunque el método receptor ofrece beneficios y ventajas significativos sobre el método de cinta, incluidos procesos de construcción menos tediosos y más expeditivos, el método de cinta no está dirigido a laboratorios experimentados de alto rendimiento. Está dirigido al laboratorio promedio, particularmente a aquellos en entornos de recursos limitados, con acceso a bloques de donantes de profundidades variables, pero no a los servicios de construcción de TMA. Sin embargo, las aplicaciones futuras podrían ver la automatización de este método para mejorar el grupo de muestras elegibles en laboratorios de alto rendimiento y eliminar la necesidad de volver a bloquear los bloques de donantes. En conclusión, el protocolo de construcción del método de cinta TMA descrito se puede establecer fácilmente en laboratorios no especializados sin la necesidad de equipos costosos. Sin embargo, se aconseja que los nuevos usuarios deben emplear bloques de tejido FFPE sin valor, herramientas de orientación de color libre de tejido21 o incluso bloques de parafina de color sin tejido al principio para familiarizarse con la técnica del método de cinta antes de avanzar a la construcción de TMA utilizando tejidos preciosos. Aunque su construcción no está exenta de peligros potenciales, que tanto aquellos que construyen como usan bloques TMA deben tener en cuenta, este método de construcción TMA "casero" aparentemente sin pulir puede producir TMA de alta calidad y biológicamente relevantes para la investigación. De hecho, las secciones de TMA derivadas de TMA construidas con método de cinta se encuentran entre una de las muestras de tejido más solicitadas en el biorepositorio ACSR.
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
El financiamiento para este trabajo fue proporcionado por el biorepositorio (ACSR) financiado por los NIH AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) (www.acsr1.com), UM1CA181255.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. BioTechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Jawhar, N. M. Tissue microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Annals of Saudi Medicine. 29 (2), 123-127 (2009).
- Fowler, C. B., et al. Tissue microarrays: construction and uses. Methods in Molecular Biology. 724, 23-35 (2011).
- Voduc, D., Kenney, C., Nielsen, T. O. Tissue microarrays in clinical oncology. Seminars in Radiation Oncology. 18 (2), 89-97 (2008).
- Vogel, U. Overview on techniques to construct tissue arrays with special emphasis on tissue microarrays. Microarrays (Basel). 3 (2), 103-136 (2014).
- Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjostedt, E., Ponten, F. Production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas. Journal of Visualized Experiments. (63), e3620 (2012).
- Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. Journal of Visualized Experiments. (91), e51893 (2014).
- Pires, A. R., Andreiuolo Fda, M., de Souza, S. R. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology. 1, 14 (2006).
- Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 28 (4), 325-330 (2020).
- Wilkens, L. Verfahren und Vorrichtung zur Präparation von Gewebeproben (Method and Apparatus for the Preparation of Tissue Samples). German patent DE. 102, 102 03 524 A1 (2003).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue microarrays. Methods in Molecular Biology. 1381, 53-65 (2016).
- Bubendorf, L., Nocito, A., Moch, H., Sauter, G. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for high-throughput in situ studies. The Journal of Pathology. 195 (1), 72-79 (2001).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ahn, S., Woo, J. W., Lee, K., Park, S. Y. HER2 status in breast cancer: changes in guidelines and complicating factors for interpretation. Journal of Pathology and Translational Medicine. 54 (1), 34-44 (2020).
- Fukumoto, H., Kanno, T., Hasegawa, H., Katano, H. Pathology of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Frontiers in Microbiology. 2, 175 (2011).
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 4 end. 2, 449-452 (2017).
- Ramsower, C., et al. Assessment of 2-year storage conditions on protein, RNA, and DNA in unstained human tissue sections, including a novel multiplex digital gene expression profiling method with implications for biobanking. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Weiss, L. M., Chen, Y. Y. EBER in situ hybridization for Epstein-Barr virus. Methods in Molecular Biology. 999, 223-230 (2013).
- Yang, Y., DeYoung, B., Qasem, S. 314 vimentin stain: A useful stain or an ancient change. American Journal of Clinical Pathology. 149, suppl_1 135 (2018).
- Battifora, H. Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology. 96 (5), 669-671 (1991).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the correct tissue every time in multi-tissue blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Fedor, H. L., De Marzo, A. M. Practical methods for tissue microarray construction. Methods in Molecular Medicine. 103, 89-101 (2005).
- Chen, Y. J., et al. An introduction of an easy-operating and economical technique for tissue microarray preparation. Journal of Clinical Pathology. 73 (7), 403-407 (2020).
- Gomez-de Maria, C., et al. Tissue arrays: Two simple and economical methods for manual construction. Archivos Espanoles de Urologia. 71 (10), 832-839 (2018).
