Summary
Ce protocole décrit la méthode du ruban adhésif sur la façon de construire manuellement un microréseau tissulaire à l’aide de blocs de donneurs FFPE de différentes profondeurs.
Abstract
Le microréseau tissulaire (TMA) est un outil de recherche important dans lequel de nombreux échantillons de paraffine fixe de formol incorporés (FFPE) peuvent être représentés dans un seul bloc de paraffine. Ceci est réalisé en utilisant des noyaux tissulaires extraits de la région d’intérêt de différents blocs FFPE donneurs et en les organisant en un seul bloc de paraffine TMA. Une fois construites, des sections de la TMA terminée peuvent être utilisées pour effectuer des études d’immunohistochimie, de chromogénique, d’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et d’ISH d’ARN afin d’évaluer l’expression des protéines ainsi que les altérations génomiques et transcriptionnelles dans de nombreux échantillons simultanément, minimisant ainsi l’utilisation des tissus et réduisant les coûts des réactifs. Il existe plusieurs techniques de construction TMA différentes. L’une des méthodes de construction les plus courantes est la méthode du récepteur, qui fonctionne mieux avec des noyaux de même longueur pour lesquels une longueur minimale de 4 mm est recommandée. Malheureusement, les blocs tissulaires peuvent être fortement réséqués au cours du processus de diagnostic, ce qui entraîne souvent des épaisseurs de blocs de donneur « non idéales » inférieures à 4 mm. L’article et la vidéo actuels se concentrent sur la méthode du ruban adhésif double face; une méthode manuelle alternative, peu coûteuse, facile à utiliser et rapide pour construire des TMA à faible densité (<50 cœurs) qui est hautement compatible avec ces blocs donneurs non idéaux. Ce protocole fournit un guide étape par étape sur la façon de construire un AMT à l’aide de cette méthode, en mettant l’accent sur l’importance critique de l’examen pathologique et de la validation post-construction.
Introduction
Les tissus fixés à la paraffine de formol (FFPE) sont largement utilisés dans les études morphologiques et immunohistochimiques d’expression des protéines1. Cependant, la recherche de découverte nécessite souvent l’examen de plusieurs marqueurs sur un grand nombre de tissus, ce qui peut épuiser des tissus précieux. Introduit dans les années 1980, le microréseau tissulaire (TMA) est un outil de recherche important qui rassemble de petites régions exemplaires d’intérêt de nombreux blocs de tissus FFPE différents en un seul bloc de paraffine, permettant l’examen de plusieurs échantillons de tissus simultanément2. Ainsi, les ATM évitent l’utilisation excessive d’échantillons de tissus très précieux et souvent rares, tout en réduisant les coûts associés à la réalisation d’applications en aval sur de nombreux échantillons individuels 3,4.
Plusieurs techniques différentes existent pour la construction desATM 5, y compris les approches automatisées et semi-manuelles 6,7. La majorité de ces dernières approches utilisent la méthode du receveur, dans laquelle des noyaux de tissus perforés à partir de blocs de donneurs sont insérés dans un moule préfabriqué. Cependant, il est recommandé d’utiliser des blocs donneurs « idéaux » d’au moins 4 mm d’épaisseur pour cette méthode 6,7. Malheureusement, les blocs de donneurs, en particulier ceux qui ont été largement sectionnés à des fins de diagnostic clinique avant d’être mis à la disposition de la recherche, ont souvent moins de 4 mm d’épaisseur, ce qui pourrait les exclure de l’utilisation dans la construction de TMA en utilisant la méthode du receveur, si la réintégration pour atteindre une profondeur de 4 mm n’est pas possible ou souhaitable. De plus, ces procédures peuvent souvent utiliser un microréseau de tissu manuel de paillasse ou des instruments automatisés coûteux qui ne sont pas facilement accessibles ou abordables pour le laboratoire de recherche moyen. En revanche, la méthode du ruban adhésif double face ou méthode du ruban adhésif est une méthode de construction manuelle TMA compatible avec les blocs donneurs non idéaux qui utilise des microréseaux à tissus portatifs peu coûteux, largement disponibles, réutilisables ou jetables 8,9,10. Cette méthode inverse le processus de construction en coulant le bloc autour de noyaux verticaux inversés qui, une fois terminés, sont affleurants avec le haut du TMA, quelle que soit la longueur du noyau. Par conséquent, tous les échantillons sont présents dans les sections TMA lors de la première section, ce qui permet au constructeur de tirer le meilleur parti de ces blocs non idéaux dès le départ. Ainsi, la méthode du ruban adhésif représente une alternative rentable et réalisable pour les laboratoires de recherche non spécialisés.
La construction de la TMA n’est pas sans défis, et il faut faire preuve de prudence lors de la sélection des régions tissulaires dont extraire les noyaux, ce qui fait de l’examen pathologique un élément essentiel du processus de construction de la TMA11,12. Ainsi, ce protocole vise à souligner l’importance profonde de l’examen pathologique dans la construction de l’AMT en soulignant certains des pièges pathologiques associés à la construction de l’AMT dont les personnes qui construisent et utilisent des AMT devraient être au courant, et pourquoi l’examen de la pathologie devrait se poursuivre tout au long de la durée de vie d’un bloc d’AMT.
Ce protocole décrit les mesures prises au Laboratoire de base technique de la AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) pour construire des ATM à partir de blocs de donneurs non idéaux à l’aide de la méthode de la bande; où l’ACSR est un biodépôt financé par les NIH dédié à la collecte et à la distribution équitable d’échantillons biologiques à partir de tissus cancéreux du VIH afin de promouvoir la recherche sur la malignité du VIH.
Protocol
Tous les blocs donneurs ont été désidentifiés lors de la collecte et utilisés pour la construction de TMA conformément aux protocoles IRB approuvés de la Mayo Clinic (PR16-000507 et PR2207-02).
1. Examen de la pathologie
- Récupérer les blocs de donneurs de tissus FFPE à utiliser dans la construction de la TMA.
- Soumettez une lame13 chromée d’hématoxyline et d’éosine (H & E) fraîchement générée pour chaque bloc de donneur de tissu FFPE sélectionné pour examen histologique par un pathologiste certifié par le conseil d’administration afin de confirmer le diagnostic et d’annoter le tissu.
REMARQUE: La coloration H & E peut être effectuée à l’interne ou envoyée à un laboratoire de services de base pathologique pour coloration, comme c’était le cas dans ce protocole. L’un des concepts les plus importants à retenir lors de la construction des ATM est que les tissus dans les blocs donneurs FFPE sont des structures en 3 dimensions (3D) dont la forme, le contenu tumoral et la viabilité des tissus peuvent changer considérablement avec l’augmentation de la profondeur des blocs. Le pathologiste doit déterminer, sur la base de l’examen de la section de tissu coloré H & E, qui est une représentation en 2 dimensions du tissu 3D, la meilleure région pour extraire le noyau de tissu. - Au cours de l’examen histologique, assurez-vous que le pathologiste identifie et annote les tissus d’intérêt ou non d’intérêt sur les lames colorées H & E. Pour annoter la diapositive, suivez les étapes ci-dessous.
- Utilisez un stylo de marquage à glissière pour encercler le tissu d’intérêt.
- À l’aide du même stylo de marquage, effacez les zones de la région encerclée qui doivent être évitées.
- Utilisez le stylo de marquage pour marquer les zones jugées idéales pour l’échantillonnage et l’extraction des carottes.
REMARQUE: Il est important de se rappeler que la forme et la composition des tissus peuvent changer avec la profondeur des tissus dans le bloc. Ainsi, la composition du noyau tissulaire peut changer en fonction de l’endroit où le noyau a été extrait, ce qui souligne la nécessité d’un guidage pathologique continu. - Soumettre des tissus supplémentaires pour les taches immunohistochimiques spécifiques à la maladie aux côtés des H & E, si nécessaire, pour aider à l’examen pathologique. Des exemples de telles taches comprennent la coloration ERBB2 pour le cancer du sein HER2 positif14, HHV-8 pour le sarcome de Kaposi15, CD20 pour les lymphomes à cellules B16, U6 comme marqueur mondial pour la qualité de l’ARN17, EBER pour déterminer la positivité du virus d’Epstein-Barr18 et Vimentin comme confirmation des origines mésenchymateuses et marqueur de contrôle de la qualité des tissus19,20.
2. Préparation à la construction de TMA
- Une fois l’examen de la pathologie terminé, compilez la liste finale des blocs donneurs à utiliser dans la construction de l’AMT et créez une carte de l’AMT (Figure 1A). La carte de l’AMT est un schéma décrivant où les carottes seront situées dans l’AMT complétée et les échantillons de tissus montés sur lame obtenus à partir de l’AMT résultante.
- À des fins d’orientation, assurez-vous que la carte TMA évite de placer les noyaux dans une matrice paire telle qu’une matrice 3 x 3 ou 4 x 4 et comprend au moins 1 marqueur d’orientation.
REMARQUE: Les noyaux d’orientation peuvent être des noyaux prélevés à partir d’outils d’orientation colorés sans tissu21, ou des blocs de tissus contenant des tissus distinctement différents du thème de la TMA. Contrairement à la méthode du receveur où des noyaux verticaux sont insérés dans un moule en cire préfabriqué, la méthode du ruban crée un TMA en versant de la cire fondue autour de noyaux inversés et érigés. Cette inversion du processus de construction nécessite une deuxième carte connue sous le nom de carte de construction. - Créez la carte de construction en créant une image miroir de la carte TMA (Figure 1B). La carte de construction indique où chaque carotte doit être placée pendant la construction afin d’apparaître au bon endroit dans la TMA terminée. Enregistrez la carte de construction.
- Une fois les cartes créées, préparez le moule de base TMA en métal. Utilisez une grille à carreaux de papier jetable pour guider le placement du noyau et réguler la séparation du noyau.
REMARQUE: Une grille de gabarit de 6 x 7 (42 points) pour un maximum de 40 cœurs (plus pour deux noyaux / espaces d’orientation) à utiliser avec des moules de base métalliques disponibles dans le commerce avec des dimensions internes de 26 mm x 20 mm est fournie dans le pdf supplémentaire. Imprimez et découpez la grille de papier. - Coupez la grille à carreaux à la taille et fixez un morceau de ruban adhésif double face (DSST) à l’arrière de la grille. Placez la grille et le ruban DSST dans le bac métallique et ajoutez un deuxième morceau d’heure d’été sur le dessus de la grille, c’est-à-dire sur le dessus de la grille de papier dans le moule de base métallique (Figure 2A).
3. Placement de base
- Superposez le H&E pathologiquement examiné sur son bloc tissulaire correspondant et utilisez les marques du pathologiste pour identifier où le bloc tissulaire doit être perforé (Figure 2B).
- Poinçonnez le bloc donneur FFPE à l’aide d’un poinçon à noyau manuel (Figure 2C) à l’endroit approprié.
REMARQUE: Les poinçons à noyau sont disponibles dans une variété de diamètres. Cette méthode utilise un poinçon de noyau portatif de 2 mm de diamètre.- Si vous utilisez un poinçon réutilisable, assurez-vous qu’il est nettoyé avant et après chaque poinçon de tissu.
- Éjectez le noyau du poinçon du noyau et utilisez un pic à aiguille pour placer le noyau éjecté sur le réticule de la grille couverte d’heure d’été (Figure 2D). Assurez-vous que lorsque le noyau est placé sur la grille, il est inversé et droit de sorte que l’extrémité tissulaire du noyau entre en contact avec le DSST (tissu-face vers le bas). Assurez-vous également que le noyau est placé à la position appropriée sur la grille, comme indiqué sur la carte de construction.
- Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les blocs donneurs soient carottés et que les noyaux soient placés à leur position appropriée.
4. Remplir la TMA
- Allumez le four de paillasse, réglé à 78 °C, et prévoyez suffisamment de temps pour atteindre la température.
- Pour chaque TMA à construire, faire fondre 45 g de granulés de paraffine dans un récipient à l’épreuve du four.
- Étiquetez une cassette en plastique et placez-la sur le moule de base métallique contenant les noyaux (Figure 2E). La hauteur des noyaux ne doit pas dépasser la profondeur du plateau métallique car les noyaux hauts seront inclinés ou renversés lorsque la cassette sera mise en place.
- Placez le moule avec la cassette sur un plateau pour attraper le débordement et versez doucement la paraffine fondue à travers la cassette dans le plateau de noyaux (Figure 2F).
- Laissez la paraffine fondue déborder pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le corps de la TMA. Assurez-vous que la paraffine se remplit jusqu’au sommet de la cassette afin qu’elle soit intégrée et fermement liée au bloc de paraffine une fois que la paraffine s’est solidifiée.
- Ne déplacez ni ne dérangez le bloc et laissez-le refroidir à température ambiante pendant 30 min. Ensuite, réfrigérer à 4 °C pendant 30 minutes supplémentaires pour solidifier complètement.
- Une fois complètement solidifié, séparez délicatement le moule de base en métal du bloc de noyaux de paraffine relié à la cassette.
REMARQUE: Le DSST conserve son caractère adhésif tout au long du processus de construction et est fréquemment attaché au bloc de paraffine nouvellement formé. Le cas échéant, retirez délicatement l’heure d’été et la grille du haut du bloc TMA maintenant terminé.
5. Validation de la TMA
- Une fois la TMA construite, utilisez un microtome pour sectionner la TMA nouvellement achevée. Coupez une ou plusieurs sections de tissu pleine face.
- Transférez les sections au bain-marie préavertissé et montez les sections sur glissière.
REMARQUE: Les blocs nouvellement construits nécessitent souvent un revêtement de bloc (coupe de l’excès de paraffine) afin d’obtenir des sections complètes de tissu du visage contenant tous les noyaux. - Une fois sec, soumettez une section TMA fraîchement coupée montée sur glissière pour la coloration H & E13 et toute coloration immunohistochimique supplémentaire, si nécessaire.
- Soumettez les sections TMA H & E colorées pour examen pathologique.
REMARQUE: Au cours de l’examen de la pathologie TMA, un pathologiste certifié par le conseil, de préférence le même pathologiste qui a examiné les blocs de donneurs TMA, examine les noyaux colorés TMA H & E pour s’assurer que les tissus d’intérêt souhaités sont effectivement présents. Si des colorations immunohistochimiques tissulaires ou spécifiques à une maladie supplémentaires ont été soumises à l’examen du bloc de donneurs à l’étape 1.3.4, ces taches doivent être répétées sur les sections TMA et soumises avec le TMA H & E pour examen pathologique. - Enregistrer les résultats de l’examen de validation pathologique de l’AMT.
Representative Results
La méthode de la bande de construction TMA décrite ici est la méthode de choix utilisée au laboratoire de base technique de l’ACSR pour conserver les tissus, ce qui permet une distribution frugale et équitable des tissus très précieux aux chercheurs.
Un élément essentiel du processus de construction est l’identification du tissu d’intérêt dans un bloc de donneur donné à partir duquel le noyau de TMA doit être obtenu. Ceci est déterminé par un examen pathologique dans lequel un pathologiste qualifié examine une diapositive H&E fraîchement générée (Figure 3). À l’aide d’un marqueur, le pathologiste entoure la zone de la diapositive H&E, ce qui indique que le noyau doit être obtenu à partir du bloc donneur à l’intérieur de ce cercle (Figure 3). Le pathologiste peut également marquer d’autres zones telles que les zones nécrotiques, qui doivent être évitées, ou les zones bénignes à partir desquelles des noyaux tissulaires supplémentaires peuvent être obtenus (figure 3). Les carottes sont ensuite perforées à partir des zones indiquées et incluses dans la construction de la TMA.
Il existe deux mesures principales pour la réussite d’un TMA par la méthode de la bande. Le premier est la présence de points de noyau tissulaire aux positions et aux distances attendues les uns des autres, qui est évaluée par inspection visuelle. La figure 4A,B représente deux TMA de méthode de bande complète et leurs diapositives H&E correspondantes. L’inspection visuelle des blocs TMA montre que les noyaux sont présents et régulièrement espacés dans chaque TMA. Certains des principaux problèmes de construction qui peuvent survenir au cours du processus de construction de la méthode de la bande comprennent la séparation du bloc et de la cassette en raison de l’enlèvement prématuré de la base métallique avant la solidification à la cire (Figure 4C). Un autre problème potentiel observé avec les TMA construits par la méthode sur bande est le renversement du noyau et/ou la dérive de placement des noyaux intégrés (figure 4D); un problème qui peut découler d’un versement excessivement turbulent de la paraffine fondue, qui peut être encore renforcé par une DSST mal adhésive. La figure 5 montre les images H&E pour les cœurs de TMA1. Tous les noyaux sauf un (spot 1) sont présents dans le H&E de TMA1. La figure 5 montre également que certains noyaux sont présents sous forme de points tissulaires circulaires complets (c.-à-d. les points 4, 6, 13, 17) tandis que d’autres ne sont pas complètement présents (c.-à-d. les points 3, 8, 9, 12). La perte tissulaire subie dans ces derniers cas n’est pas rare et peut être due à une section insuffisante nécessaire pour révéler tous les noyaux dans leur intégralité. Alternativement, la présence de tissu incomplet ou l’absence totale de tissu (c.-à-d. la tache 1) peut provenir d’une mauvaise qualité tissulaire de ce noyau, ce qui peut entraîner une perte de tissu pendant le processus de coloration.
La deuxième mesure du succès est évaluée en fonction de la question de savoir si les noyaux d’AMT ont capturé ou non le tissu d’intérêt. Ceci est réalisé par l’examen pathologique et la validation des noyaux H & E TMA individuels (Figure 5) par rapport au bloc de donneur pré-perforé H & E (Figure 3), et si nécessaire / effectué toute autre coloration immunohistochimique supplémentaire effectuée. La figure 6 illustre des taches exemplaires effectuées sur TMA1, notamment Vimentin, U6, EBER et CD20. Les tissus vimentine positifs (coloration brune) indiquent que tous les tissus sont d’origine mésenchymateuse et sont de bonne qualité qui peuvent être colorés. La positivité U6 (coloration violet foncé/ bleu) indique que la qualité de l’ARN dans le tissu est bonne et complète les taches d’hybridation in situ de l’ARN (ISH) telles que EBER, qui ciblent les transcriptions de gènes. Les résultats U6 de la figure 5 indiquent que la qualité de l’ARN est élevée dans le tissu du lymphome (point 9) et le contrôle normal de l’orientation du tissu des amygdales (point 22), mais pas dans le tissu normal au point 19. Suite à cette coloration EBER était négative dans le tissu normal et le contrôle de l’orientation, mais fortement positive dans le tissu du lymphome (point 9). Comme prévu pour les tissus d’origine lymphoïde, les taches 9 et 22 se sont élevées positivement pour le marqueur de cellules B CD20, mais la tache 19, qui provient du tissu normal de la moelle épinière, ne l’a pas fait. Les résultats de coloration pour tous les noyaux de TMA sont résumés dans le tableau 1 et confirment l’annotation tissulaire pour ces noyaux de tissu TMA.
Figure 1 : Cartes TMA. Une fois que tous les blocs FFPE et les contrôles d’orientation ont été sélectionnés, une carte détaillée, appelée carte TMA (A), décrivant où chaque noyau de bloc donneur sera situé dans le bloc fini est créée. Il est important de noter que lors de la construction d’un TMA à l’aide de la méthode de la bande, la carte de construction (B) est une image miroir de la carte TMA car cette méthode inverse le processus de construction, versant de la paraffine fondue autour des noyaux de tissu verticaux plutôt que d’insérer les noyaux dans un moule préfabriqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Construction de la TMA à l’aide de la méthode du ruban adhésif. (A) Couche 2 de ruban adhésif double face (DSST) et une grille de papier dans l’ordre suivant au fond du moule de base métallique; placez le premier morceau de DSST (insert 2A), suivi de la grille de papier jetable, puis le deuxième morceau de DSST au fond du moule de base en métal. (B) Pour chaque bloc de donneurs, un nouveau H & E est généré et examiné par un pathologiste qui marque le H & E pour indiquer le tissu d’intérêt, où frapper le bloc et, le cas échéant, où éviter de poinçonner pour extraire un noyau de tissu. (C) Poinçonnez le bloc donneur avec un poinçon TMA portatif d’élimination ou réutilisable. (D) À l’aide d’un pic à aiguille, chaque noyau est placé debout, la tumeur face cachée sur le DSST couvrant la grille. (E) Placer soigneusement une cassette en plastique pré-étiquetée sur le plateau métallique contenant les noyaux verticaux. (F) La paraffine fondue est doucement versée dans le plateau à travers le réseau de la cassette pour entourer et immerger les noyaux verticaux sous la cassette. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Tache H&E du bloc donneur. Les sections colorées H & E de chaque bloc de donneurs sont soumises à un examen QC avec un pathologiste de formation qui annote la lame colorée H & E avec un marqueur pour indiquer les zones / tissus d’intérêt (c.-à-d. cancer viable (CA) ou tissus bénins (BN)) pour la collecte du noyau, ainsi que les zones qui devraient être évitées (c.-à-d. zones de tissu nécrotique). Les zones appropriées du bloc tissulaire, comme l’indique le H&E annoté, sont ensuite identifiées, poinçonnées et incorporées dans la TMA en cours de construction. Le poinçon de noyau TMA H&E résultant peut ensuite être référencé à la zone non frappée du bloc donneur H&E pour confirmer que le tissu d’intérêt a été capturé dans le poinçon de noyau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats représentatifs. (A,B) TMA de la méthode de bande complétée avec succès et leurs H&E d’accompagnement pour examen pathologique. (C) Séparation de la cassette en plastique et du bloc de paraffine lorsque la cassette est retirée prématurément du moule de base en métal. (D) Méthode de bande complétée TMA montrant des noyaux renversés et migrés résultant d’un coulage turbulent de la paraffine fondue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : H&E de base de la TMA. Section colorée H & E pour TMA1, montrant les H & E individuels pour chaque noyau de tissu utilisé pour construire le TMA (points 1-21) ainsi que les noyaux d’orientation (points 22 et 23). Les images montrées ont été obtenues à l’aide d’un objectif 4x, équipé d’un appareil photo numérique connecté au logiciel d’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Exemple d’IMMUNOHistochimique et d’ARN ISH. Les coupes complètes du visage de TMA1 ont été évaluées par l’IHC pour l’expression de la vimentine et du CD20 et par l’ARN ISH pour évaluer la qualité de l’ARN (U6) et le statut EBV via EBER ISH. Les images montrent des images exemplaires pour trois noyaux, dont un tissu tumoral (point 9), un tissu normal (point 19), ainsi que l’un des deux contrôles d’orientation (point 22). La positivité vimentine est indiquée par une coloration brune, la positivité U6 est désignée par une coloration bleue / violette, EBER par une coloration bleue / violette et CD20 par une coloration brune. Les images montrées ont été obtenues à l’aide d’un objectif 4x, équipé d’un appareil photo numérique connecté au logiciel d’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Aperçu des tissus et des taches TMA construits : Le tableau indique si (a) le tissu est présent ou non dans chacune des taches représentatives de la TMA (b) la tumeur est présente dans chaque tache tissulaire colorée H & E et (c) les résultats de toute coloration immunohistologique supplémentaire effectuée sur les sections adjacentes de TMA: « - » indique négatif, n / d = non fait. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Dossier supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
L’un des composants les plus critiques du processus de construction de l’AMT est l’examen pathologique des blocs donneurs de FFPE à partir desquels les noyaux d’AMT seront obtenus4. Au cours de l’examen, un pathologiste certifié par le conseil d’administration examine une section représentative de tissus colorés H & E de chaque bloc de donneurs. Il est impératif que le H & E soit généré à l’aide d’une section de tissu fraîchement coupée afin qu’il soit la meilleure représentation de son bloc de donneur correspondant. L’utilisation de H&E plus anciens n’est pas recommandée étant donné que les tissus FFPE sont des structures en 3 dimensions dont le profil tissulaire peut changer de manière significative avec la profondeur du bloc et une section étendue; cela peut s’être produit depuis que le H& E a été généré, ce qui pourrait rendre sa représentation du bloc FFPE inexacte. Le processus d’examen est essentiel pour la sélection des cas appropriés et l’identification des zones tissulaires à partir desquelles les carottes devraient être obtenues, ainsi que pour l’identification des zones à éviter lors de la collecte des carottes. En l’absence d’examen pathologique, la probabilité d’inclure des tissus inappropriés augmente considérablement. L’inclusion de tels tissus a le potentiel de rendre la TMA construite inefficace et impropre à l’usage auquel elle est destinée. Il est important de noter que l’utilisation sans le savoir de tels ATM inefficaces a un énorme potentiel pour entraîner des données fausses et trompeuses. Ceci, combiné à la connaissance que le profil des tissus FFPE, et donc de leurs noyaux dérivés, peut changer de manière significative avec une profondeur croissante, souligne l’importance d’un examen pathologique continu tout au long de la durée de vie d’un bloc TMA construit. Idéalement, les H&E devraient être générés à l’aide de chaque15e ou20e section pour s’assurer que tout changement dans les profils tissulaires des carottes est capturé et enregistré. Au minimum, les H&E devraient être générés et examinés au début et à la fin d’un projet pour surveiller ces changements potentiels. À la lumière de ces points et de l’importance de la TMA en tant qu’outil de recherche, il est impératif que l’examen pathologique soit fermement ancré dans le processus de construction de la TMA et tout au long de la vie du bloc TMA.
Les blocs FFPE sont souvent largement sectionnés lors du traitement diagnostique de routine avant d’être libérés à des fins de recherche. En conséquence, la profondeur du bloc donneur et donc la longueur du noyau du bloc donneur sont souvent inférieures à la méthode de prélèvement idéale de 4 mm. Ici, nous avons démontré comment construire des TMA en utilisant le protocole de construction de la méthode de bande, dont le principal avantage est sa compatibilité avec les noyaux de blocs de tissu FFPE non idéaux. Bien que la méthode de la bande soit d’une grande valeur de recherche et offre une méthode peu coûteuse, pratique et accessible pour construire des blocs TMA, elle n’est pas sans défis et limites. Par rapport aux méthodes de réception automatisées et manuelles, qui peuvent accueillir 100 à 1 000 cœurs dans un seul bloc TMA, un maximum de 40 cœurs est recommandé pour les TMA construits à l’aide de la méthode de bande9. Une autre limite concerne la facilité de construction. Dans la méthode du récepteur, les noyaux perforés sont simplement insérés dans un moule préfabriqué, qui assure la stabilité du noyau en enveloppant chaque noyau dans son propre puits individuel, empêchant ainsi la migration du noyau et favorisant un placement et une séparation très réguliersdu noyau 22. De plus, la méthode du destinataire offre la commodité optionnelle d’être entièrement manuelle, semi-manuelle et entièrement automatisée. En revanche, la méthode du ruban adhésif manuel nécessite un placement soigneux et doux de chaque noyau à la main à l’aide d’un pic à aiguille. Bien que l’absence d’un moule préfabriqué dans la méthode du ruban empêche le placement et la séparation très réguliers de la méthode réceptrice, cette lacune est surmontée par l’inclusion d’une grille à carreaux. Il est important que la grille à carreaux soit fixée au centre du plateau métallique afin d’éviter le placement du bord du bloc, ce qui augmente le risque de perte du noyau s’il n’y a pas suffisamment de paraffine pour maintenir le noyau en place. Il convient également de noter que les petites séparations de noyaux possibles avec la méthode du receveur ne peuvent pas être réalisées avec la méthode du ruban en raison du placement manuel du noyau et de la nécessité pour le pic à aiguille de s’adapter entre les noyaux adjacents. Les noyaux sont placés de manière érigée et autoportante avec la plus petite surface ou empreinte du noyau en contact avec la grille couverte d’heure d’été. Cette configuration offre une stabilité du noyau nettement inférieure à celle de la méthode du récepteur et confère un risque accru de renversement du noyau et / ou de migration lors du versement de la paraffine fondue. En effet, l’une des étapes les plus critiques du protocole consiste à verser la paraffine fondue. Il est essentiel que cela se fasse rapidement lors du retrait du four pour s’assurer que la paraffine est complètement liquide et que la coulée est effectuée doucement avec un minimum de turbulence. Fait intéressant, Chen et al. ont développé un dispositif auxiliaire très novateur, semblable à un pochoir avec 7 x 11 trous de 2 mm de diamètre répartis uniformément, qui est placé sur un bloc de paraffine vierge pour guider les aiguilles lors de la création du bloc receveur et lors de l’insertion des noyaux du bloc donneur23. Bien que conçu pour faciliter la construction du bloc bénéficiaire, un tel dispositif pourrait facilement être adapté à la méthode du ruban adhésif pour guider le placement, réguler la séparation et augmenter la stabilité du noyau pendant le processus de construction.
L’un des effecteurs les plus importants de la stabilité du noyau est le nombre de cœurs inclus dans une méthode de bande TMA. En effet, à mesure que le nombre de cœurs augmente, le diamètre du noyau doit diminuer afin de s’adapter au nombre croissant de cœurs, ce qui réduit l’empreinte du cœur adhérant à l’heure d’été. Un diamètre de noyau minimum de 1 mm est recommandé pour la construction TMA par méthode de bande, car nous avons constaté que les noyaux de plus petits diamètres sont particulièrement instables et enclins à basculer même avec un coulage de paraffine très doux. Une étude récente portant sur deux méthodes internes différentes utilisant des aiguilles de 16 G (diamètre du noyau de 1,1 mm) et un poinçon de 4 mm de diamètre a subi des pertes tissulaires substantielles avec les noyaux de 1,1 mm (26,5%) mais pas de 4 mm24. Cela semble indiquer que les petits noyaux peuvent être problématiques à travailler et pas seulement pendant la construction. De plus, les plus petits diamètres peuvent ne pas représenter le bloc de donneur d’origine ainsi que les noyaux plus grands, ce qui rend l’interprétation pathologique difficile et augmente la probabilité d’une représentation inexacte du tissu du donneur.
L’inclusion et le placement des blocs d’orientation sont d’une importance capitale dans la construction de TMA. Cependant, cela revêt une importance particulière pour les TMA construits par la méthode de bande. Cela découle du fait que la méthode du ruban inverse le processus de construction, augmentant ainsi le risque de désorientation spatiale. Nous conseillons d’inclure jusqu’à trois cœurs d’orientation dans chaque bloc, et qu’ils soient placés loin des noyaux d’échantillon afin d’orienter au mieux le bloc. Les noyaux d’orientation peuvent être des noyaux prélevés dans des blocs de tissus contenant des tissus distinctement différents du thème de la TMA construite ou des outils d’orientation sans tissu21, où ce dernier est particulièrement utile pour les non-pathologistes. Combinés à un placement de noyau non régulier à motif matriciel, les noyaux d’orientation minimisent le risque de désorientation.
La différence prononcée de longueur de noyau entre les TMA construits à l’aide des méthodes de bande et de receveur découle de l’inclusion de la profondeur du bloc donneur dans le processus de prise de décision lors du choix de la méthode de construction. Le protocole décrit ici utilise un seuil où les ATM sont construits à l’aide des méthodes de bande et de receveur lorsque les blocs donneurs ont des profondeurs de <4 mm et 4 mm, respectivement. Il est important de noter que l’inclusion de la profondeur du bloc donneur dans le choix de la méthode de construction n’est pas universelle. Bien qu’il soit possible de construire des TMA à l’aide de l’une ou l’autre méthode, quelle que soit la profondeur du bloc donneur, des noyaux plus hauts peuvent interférer avec le placement de la cassette en plastique pendant la construction de la TMA à l’aide de la méthode de la bande. Le choix d’inclure ou d’omettre des critères dans le processus décisionnel dépend des commodités disponibles pour le laboratoire, du coût et du produit final souhaité. Selon les paramètres de ce protocole, le nombre de sections TMA montées sur glissière qui peuvent être obtenues à partir d’une TMA construite par une méthode de bande est nettement inférieur à celui obtenu à partir d’une TMA construite par une méthode réceptrice. Bien qu’il soit possible de rebloquer les tissus FFPE pour augmenter la profondeur du bloc donneur et les rendre compatibles avec la méthode du receveur, la probabilité d’obtenir la même orientation tissulaire dans le reblocage est faible. À son tour, cela peut nécessiter un vaste revêtement de bloc pour obtenir une section complète du visage, ce qui inclurait probablement une perte de tissu importante. Après le parement des blocs, une méthode de bande construite TMA donne environ 50 sections TMA montées sur glissière avec tous les noyaux présents. Cependant, le nombre exact varie d’un bloc à l’autre et dépend de la longueur des carottes utilisées pour construire le TMA et de l’épaisseur des sections à couper (5 μm contre 4 μm). De plus, il convient également de noter qu’en raison de leurs différentes longueurs de noyau, les noyaux s’épuiseront à des moments différents au fur et à mesure que la TMA est progressivement sectionnée; un attribut qui souligne à nouveau la nécessité d’un examen pathologique continu.
Bien que la méthode du récepteur offre des avantages et des avantages significatifs par rapport à la méthode sur bande, y compris des processus de construction moins fastidieux et plus rapides, la méthode sur bande ne s’adresse pas aux laboratoires expérimentés à haut débit. Il s’adresse aux laboratoires moyens, en particulier ceux qui se trouvent dans des environnements aux ressources limitées, ayant accès à des blocs donneurs de profondeurs variables, mais pas aux services de construction de TMA. Cependant, les applications futures pourraient voir l’automatisation de cette méthode afin d’améliorer le pool d’échantillons éligibles dans les laboratoires à haut débit et d’éliminer le besoin de reblocage des blocs donneurs. En conclusion, le protocole de construction de la méthode de bande TMA décrit peut être facilement établi dans des laboratoires non spécialisés sans avoir besoin d’équipement coûteux. Cependant, il est conseillé aux nouveaux utilisateurs d’utiliser des blocs de tissu FFPE sans valeur, des outils d’orientation colorés sans tissu21 ou même des blocs de paraffine colorés sans tissu dans un premier temps afin de se familiariser avec la technique de la méthode du ruban avant de passer à la construction TMA en utilisant des tissus précieux. Bien que leur construction ne soit pas sans pièges potentiels, dont ceux qui construisent et utilisent des blocs TMA devraient être conscients, cette méthode de construction TMA « maison » apparemment non polie peut produire des TMA de haute qualité et biologiquement pertinents pour la recherche. En effet, les sections de TMA issues de TMA construits selon la méthode du ruban adhésif sont parmi les échantillons de tissus les plus demandés dans le biodépôt ACSR.
Disclosures
Nous n’avons rien à divulguer.
Acknowledgments
Le financement de ce travail a été fourni par le biodépôt (www.acsr1.com) AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) financé par les NIH, UM1CA181255.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
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