Summary
جريب الأسنان يحتوي على السكان الظهارية والخلايا الميكنشيمالية. تم اختيار السكان الظهارية من السكان خلية بصيلات الأسنان غير متجانسة من خلال توفير وسيلة ثقافة متميزة. نجت الخلايا الظهارية وشكلت مستعمرات في وسط خال من المصل.
Abstract
تم حصاد بصيلات الأسنان (DF) أثناء إزالة الضرس الثالث المتأثر من قبل جراح الوجه والفكين الفموي. تم إجراء عزل الخلايا الظهارية في يوم حصاد DF. تم غسل DF ثلاث مرات مع DPBS ثم تشريحها بمقص الأنسجة حتى كان للأنسجة اتساق اللب أو السحق. وكانت مجموعات الخلايا الواحدة ت حبيبات بالطرد المركزي وغسلها بمتوسط خال من الخلايا الكيراتينية المصلية. تم توزيع مجموعات الخلايا غير المتجانسة في طبق ثقافي. تم استخدام وسيلة خالية من مصل الكيراتينية لتحديد الخلايا الظهارية. تم تغيير وسيط الثقافة يوميا حتى لم يلاحظ وجود حطام عائم أو خلايا ميتة. ظهرت الخلايا الظهارية في غضون 7-10 أيام بعد توزيع سكان الخلية. نجت الخلايا الظهارية في وسط خال من المصل ، في حين سمح الحد الأدنى من التعديل α المتوسط الأساسي المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ بانتشار الخلايا من نوع mesenchymal. وDF هو مصدر الأنسجة لعزل الخلايا الظهارية الأسنان.
كان الغرض من هذه الدراسة هو وضع طريقة لعزل الخلايا الظهارية عن DF البشري. تم استخدام الرباط اللثة (PDL) لعزل الخلايا الظهارية الأسنان البشرية. شراء الخلايا الظهارية من PDL الإنسان ليست دائما ناجحة بسبب حجم الأنسجة الصغيرة، مما يؤدي إلى انخفاض أعداد الخلايا الظهارية. DF وحدة تخزين أكبر من PDL ويحتوي على خلايا أكثر. DF يمكن أن يكون مصدر نسيج للثقافة الأولية للخلايا الظهارية الأسنان البشرية. هذا البروتوكول أسهل وأكثر كفاءة من أسلوب العزل باستخدام PDL. شراء الخلايا الظهارية الأسنان البشرية قد تسهل المزيد من الدراسات من التفاعلات الظهارية الظهارية الأسنان.
Introduction
يبدأ تكوين الأسنان مع تجويف الظهارة الفموية1. وفقا لمرحلة نمو الأسنان ، فإن الظهارة الفموية لها أسماء مختلفة ، بما في ذلك ظهارة المينا الداخلية والخارجية ، وحلقة عنق الرحم ، وغمد جذر هيرتفيغ الظهاري (HERS). تتصل المقصورات الظهارية بالخلايا الميكنشيمالية المحيطة. التفاعلات الظهارية-الميكنشيمالية تنظم تكوين الأسنان وتجديد الأنسجة. شراء خلايا الظهارية الأسنان، مثل الخلايا القرنية عن طريق الفم وخلايا غمد الجذر الظهارية هيرتفيغ (HERSCs)، أمر بالغ الأهمية لدراسة التفاعلات الظهارية الظهارية الأسنان2.
يتم عزل الخلايا الظهارية الأسنان المشتقة من القوارض من الهيكل الظهاري ، مثل HERS. قام لي وزملاؤه بعزل وخلد الجرذان المشتقة من الأضراس HERSCs بعد حصاد الجزء apical من جراثيم الأسنان النامية من الفئران البالغة من العمر 8 أيام3. تم فصل HERS من الأنسجة apical تحت التكبير. وبالنظر إلى مرحلة نمو الأسنان والعمر ، فإن حصاد HERS من البشر يكاد يكون مستحيلا بسبب القضايا الأخلاقية: يجب إزالة جرثومة الأسنان النامية من طفل صغير لحصاد HERS البشري. نادرا ما يتم استخراج جراثيم الأسنان غير الناضجة. يمكن عزل الخلايا الظهارية أسنان الإنسان من اللثة والرباط اللثة (PDL). تشارك الخلايا المشتقة من البنية الظهارية في تكوين الأسنان جنبا إلى جنب مع المكونات الميكنشيمالية وقد تكون أكثر ملاءمة لدراسة التفاعلات الظهارية للأسنان من الخلايا القرنية الفموية. تقع الخلايا الظهارية من Malassez (ERM) هي بقايا ظهارية مشتقة من HERS وتقيم بأعداد صغيرة في PDL4. وتشير الدراسات إلى عزلة مراكز استراتيجية الأمن البشرية عن PDL5. ومع ذلك، فإن حصاد مركبات هيرسك البشرية من أنسجة ال PDL ليس ناجحا دائما بسبب ندرة السكان الظهاريين في هذا الموقع5,6.
على الرغم من الحفاظ على HERSCs المشتقة من القوارض في الوسائط المحتوية على المصل3,7 ، يتم استزراع الخلايا الظهارية المشتقة من DF البشرية مع وسائط خالية من المصل مماثلة للخلايا الظهارية البشرية الأخرى ، مثل خلايا القرنية البشرة البشرية العادية وخلايا القرنية الفموية البشرية العادية8،9. وهذا يعني الاختلافات الفسيولوجية أو الوظيفية بين الخلايا الظهارية أسنان القوارض والخلايا الظهارية الأسنان البشرية. قد يساهم فهم الآلية المتعلقة بالتفاعلات الظهارية -الميسنشيمالية للأسنان في تطوير التطبيقات السريرية ، بما في ذلك إعادة ربط اللثة أثناء إعادة الزرع ، وتجديد اللثة في أمراض اللثة ، وتجديد عقدة اللب دينتين ، وتوليد الأسنان الحيوية. بالنظر إلى خصائص البحوث التحويلية ، قد تكون الخلايا الظهارية أسنان الإنسان أكثر ملاءمة من الخلايا الظهارية أسنان القوارض لدراسة التفاعلات الظهارية - mesenchymal.
وDF الإنسان هو النسيج الضام فضفاضة وغالبا ما يقيم في الأسنان المتضررة. يحتوي DF على السلائف الميكنشيمالية10. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لم تبلغ أي دراسة عن عزل الخلايا الظهارية عن بصيلات الأسنان قبل عام 2021. أبلغ أوه ويي عن عزل الخلايا الظهارية عن DF البشري في عام 20218. تم تأكيد النمط الظاهري الظهاري من خلال النشاف الغربي والتحليل المورفولوجي. أظهر تحليل أصل الخلايا الظهارية المشتقة من DF نتائج مماثلة مع دراسات أخرى. لم تكن الخلايا الظهارية المشتقة من DF بطانة الرحم ولا هيماتوبيك5،11 ، واقترح أوه ويي تسمية هذه الخلايا باسم DF-HERSCs. يحتوي DF على حجم أكبر من PDL، ويمكن عزل خلايا ظهارية أكثر من DF. وهذا يعزز ظهور المستعمرات الظهارية ويؤدي إلى ارتفاع معدل النجاح في حصاد الخلايا الظهارية من DF. تقترح هذه الدراسة استخدام DF كمصدر للأنسجة لعزل الخلايا الظهارية للأسنان.
في هذه الدراسة، تم عزل خلايا واحدة من DF وفقا للإجراءات الموصوفة سابقا10،12. يحتوي DF على مجموعات خلايا غير متجانسة ، ويمكن أن تكون هناك عدة أنواع من الخلايا في المرحلة المبكرة من الإجراء. قام مورشيك وزملاؤه بعزل الخلايا الجذعية الميكنشيمالية المشتقة من DF10. افترضنا أن DF يحتوي على خلايا ظهارية وأن الخلايا الظهارية فقط هي التي يمكنها البقاء على قيد الحياة في ظل ظروف خالية من المصل. تختلف هذه الدراسة عن دراسة مورشيك وآخرين من حيث اختيار السكان الظهاريين وتثبيط الخلايا الميكنشيمالية. تم إجراء الاختيار باستخدام الوسائط الخالية من مصل الكيراتينية (SFM) ، والتي تسمح بانتشار الخلايا الظهارية وتمنع انتشار الخلايا الوسيطة. نشأت هذه الدراسة من تقرير من قبل أوه وYy8. وكان الهدف من هذه الدراسة هو وصف تفاصيل الطريقة المستخدمة في ذلك التقرير لعزل الخلايا الظهارية عن DF البشري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى جامعة كيونغ هي في غانغدونغ (موافقة IRB رقم. KHNMC 2017-06-009).
1. جمع DF
ملاحظة: أعطى المرضى موافقة مستنيرة قبل الجراحة لإزالة الضرس الثالث الناضج أو غير الناضج. تم استبعاد المرضى الذين يعانون من المرض التالي: السكري وارتفاع ضغط الدم والسل والتهاب الكبد ومتلازمة نقص المناعة المكتسبة. كما استبعدت النساء الحوامل.
- حصاد DF أثناء الاستخراج الجراحي من الأضراس الثالثة المتضررة (الشكل 1A).
ملاحظة: تم إجراء الجراحة من قبل جراح الوجه والفكين عن طريق الفم. مطلوب التعاون مع طبيب أسنان لجمع الأنسجة. - تخزين DF في المالحة الفوسفات المخزنة بالفوسفات (DPBS) مع 3٪ البنسلين-streptomycin في 4 درجة مئوية قبل الاستخدام. إجراء إجراءات العزل في يوم حصاد DF (الشكل 1B).
2. عزل مجموعات أحادية الخلية من DF
- إعداد حلول المخزون من الكولاجيناز من النوع الأول وبروتيز في DPBS بحيث التركيزات النهائية من نوع الكولاجينز الأول وبروتيز هي 1 ملغم / مل و 2.4 ملغ / مل ، على التوالي.
- إعداد ثلاثة أنابيب غسل 50 مل مع 20 مل من DPBS لكل أنبوب. تسمية الأنابيب ك 1 و 2 و 3.
- غسل DF في أنابيب الغسيل بالتسلسل. عقد DF مع ملاقط ووضع DF في أنبوب 1. أخرج DF من الأنبوب 1 وضعه في الأنبوب 2. أخرج DF من الأنبوب 2 وضعه في الأنبوب 3. يهز بلطف DF 10-15 مرات في كل أنبوب. بعد غسل ثلاث مرات، ضع DF في طبق ثقافة 60 ملم (الشكل 2A).
- فرم DF مع مقص الأنسجة (الشكل 2B). نقل جزء صغير فقط إلى طبق الثقافة لتقليل فقدان الأنسجة. كرر القطع حتى DF له مظهر اللب أو اسفنجي (الشكل 2C).
- مزيج 1 مل من الكولاجين من النوع الأول و 1 مل من محلول بروتياز في أنبوب مخروطي 15 مل للحصول على تركيزات نهائية من 1 ملغم / مل و 2.4 ملغم / مل ، على التوالي.
- نقل DF المفروم في أنبوب مخروطي 15 مل من الخطوة 2.5. هزة برفق واحتضان أنبوب لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
- إضافة 5 مل من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى الأنبوب، يهز، واحتضان أنبوب لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- إعداد الخلايا الكيراتينية المتوسطة التي تحتوي على keratinocyte SFM 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS). إضافة 3 مل من الكيراتينوسي المتوسطة في أنبوب مخروطي جديد 50 مل. ضع مصفاة 40 ميكرومتر فوق هذا الأنبوب واستخدم ماصة مصلية سعة 10 مل لتنشق الناطور من الخطوة 2.6 وتمريرها عبر المصفى.
ملاحظة: تقليل دمج بقايا الأنسجة المهضومة أثناء تناول supernatant. إزالة بقايا الأنسجة مع مصفاة 40 ميكرومتر للحد من الفشل. بقايا الأنسجة قد تمر عبر 70 ميكرومتر مصفاة وتعوق تشكيل المستعمرة. سوف FBS في المتوسط keratinocyte تعطيل الإنزيمات. - كرر الخطوتين 2.7 و 2.8.
- نقل تعليق جمعها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- الطرد المركزي أنبوب مخروطي 15 مل في 288 × غرام لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية. أزل الناتنات الفائق.
ملاحظة: كن حذرا لتجنب أي إزالة عرضي للخلايا الكريات، والتي هي في معظمها غير مرئية. - إضافة 3 مل من الخلايا الكيراتينية SFM وغسل الخلايا مرتين مع ماصة 1 مل مع الطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 2.11.
- لوحة السكان خلية واحدة في طبق ثقافة 60 ملم باستخدام الكيراتينوسي SFM. حافظ على طبق الثقافة بحجم نهائي يبلغ 5 مل في جو رطب من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. تغيير متوسطة الثقافة يوميا حتى لا يلاحظ وجود حطام الأنسجة أو الخلايا.
ملاحظة: إزالة debris العائمة في الوسط الثقافة عن طريق تغيير الوسيطة. تأخر إزالة حطام الأنسجة أو الخلايا الميتة له تأثير غير موات على الثقافة الأولية. - فحص لوحة من الخطوة 2.13 للتحقق من نمو الخلايا الظهارية (الشكل 3A).
ملاحظة: تنمو الخلايا الظهارية في غضون 7-10 أيام بعد طلاء مجموعات خلايا مفردة. - توسيع المستعمرات الظهارية والثقافة الفرعية للخلايا.
- يستنشق المتوسط ويغسل الجزء السفلي من لوحة الثقافة مرة واحدة مع 3 مل من keratinocyte SFM.
- أضف 2 مل من بروتياز فصامية الخلية واحتضنها في جو رطب من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: كرر الخطوة 2.15.2 إذا انفصال الخلية غير فعالة. - إضافة 2 مل من الكيراتينوسي المتوسطة إلى لوحة الثقافة ونقل محتويات في أنبوب مخروطي 15 مل.
ملاحظة: إضافة المزيد من الكيراتينوسيوسي المتوسطة غير مطلوب إذا كرر الخطوة 2.15.2. - الطرد المركزي أنبوب مخروطي 15 مل في 288 × غرام لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية.
- إزالة supernatant وغسل بيليه الخلية مرتين مع 3 مل من الكيراتينوسيت SFM.
- لوحة الخلايا في طبق ثقافة 100 ملم باستخدام الكيراتينوسي SFM (الحجم النهائي من 10 مل لكل طبق 100 ملم).
- إعداد وتخزين مخزونات الخلايا في خزان النيتروجين السائل.
- حصاد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.15.1-2.15.5.
- توزيع الخلايا في cryovials في 1 مل من تجميد المتوسطة (80٪ keratinocyte SFM، 10٪ ديميثيل سلفكسيد، 10٪ FBS).
- ضع القنينات في حاوية تجميد وخزنها عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- نقل قوارير من الفريزر العميق إلى خزان النيتروجين السائل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DF الحصاد
تم إجراء الجراحة من قبل جراح الوجه والفكين عن طريق الفم. تم جمع المواد المشتقة من الإنسان، بما في ذلك جزء الأسنان، والأنسجة الغنجية، وDF، من قبل جراح (الشكل 1A). قد تكون مرفقة DF إلى جزء الأسنان. جراح الوجه والفكين عن طريق الفم سوف تكون قادرة على تحديد DF. التعاون والتواصل مع الجراح مطلوب لجمع الأنسجة. وDF هو نسيج يشبه الغشاء على شكل غير منتظم. الأنسجة Gingival لديه سطح الكيراتين ويمكن تمييزها عن DF. يتواجد نسيج اللب في غرفة اللب ونادرا ما يتم فصله عن الأسنان أثناء الجراحة. تم تخزين DF في DPBS مع 3٪ البنسلين-ستربتومايسين في 4 درجة مئوية قبل الاستخدام (الشكل 1B).
المعالجة الميكانيكية من DF
تمت إزالة حطام الأنسجة والدم عن طريق غسل DF مع DPBS. تم إعداد ثلاثة أنابيب مخروطية بمحلول الغسيل. بعد الغسيل، تم نقل DF على طبق ثقافة 60 مم أو 100 مم (الشكل 2A). وينبغي أن تكون مفرومة DF مع مقص حتى النسيج لديه مظهر اللب أو طري (الشكل 2B، C).
ظهور السكان الظهارية
بعد طلاء مجموعات الخلايا غير المتجانسة ، طفت العديد من الخلايا والحطام الصغير في وسط الثقافة. انخفض عدد الخلايا العائمة تدريجيا مع التغيرات المتوسطة المتعاقبة. قد يتسبب تأخر تغيير متوسط بيئة ثقافة عكر. في المرحلة الأولية، تظهر أنواع مختلفة من الخلايا في الجزء السفلي من طبق الثقافة ولكنها تختفي عند الاحتفاظ بها في keratinocyte SFM. تظهر الخلايا ذات المورفولوجيا الظهارية في غضون 7-10 أيام بعد طلاء مجموعات الخلايا المفردة (الشكل 3A). يتراوح عدد الخلايا المرصوفة بالحصى من 1 إلى 10 في وقت ظهور الخلايا الظهارية ، والتي تتوسع إلى مستعمرات بمرور الوقت (الشكل 3B).
تكرر إجراء التشميس لزيادة منطقة الاتصال DF مع 0.05٪ تريبسين-EDTA لتعزيز تفكك الخلايا. تم حصاد خلايا واحدة أكثر من لب DF من DF سليمة. الالتصاق من اللب DF يشير إلى احتمال نجاح عزل الخلايا الظهارية. منعت التغيرات المتوسطة اليومية SFM الكيراتينية من أن تصبح عكرة ، وهو أمر مهم لبقاء الخلايا الظهارية.
الشكل 1: المواد المشتقة من الإنسان. (أ) جمع جراح الوجه والفكين مواد مشتقة من الإنسان. يشير السهم الأصفر إلى DF. تشير الأسهم السوداء إلى شظية الأسنان والأنسجة الرخوة المرفقة بالسن. (ب) تم تخزين DF في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 3٪ البنسلين-streptomycin في 4 درجة مئوية. تم تنفيذ إجراءات العزل في غضون 24 ساعة من الجمع. المختصرات: DF = بصيلات الأسنان. PBS = ملحي عازل بالفوسفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: علاج بصيلات الأسنان. (أ) تم نقل DF إلى طبق ثقافة 60 ملم بعد غسله مع DPBS ثلاث مرات. (ب) تم فرم DF بمقص الأنسجة. (ج) كان DF المفروم مظهر اللب أو طري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ظهور خلايا ظهارية. (أ) تظهر الخلايا ذات المورفولوجيا الظهارية في غضون 7-10 أيام بعد طلاء مجموعات الخلايا الواحدة. (ب) التوسع الحي السابق للخلايا الظهارية المشتقة من DF عن طريق الثقافة الفرعية. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. اختصار: DF = بصيلات الأسنان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتضمن هذا البروتوكول خطوات هامة. حصاد مجموعات وحيدة الخلية أمر ضروري للعزل الناجح للخلايا الظهارية من DF. سعينا لعزل الخلايا الظهارية من DF على أساس فرضيتنا أن هناك المزيد من الخلايا الظهارية في DF. يعزز إجراء الألغام انفصال الخلايا وإطلاقها من DF. تم تحسين إجراء الفتك ، وتكرار الألغام حتى ظهر DF لبا لتسهيل إطلاق خلايا واحدة. الحصول على الحد الأقصى لعدد الخلايا المفردة يزيد من احتمال ظهور السكان الظهارية. يحدث التلوث في كثير من الأحيان أثناء عزل الخلايا الظهارية من DF. استخدام 40 ميكرومتر مصافي يقلل من إدراج حطام الأنسجة في مجموعات خلايا واحدة، كما بقايا الأنسجة يمكن أن تمر من خلال 70 مصافي ميكرومتر وتمنع استعمار الخلايا الظهارية.
ويبدو أن الخلايا الظهارية أكثر عرضة لبيئات معينة من الخلايا المتوسطة، كما أن التغير اليومي لوسط الثقافة وفر بيئة نظيفة لظهور السكان الظهاريين. قد يكون فقدان الخلايا بسبب التغيير المتوسط المتكرر قيدا على هذا البروتوكول. ومع ذلك، تم إجراء تغيير يومي للوسط بعد استكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذا البروتوكول، وبالتالي، ظهرت الخلايا الظهارية وتوسعت. تأخير التغيير المتوسط يمكن أن يؤثر على الثقافات. كما بيليه الخلية بعد الطرد المركزي غير مرئية تقريبا, غيض ضيق من أنبوب مخروطي 15 مل يزيد من سهولة إزالة supernatant دون أن تفقد بيليه الخلية. لذلك، يقترح هذا البروتوكول نقل محتويات الأنبوب المخروطي سعة 50 مل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
يوفر DF حجم أكبر من الأنسجة وخلايا مفردة أكثر من PDL. وبالتالي، يمكن استخدام DF بدلا من PDL كمصدر للأنسجة لعزل الخلايا الظهارية الأسنان البشرية. يمكن أن يتم اختيار وتثبيط أنواع الخلايا في DF ببساطة من خلال وسيط ثقافة انتقائية. SFM يحفز النمو الظهاري، في حين يختار المتوسطة المحتوية على المصل للخلايا المتوسطة. هذه المنهجية تسمح بسهولة الوصول إلى الخلايا الظهارية الأسنان البشرية. مورشيك وزملاؤه عزلوا سابقا السلائف الميكنشيمالية المشتقة من DF. تختلف هذه الدراسة عن دراستهم من خلال اختيار المجموعات الظهارية وتثبيط الخلايا الميكنشيمالية.
الدور التنظيمي للخلايا الظهارية الأسنان أثناء تكوين الأسنان هو من مصلحة كبيرة في أبحاث طب الأسنان. دراسة التفاعلات الظهارية-mesenchymal أثناء تطور الأسنان قد تشير إلى أدلة لحل المشاكل السريرية13. وقد حاول تجديد الأنسجة من خلال الجمع بين المكونات الظهارية و mesenchymal14. تم تقييم العوامل المشتقة من الخلايا الظهارية للأسنان ، مثل مشتق مصفوفة المينا ، كغايات علاجية تهدف إلى تجديد اللثة ، وتجديد عقدة اللب دينتين ، وإعادة ربط اللثة2،15. قد يولد مزيج عوامل التجديد، بما في ذلك الخلايا الجذعية وصفائح الخلايا الظهارية-الميسنشيمالية والعوامل المشتقة من الخلايا والمواد الحيوية، أسنانا حيوية في حالة فقدان الأسنان أو نشأة16. الجينات المرتبطة بنشأة الأسنان، مثل PAX9، MSX1، AXIN2، EDA، EDAR، وجينات WNT10A، هي الجينات التنظيمية الرئيسية المرشحة المحتملة للتفاعلات الظهارية-الميكنشيمال17. وعلاوة على ذلك، فإن الجيل التالي من البيانات المستمدة من طريقة التسلسل من الدراسات المرتبطة بنشأة الأسنان قد يقترح بالمثل جينات مستهدفة جديدة مفترضة تنظم السيطرة الجزيئية أثناء التفاعلات الظهارية الظهارية للأسنان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس بينهما تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF) بتمويل من الحكومة الكورية (NRF-2017R1C1B2008406 و NRF-2021R1F1A1064350). الدكتور هي يون باي تكرم بتوفير DF للثقافة الأولية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
References
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).
- Choung, H. W., et al. The effect of CPNE7 on periodontal regeneration. Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).
- Li, X., et al. Development of immortalized Hertwig's epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3 (2019).
- Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. Fate of HERS during tooth root development. Developmental Biology. 334 (1), 22-30 (2009).
- Farea, M., et al. Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig's epithelial root sheath cell population. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).
- Jung, H. S., et al. Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells. Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).
- Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment. International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).
- Oh, J. E., Yi, J. K. Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig's epithelial root sheath cells. Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).
- Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Lee, J. H., et al. Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig's epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway. European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).
- Wan, A. C. A. Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction - are biomaterials dispensable. Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
- Guo, Y., et al. Are Hertwig's epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells. Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).
- Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots. Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).
- Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. The crowning achievement: getting to the root of the problem. Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).
- Bonczek, O., et al. Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer. Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).
