Summary
Der Dentalfollikel enthält eine Epithelpopulation und mesenchymale Zellen. Die Epithelpopulation wurde aus der heterogenen Dentalfollikelzellpopulation ausgewählt, indem ein bestimmtes Kulturmedium bereitgestellt wurde. Epithelzellen überlebten und bildeten Kolonien in einem serumfreien Medium.
Abstract
Der Zahnfollikel (DF) wurde bei der Entfernung eines betroffenen dritten Backenzahns durch einen Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgen geerntet. Die Isolierung der Epithelzellen wurde am Tag der DF-Ernte durchgeführt. Das DF wurde dreimal mit DPBS gewaschen und dann mit einer Gewebeschere seziert, bis das Gewebe eine breiige oder matschige Konsistenz aufwies. Einzelzellpopulationen wurden durch Zentrifugation pelletiert und mit keratinozyten-serumfreiem Medium gewaschen. Heterogene Zellpopulationen wurden in einer Kulturschale verteilt. Keratinozyten-serumfreies Medium wurde verwendet, um die Epithelzellen auszuwählen. Das Kulturmedium wurde täglich gewechselt, bis keine schwimmenden Trümmer oder toten Zellen mehr beobachtet wurden. Epithelzellen erschienen innerhalb von 7-10 Tagen nach der Zellpopulationsverteilung. Epithelzellen überlebten in serumfreiem Medium, während α minimales essentielles Medium mit minimaler Modifikation, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, die Proliferation von mesenchymalen Zellen ermöglichte. Das DF ist eine Gewebequelle zur Isolierung von Zahnepithelzellen.
Der Zweck dieser Studie war es, eine Methode zur Isolierung von Epithelzellen aus menschlicher DF zu etablieren. Das Parodontalband (PDL) wurde zur Isolierung menschlicher Zahnepithelzellen verwendet. Die Beschaffung von Epithelzellen aus menschlicher PDL ist aufgrund des geringen Gewebevolumens nicht immer erfolgreich, was zu einer geringen Anzahl von Epithelzellen führt. DF hat ein größeres Volumen als PDL und enthält mehr Zellen. DF kann eine Gewebequelle für die Primärkultur menschlicher Zahnepithelzellen sein. Dieses Protokoll ist einfacher und effizienter als die Isolationsmethode mit PDL. Die Beschaffung menschlicher Zahnepithelzellen kann weitere Studien zu zahnärztlichen epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen erleichtern.
Introduction
Die Zahnbildung beginnt mit der Invagination des oralen Epithels1. Je nach Entwicklungsstadium des Zahns hat das orale Epithel verschiedene Namen, einschließlich des inneren und äußeren Schmelzepithels, der zervikalen Schleife und der Hertwig-Epithelwurzelscheide (HERS). Die Epithelkompartimente kommunizieren mit den umgebenden mesenchymalen Zellen. Epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen regulieren die Zahnbildung und Geweberegeneration. Die Beschaffung von zahnärztlichen Epithelzellen wie oralen Keratinozyten und Hertwigs epithelialen Wurzelscheidenzellen (HERSCs) ist entscheidend für die Untersuchung von zahnärztlichen epithelial-mesenchymalen Interaktionen2.
Nagetier-abgeleitete dentale Epithelzellen werden aus der Epithelstruktur isoliert, wie z.B. dem HERS. Li und Kollegen isolierten und immortalisierten herSCs aus Rattenmolaren, nachdem sie den apikalen Teil der sich entwickelnden Zahnkeime von 8 Tage alten Ratten geerntet hatten3. Das HERS wurde unter Vergrößerung vom apikalen Gewebe getrennt. In Anbetracht des Entwicklungsstadiums und des Alters des Zahnes ist die Ernte des HERS vom Menschen aus ethischen Gründen fast unmöglich: Ein sich entwickelnder Zahnkeim muss von einem kleinen Kind entfernt werden, um das menschliche HERS zu ernten. Unreife Zahnkeime werden selten extrahiert. Menschliche Zahnepithelzellen können aus der Gingiva und dem Parodontalband (PDL) isoliert werden. Epithelstruktur-abgeleitete Zellen sind zusammen mit mesenchymalen Komponenten an der Zahnbildung beteiligt und könnten für die Untersuchung von zahnärztlichen epithelial-mesenchymalen Interaktionen besser geeignet sein als orale Keratinozyten. Epithelzellreste von Malassez (ERM) sind HERS-abgeleitete Epithelreste und befinden sich in geringer Anzahl im PDL4. Studien berichten über die Isolierung menschlicher HERSCs von PDL5. Die Entnahme menschlicher HERSCs aus PDL-Gewebe ist jedoch aufgrund der Knappheit der Epithelpopulation an diesem Ort nicht immer erfolgreich5,6.
Obwohl aus Nagetieren gewonnene HERSCs in serumhaltigen Medien gehalten werden3,7, werden humane DF-abgeleitete Epithelzellen mit serumfreien Medien kultiviert, die anderen menschlichen Epithelzellen ähneln, wie normale menschliche epidermale Keratinozyten und normale menschliche orale Keratinozyten8,9. Dies impliziert physiologische oder funktionelle Unterschiede zwischen Nagetier-Dentalepithelzellen und menschlichen Zahnepithelzellen. Das Verständnis des Mechanismus in Bezug auf zahnärztliche epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen könnte zur Entwicklung klinischer Anwendungen beitragen, einschließlich parodontaler Wiederanlagerung während der Replantation, parodontaler Regeneration bei Parodontitis, Pulpa-Dentin-Komplex-Regeneration und Biozahnerzeugung. In Anbetracht der Merkmale der translationalen Forschung können menschliche Zahnepithelzellen für die Untersuchung von epithelial-mesenchymalen Interaktionen besser geeignet sein als Nagetier-Dentalepithelzellen.
Das menschliche DF ist ein lockeres Bindegewebe und befindet sich oft in einem impaktierten Zahn. Das DF enthält mesenchymale Vorläufer10. Unseres Wissens hat jedoch keine Studie über die Isolierung von Epithelzellen aus Zahnfollikeln vor 2021 berichtet. Oh und Yi berichteten über die Isolierung von Epithelzellen aus menschlichen DF im Jahr 2028. Der epitheliale Phänotyp wurde durch Western Blotting und morphologische Analyse bestätigt. Die Analyse des Ursprungs von DF-abgeleiteten Epithelzellen zeigte ähnliche Ergebnisse wie andere Studien. DF-abgeleitete Epithelzellen waren weder endothel- noch hämatopoetisch5,11, und Oh und Yi schlugen vor, diese Zellen als DF-HERSCs zu benennen. Das DF hat ein größeres Volumen als das PDL, und mehr Epithelzellen können aus dem DF isoliert werden. Dies verstärkt die Entstehung von Epithelkolonien und führt zu einer hohen Erfolgsrate bei der Gewinnung von Epithelzellen aus DF. Diese Studie schlägt vor, die DF als Gewebequelle für die Isolierung von Zahnepithelzellen zu verwenden.
In der vorliegenden Studie wurden einzelne Zellen aus dem DF nach zuvor beschriebenen Verfahren isoliert10,12. Das DF enthält heterogene Zellpopulationen, und mehrere Zelltypen könnten im frühen Stadium des Verfahrens vorhanden sein. Morsczek und Kollegen isolierten DF-abgeleitete mesenchymale Stammzellen10. Wir stellten die Hypothese auf, dass das DF Epithelzellen enthält und dass nur Epithelzellen unter serumfreien Bedingungen überleben können. Diese Studie unterscheidet sich von der von Morsczek et al. hinsichtlich der Selektion der Epithelpopulation und der Hemmung mesenchymaler Zellen. Die Selektion erfolgte unter Verwendung keratinocyte serum-free media (SFM), die die Proliferation von Epithelzellen ermöglichen und die mesenchymale Zellproliferation hemmen. Diese Studie entstand aus einem Bericht von Oh und Yi8. Ziel dieser Studie war es, Details der in diesem Bericht verwendeten Methode zur Isolierung von Epithelzellen aus menschlicher DF zu beschreiben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Kyung Hee University Hospital in Gangdong (IRB-Zulassung Nr. KHNMC 2017-06-009).
1. DF sammeln
HINWEIS: Die Patienten gaben vor der Operation die Einverständniserklärung für die Entfernung eines reifen oder unreifen betroffenen dritten Backenzahns. Patienten mit der folgenden Erkrankung wurden ausgeschlossen: Diabetes, Bluthochdruck, Tuberkulose, Hepatitis, erworbenes Immunschwächesyndrom. Schwangere Frauen wurden ebenfalls ausgeschlossen.
- Ernte DF während der chirurgischen Extraktion von impaktierten dritten Molaren (Abbildung 1A).
HINWEIS: Die Operation wurde von einem Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgen durchgeführt. Für die Gewebeentnahme ist die Zusammenarbeit mit einem Zahnarzt erforderlich. - VOR GEBRAUCH DF in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) mit 3 % Penicillin-Streptomycin bei 4 °C lagern. Führen Sie isolationsprozeduren am Tag der DF-Ernte durch (Abbildung 1B).
2. Isolieren Sie Einzelzellpopulationen aus DF
- Brühlösungen von Kollagenase Typ I und Protease in DPBS so heraufbereiten, dass die Endkonzentrationen der Kollagenase Typ I und der Protease 1 mg/ml bzw. 2,4 mg/ml betragen.
- Bereiten Sie drei 50-ml-Waschröhrchen mit 20 ml DPBS pro Röhrchen vor. Beschriften Sie die Tuben mit 1, 2 und 3.
- Waschen Sie den DF nacheinander in den Waschschläuchen. Halten Sie den DF mit einer Pinzette fest und legen Sie den DF in Röhre 1. Nehmen Sie den DF aus Röhre 1 und legen Sie ihn in Röhre 2. Nehmen Sie den DF aus Röhre 2 und legen Sie ihn in Röhre 3. Schütteln Sie DF vorsichtig 10-15 Mal in jedem Röhrchen. Nach dreimaligem Waschen den DF in eine 60-mm-Kulturschale geben (Abbildung 2A).
- Zerkleinern Sie das DF mit einer Gewebeschere (Abbildung 2B). Übertragen Sie nur eine kleine Portion in die Kulturschale, um den Gewebeverlust zu minimieren. Wiederholen Sie den Schnitt, bis der DF breiig oder matschig aussieht (Abbildung 2C).
- Mischen Sie 1 ml Kollagenase Typ I und 1 ml Proteaselösung in einem 15 ml konischen Röhrchen, um Endkonzentrationen von 1 mg/ml bzw. 2,4 mg/ml zu erhalten.
- Das zerkleinerte DF aus Schritt 2.5 in das konische 15-ml-Rohr überführen. Schütteln und inkubieren Sie das Röhrchen vorsichtig für 1 h bei 37 °C.
- 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA in das Röhrchen geben, schütteln und das Röhrchen 15 min bei 37 °C inkubieren.
- Herstellung eines Keratinozytenmediums, das Keratinozyten SFM 10% fötales Rinderserum (FBS) enthält. Fügen Sie 3 ml Keratinozytenmedium in ein neues 50 ml konisches Röhrchen hinzu. Legen Sie ein 40-μm-Sieb auf dieses Röhrchen und verwenden Sie eine 10 ml serologische Pipette, um den Überstand aus Schritt 2,6 abzusaugen und durch das Sieb zu leiten.
HINWEIS: Minimieren Sie den Einbau von verdauten Geweberesten während der Einnahme des Überstandes. Entfernen Sie die Gewebereste mit einem 40 μm-Sieb, um ein Versagen zu minimieren. Gewebereste können 70 μm-Schmutzfänger passieren und die Koloniebildung behindern. FBS im Keratinozytenmedium inaktiviert die Enzyme. - Wiederholen Sie die Schritte 2.7 und 2.8.
- Die gesammelte Suspension wird in ein konisches 15-ml-Rohr gegeben.
- Zentrifugieren Sie das 15 mL konische Rohr bei 288 × g für 3 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand.
HINWEIS: Achten Sie darauf, eine versehentliche Entfernung von pelletierten Zellen zu vermeiden, die meist unsichtbar sind. - 3 ml Keratinozyten-SFM zugeben und die Zellen zweimal mit einer 1-ml-Pipette mit Zentrifugation gemäß Schritt 2.11 waschen.
- Die Einzelzellpopulation wird mit Keratinozyten-SFM in eine 60-mm-Kulturschale gekeltert. Bewahren Sie die Kulturschale mit einem Endvolumen von 5 ml in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO2 bei 37 °C auf. Wechseln Sie das Kulturmedium täglich, bis keine Gewebe- oder Zelltrümmer mehr beobachtet werden.
HINWEIS: Entfernen Sie schwimmende Ablagerungen im Kulturmedium, indem Sie das Medium wechseln. Die verzögerte Entfernung von Gewebetrümmern oder abgestorbenen Zellen wirkt sich ungünstig auf die Primärkultur aus. - Untersuchen Sie die Platte aus Schritt 2.13, um das Wachstum von Epithelzellen zu überprüfen (Abbildung 3A).
HINWEIS: Epithelzellen wachsen innerhalb von 7-10 Tagen nach der Plattierung von Einzelzellpopulationen. - Erweitern Sie die Epithelkolonien und subkulturieren Sie die Zellen.
- Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie den Boden der Kulturplatte einmal mit 3 ml Keratinozyten-SFM.
- 2 ml Zelldissoziationsprotease zugeben und in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO2 bei 37 °C für 3 min inkubieren.
HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 2.15.2, wenn die Zellablösung nicht wirksam ist. - Geben Sie 2 ml Keratinozytenmedium in die Kulturplatte und übertragen Sie den Inhalt in ein 15 mL konisches Röhrchen.
HINWEIS: Die Zugabe von mehr Keratinozytenmedium ist nicht erforderlich, wenn Schritt 2.15.2 wiederholt wird. - Zentrifugieren Sie das 15 mL konische Rohr bei 288 × g für 3 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet zweimal mit 3 ml Keratinozyten-SFM.
- Die Zellen werden in einer 100-mm-Kulturschale mit Keratinozyten-SFM (Endvolumen von 10 mL pro 100-mm-Schale) plattiert.
- Bereiten Sie Zellbestände vor und lagern Sie sie in einem Flüssigstickstofftank.
- Ernten Sie Zellen wie in den Schritten 2.15.1-2.15.5 beschrieben.
- Verteilen Sie die Zellen in Kryovolen in 1 ml Gefriermedium (80% Keratinozyten SFM, 10% Dimethylsulfoxid, 10% FBS).
- Legen Sie die Durchstechflaschen in einen Gefrierbehälter und lagern Sie sie bei -80 °C für 24 h.
- Die Fläschchen aus der Tiefkühltruhe in einen Flüssigstickstofftank überführen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DF-Ernte
Die Operation wurde von einem Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgen durchgeführt. Menschliche Materialien, einschließlich des Zahnfragments, des Zahnfleischgewebes und der DF, wurden von einem Chirurgen gesammelt (Abbildung 1A). Der DF könnte am Zahnfragment befestigt sein. Ein Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurg wird in der Lage sein, die DF zu identifizieren. Die Zusammenarbeit und Kommunikation mit dem Chirurgen sind für die Gewebeentnahme erforderlich. Das DF ist ein unregelmäßig geformtes membranartiges Gewebe. Zahnfleischgewebe hat eine keratinisierte Oberfläche und kann vom DF unterschieden werden. Pulpagewebe befindet sich in der Pulpakammer und wird während der Operation selten von den Zähnen getrennt. Das DF wurde vor der Anwendung in DPBS mit 3% Penicillin-Streptomycin bei 4 °C gelagert (Abbildung 1B).
Mechanische Behandlung von DF
Gewebeablagerungen und Blut wurden durch Waschen des DF mit DPBS entfernt. Drei konische Röhrchen wurden mit Waschlösung hergestellt. Nach dem Waschen wurde der DF auf eine 60 mm oder 100 mm Kulturschale übertragen (Abbildung 2A). Das DF sollte mit einer Schere gehackt werden, bis das Gewebe breiig oder matschig aussieht (Abbildung 2B, C).
Entstehung der Epithelpopulation
Nach der Beschichtung heterogener Zellpopulationen schwammen viele Zellen und kleine Trümmer im Kulturmedium. Die Anzahl der schwebenden Zellen nahm mit sukzessiven Medienwechseln allmählich ab. Verzögerte Mittelveränderungen können eine trübe Kulturumgebung verursachen. Im Anfangsstadium erscheinen verschiedene Zelltypen am Boden der Kulturschale, verschwinden aber, wenn sie in Keratinozyten-SFM gehalten werden. Zellen mit Epithelmorphologie erscheinen innerhalb von 7-10 Tagen nach der Plattierung von Einzelzellpopulationen (Abbildung 3A). Die Anzahl der kopfsteinförmigen Zellen reicht von 1 bis 10 zum Zeitpunkt des Auftretens von Epithelzellen, die sich im Laufe der Zeit zu Kolonien ausdehnen (Abbildung 3B).
Das Zerkleinerungsverfahren wurde wiederholt, um die DF-Kontaktfläche mit 0,05% Trypsin-EDTA zu vergrößern, um die Zelldissoziation zu fördern. Aus DF-Zellstoff wurden mehr Einzelzellen geerntet als aus intaktem DF. Die Klebrigkeit der DF-Pulpa zeigte die Erfolgswahrscheinlichkeit der Isolierung von Epithelzellen an. Tägliche Mittlere Veränderungen verhinderten, dass das Keratinozyten-SFM trüb wurde, was für das Überleben der Epithelzellen wichtig ist.
Abbildung 1: Vom Menschen stammende Materialien. (A) Menschliche Materialien wurden von einem Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgen gesammelt. Der gelbe Pfeil zeigt den DF an. Schwarze Pfeile zeigen das Zahnfragment und das am Zahn befestigte Weichgewebe an. (B) Das DF wurde in PBS gelagert, ergänzt mit 3% Penicillin-Streptomycin bei 4 °C. Isolationsverfahren wurden innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme durchgeführt. Abkürzungen: DF = Dentalfollikel; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Behandlung von Zahnfollikeln. (A) Der DF wurde nach dreimaligem Waschen mit DPBS in eine 60-mm-Kulturschale überführt. (B) Das DF wurde mit einer Gewebeschere zerkleinert. (C) Das gehackte DF hatte ein breiiges oder matschiges Aussehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Entstehung von Epithelzellen. (A) Zellen mit Epithelmorphologie erscheinen innerhalb von 7-10 Tagen nach der Plattierung von Einzelzellpopulationen. (B) Ex-vivo-Expansion von DF-abgeleiteten Epithelzellen nach Subkultur. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzung: DF = Dentalfollikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll enthält kritische Schritte. Die Entnahme von Einzelzellpopulationen ist für die erfolgreiche Isolierung von Epithelzellen aus DF unerlässlich. Wir versuchten, Epithelzellen aus dem DF zu isolieren, basierend auf unserer Hypothese, dass es mehr Epithelzellen im DF gibt. Das Zerkleinerungsverfahren verbessert die Ablösung und Freisetzung von Zellen aus dem DF. Das Zerkleinerungsverfahren wurde verbessert und das Zerkleinern wurde wiederholt, bis das DF breiig erschien, um die Freisetzung einzelner Zellen zu erleichtern. Das Erhalten der maximalen Anzahl von Einzelzellen erhöht die Wahrscheinlichkeit der Entstehung der Epithelpopulation. Kontaminationen treten häufig bei der Isolierung von Epithelzellen aus dem DF auf. Die Verwendung von 40 μm-Schmutzfängern minimiert die Aufnahme von Gewebetrümmern in Einzelzellpopulationen, da Gewebereste 70 μm-Schmutzfänger passieren und die Kolonisierung von Epithelzellen hemmen können.
Epithelzellen scheinen für bestimmte Umgebungen anfälliger zu sein als mesenchymale Zellen, und der tägliche Wechsel des Kulturmediums bot auch eine saubere Umgebung für die Entstehung der Epithelpopulation. Der Verlust von Zellen aufgrund eines häufigen Mediumwechsels kann eine Einschränkung dieses Protokolls sein. Nach der Fehlersuche für dieses Protokoll wurde jedoch ein täglicher Wechsel des Mediums durchgeführt, und folglich erschienen und erweiterten sich Epithelzellen. Die Verzögerung des Medienwechsels kann sich auf die Kulturen auswirken. Da das Zellpellet nach der Zentrifugation fast unsichtbar ist, erhöht die schmale Spitze eines 15 ml konischen Rohrs die Leichtigkeit der Überstandsentfernung, ohne das Zellpellet zu verlieren. Daher schlägt dieses Protokoll vor, den Inhalt des konischen 50-ml-Rohrs in ein konisches 15-ml-Rohr zu übertragen.
Das DF liefert ein größeres Gewebevolumen und mehr Einzelzellen als das PDL. Daher kann das DF anstelle des PDL als Gewebequelle für die Isolierung menschlicher Zahnepithelzellen verwendet werden. Die Selektion und Hemmung von Zelltypen im DF kann einfach durch ein selektives Kulturmedium erfolgen. SFM induziert Epithelwachstum, während serumhaltiges Medium für mesenchymale Zellen selektiert. Diese Methodik ermöglicht einen einfachen Zugang zu menschlichen Zahnepithelzellen. Morsczek und Kollegen isolierten zuvor DF-abgeleitete mesenchymale Vorläufer. Diese Studie unterscheidet sich von ihrer durch die Selektion von Epithelpopulationen und die Hemmung von mesenchymalen Zellen.
Die regulatorische Rolle von Zahnepithelzellen bei der Zahnbildung ist in der zahnmedizinischen Forschung von großem Interesse. Die Untersuchung von epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen während der Zahnentwicklung kann Hinweise auf die Lösung klinischer Probleme geben13. Es wurde versucht, geweberegeneration durch kombination von epithelialen und mesenchymalen Komponenten14. Aus Zahnepithelzellen abgeleitete Faktoren, wie ein Schmelzmatrixderivat, wurden als therapeutische Ziele für die parodontale Regeneration, die Regeneration des Pulpa-Dentin-Komplexes und die parodontale Reattachment evaluiert2,15. Die Kombination von Regenerationsfaktoren, einschließlich Stammzellen, epithelial-mesenchymalen Zellblättern, zellabgeleiteten Faktoren und Biomaterialien, kann im Falle von Zahnverlust oder Agenesie Biozähne erzeugen16. Zahnagenesie-assoziierte Gene wie die Gene PAX9, MSX1, AXIN2, EDA, EDAR und WNT10A sind potenzielle Kandidaten für regulatorische Schlüsselgene für epithelial-mesenchymale Interaktionen17. Darüber hinaus könnten aus Next-Generation-Sequencing-Methoden abgeleitete Daten aus Zahnagenese-assoziierten Studien in ähnlicher Weise mutmaßliche neue Zielgene vorschlagen, die die molekulare Kontrolle während zahnärztlicher epithelial-mesenchymaler Interaktionen regulieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, die von der koreanischen Regierung finanziert wurden (NRF-2017R1C1B2008406 und NRF-2021R1F1A1064350). Dr. Hee-Yeon Bae stellte freundlicherweise den DF für die Primärkultur zur Verfügung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
References
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).
- Choung, H. W., et al. The effect of CPNE7 on periodontal regeneration. Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).
- Li, X., et al. Development of immortalized Hertwig's epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3 (2019).
- Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. Fate of HERS during tooth root development. Developmental Biology. 334 (1), 22-30 (2009).
- Farea, M., et al. Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig's epithelial root sheath cell population. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).
- Jung, H. S., et al. Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells. Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).
- Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment. International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).
- Oh, J. E., Yi, J. K. Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig's epithelial root sheath cells. Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).
- Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Lee, J. H., et al. Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig's epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway. European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).
- Wan, A. C. A. Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction - are biomaterials dispensable. Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
- Guo, Y., et al. Are Hertwig's epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells. Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).
- Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots. Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).
- Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. The crowning achievement: getting to the root of the problem. Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).
- Bonczek, O., et al. Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer. Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).
