Summary
זקיק השיניים מכיל אוכלוסייה אפיתל ותאים mesenchymal. אוכלוסיית האפיתל נבחרה מתוך אוכלוסיית תאי הזקיק הדנטליים ההטרוגניים על ידי מתן מדיום תרבותי מובהק. תאי אפיתל שרדו ויצרו מושבות במדיום נטול סרום.
Abstract
זקיק השיניים (DF) נקצר במהלך הסרת שפונחת שלישית שהושפעה על ידי מנתח מקסילופסיאלי אוראלי. בידוד תאי אפיתל בוצע ביום קציר DF. DF נשטף שלוש פעמים עם DPBS ולאחר מכן נותח עם מספריים רקמה עד הרקמה היה עקביות מעופשת או מעוך. אוכלוסיות חד-תאיות הושמטו על ידי צנטריפוגה ונשטפו עם מדיום נטול סרום קרטינוציטים. אוכלוסיות תאים הטרוגניות חולקו בצלחת תרבות. קרטינוציטים ללא סרום מדיום שימש לבחירת תאי האפיתל. מדיום התרבות השתנה מדי יום עד שלא נצפו פסולת צפה או תאים מתים. תאי אפיתל הופיעו בתוך 7-10 ימים לאחר התפלגות אוכלוסיית התאים. תאי אפיתל שרדו במדיום נטול סרום, בעוד α שינוי בינוני חיוני מינימלי בתוספת 10% סרום בקר עוברי אפשר את התפשטותם של תאים מסוג mesenchymal. DF הוא מקור רקמה לבידוד של תאי אפיתל שיניים.
מטרת המחקר הייתה ליצור שיטה לבידוד תאי אפיתל מ-DF אנושי. רצועה חניכיים (PDL) שימש לבידוד של תאי אפיתל שיניים אנושיים. רכישת תאי אפיתל מ- PDL אנושי אינה תמיד מוצלחת בשל נפח הרקמות הקטן, מה שמוביל למספרים נמוכים של תאי אפיתל. ל-DF יש אמצעי אחסון גדול יותר מ-PDL והוא מכיל יותר תאים. DF יכול להיות מקור רקמה לתרבות העיקרית של תאי אפיתל שיניים אנושיים. פרוטוקול זה קל ויעיל יותר משיטת הבידוד המשתמשת ב-PDL. רכישת תאי אפיתל שיניים אנושיים עשויה להקל על מחקרים נוספים של אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות שיניים.
Introduction
היווצרות השן מתחילה עם ההשתנות של האפיתל האוראלי1. על פי השלב ההתפתחותי של השן, לאפיתל הפה יש שמות שונים, כולל אפיתל אמייל פנימי וחיצוני, לולאת צוואר הרחם, ונדן השורש האפיתל של הרטוויג (HERS). תאי האפיתל מתקשרים עם התאים המנשימליים שמסביב. אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות לווסת היווצרות שיניים והתחדשות רקמות. רכישת תאי אפיתל דנטליים, כגון קרטינוציטים אוראליים ותאי נדן השורש האפיתל של Hertwig (HERSCs), חיונית לחקר אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות דנטליות2.
תאי אפיתל דנטליים שמקורם במכרסמים מבודדים ממבנה האפיתל, כגון HERS. לי ועמיתיו בודדו והנציחו את ה-HERSCs שמקורם בחולדות לאחר שקצרו את החלק האפירי של חיידקי השיניים המתפתחים מעכברושים בני 8 ימים3. ה-HERS הופרד מרקמה אפית תחת הגדלה. בהתחשב בשלב התפתחותי השן ובגיל, קצירת HERS מבני אדם היא כמעט בלתי אפשרית בגלל בעיות אתיות: חיידק שן מתפתח צריך להיות מוסר מילד צעיר כדי לקצור את HERS האנושי. חיידקי שיניים לא בוגרים מופקים לעתים רחוקות. תאי אפיתל שיניים אנושיים יכולים להיות מבודדים מן הגינגיבה ואת הרצועה חניכיים (PDL). תאים שמקורם במבנה אפיתל משתתפים בהיווצרות שיניים יחד עם רכיבים מזנכימליים ועשויים להתאים יותר לחקר אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות דנטליות מאשר קרטינוציטים אוראליים. שאריות תא אפיתל של Malassez (ERM) הם שרידי אפיתל שמקורם HERS ושוכנים במספרים קטנים ב- PDL4. מחקרים מדווחים על בידוד של HERSCs אנושי מ PDL5. עם זאת, קצירת HERSCs אנושי מרקמת PDL לא תמיד מוצלח בגלל המחסור של האוכלוסייה האפיתלית במיקום זה5,6.
למרות HERSCs נגזר מכרסמים נשמרים ב media3,7 המכיל סרום, תאי אפיתל אנושיים נגזר DF הם תרבית עם מדיה ללא סרום דומה לתאי אפיתל אנושיים אחרים, כגון קרטינוציטים אפידרמיס אנושי נורמלי וקרטינוציטים אוראליים אנושי נורמלי8,9. זה מרמז על הבדלים פיזיולוגיים או תפקודיים בין תאי אפיתל שיניים מכרסמים ותאי אפיתל שיניים אנושיים. הבנת המנגנון לגבי אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות שיניים עשויה לתרום להתפתחות יישומים קליניים, כולל חיבור חניכיים במהלך נטיעה מחדש, התחדשות חניכיים במחלת חניכיים, התחדשות קומפלקס עיסת-דנטין, ויצירת ביו-שן. בהתחשב במאפייני המחקר התרגומי, תאי אפיתל שיניים אנושיים עשויים להיות מתאימים יותר מתאי אפיתל דנטלי מכרסמים לחקר אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות.
DF האנושי הוא רקמת חיבור רופפת ולעתים קרובות שוכן בשן מושפעת. DF מכיל מבשרים mesenchymal10. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אף מחקר לא דיווח על בידוד של תאי אפיתל מזקיקי שיניים לפני 2021. הו ויי דיווחו על בידוד תאי אפיתל מ-DF אנושי בשנת 20218. הפנוטיפ האפיתל אושר על ידי ניתוח סופג ומורפולוגי מערבי. ניתוח מקורם של תאי אפיתל שמקורם ב-DF הדגים תוצאות דומות עם מחקרים אחרים. תאי אפיתל שמקורם ב-DF לא היו אנדותל ולא hematopoietic5,11, ו-Oh ו-Yi הציעו לקרוא לתאים אלה כ-DF-HERSCs. ל- DF יש נפח גדול יותר מה- PDL, וניתן לבודד תאים אפיתל יותר מה- DF. זה משפר את הופעתם של מושבות אפיתל ותוצאות שיעור הצלחה גבוה בקציר תאי אפיתל מ- DF. מחקר זה מציע להשתמש ב- DF כמקור רקמה לבידוד של תאי אפיתל דנטליים.
במחקר הנוכחי, תאים בודדים היו מבודדים מן DF על פי נהלים שתוארו בעבר10,12. ה- DF מכיל אוכלוסיות תאים הטרוגניים, ומספר סוגי תאים עשויים להיות נוכחים בשלב המוקדם של ההליך. מורצ'ק ועמיתיו בודדו תאי גזע מזנכימליים שמקורם ב-DF10. שיערנו כי DF מכיל תאי אפיתל וכי רק תאי אפיתל יכולים לשרוד בתנאים ללא סרום. מחקר זה שונה מזה של מורצ'ק ואח ' במונחים של בחירת האוכלוסייה האפיתלית ועיכוב של תאים mesenchymal. הבחירה בוצעה באמצעות מדיה נטולת סרום קרטינוציט (SFM), המאפשרת התפשטות תאי אפיתל ומעכבת את התפשטות התאים המנשימליים. מחקר זה מקורו בדו"ח של Oh ו- Yi8. מטרת מחקר זה הייתה לתאר פרטים על השיטה המשמשת בדו"ח זה לבידוד תאי אפיתל מ- DF אנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של בית החולים האוניברסיטאי קיונג הי בגנגדונג (אישור IRB לא. KHNMC 2017-06-009).
1. איסוף DF
הערה: המטופלים נתנו הסכמה מדעת לפני הניתוח להסרת טוחנת שלישית בוגרת או לא בוגרת. חולים עם המחלה הבאה הוחרגו: סוכרת, יתר לחץ דם, שחפת, הפטיטיס, תסמונת חיסונית נרכשת. נשים בהריון גם הוחרגו.
- קציר DF במהלך החילוץ הכירורגי של טחנות שלישיות שהושפעו (איור 1A).
הערה: הניתוח בוצע על ידי מנתח מקסילופסיאלי אוראלי. שיתוף פעולה נדרש עם רופא שיניים לאיסוף רקמות. - יש לאחסן את DF בתמצית מלח עם אגירת פוספט (DPBS) של Dulbecco עם 3% פניצילין-סטרפטומיצין ב-4 °C (70 °F) לפני השימוש. בצעו הליכי בידוד ביום קציר DF (איור 1B).
2. לבודד אוכלוסיות חד-תאיות מ-DF
- הכן פתרונות מלאי מסוג קולגנאז I ופרוטאז ב- DPBS כך שריכוזים סופיים של סוג קולגנאז I ופרוטאז הם 1 מ"ג / מ"ל ו 2.4 מ"ג / מ"ל, בהתאמה.
- הכן שלושה צינורות כביסה 50 מ"ל עם 20 מ"ל של DPBS לכל צינור. תייג את הצינורות כ- 1, 2 ו- 3.
- לשטוף את DF בצינורות הכביסה ברצף. החזק את DF עם פינצטה ומניחים את DF בצינור 1. קח את DF מתוך צינור 1 ומניח אותו בצינור 2. קח את DF מתוך צינור 2 ומניח אותו בצינור 3. יש לנער בעדינות את DF 10-15 פעמים בכל שפופרת. לאחר הכביסה שלוש פעמים, הניחו את ה-DF בצלחת תרבות של 60 מ"מ (איור 2A).
- טחון את ה-DF במספריים של רקמות (איור 2B). מעבירים רק חלק קטן לצלחת התרבות כדי למזער את אובדן הרקמות. חזרו על החיתוך עד של-DF יהיה מראה נוצץ או מעוך (איור 2C).
- לערבב 1 מ"ל של קולגנאז סוג I ו 1 מ"ל של פתרון פרוטאז בצינור חרוט 15 מ"ל כדי להשיג ריכוזים סופיים של 1 מ"ג / מ"ל ו 2.4 מ"ג / מ"ל, בהתאמה.
- העבר את DF טחון לתוך צינור חרוט 15 מ"ל מ שלב 2.5. לנער בעדינות לדגור על הצינור במשך 1 שעה ב 37 °C (7 °F).
- הוסף 5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לצינור, לנער, ולדגירה את הצינור במשך 15 דקות ב 37 °C (50 °F).
- הכן קרטינוציט בינוני המכיל קרטינוציט SFM 10% סרום בקר עוברי (FBS). הוסף 3 מ"ל של מדיום קרטינוציטים לתוך צינור חרוט חדש 50 מ"ל. מניחים מסננת 40 מיקרומטר על גבי צינור זה ולהשתמש פיפטה סרולוגית 10 מ"ל כדי לשאוף את supernatant מ שלב 2.6 ולהעביר אותו דרך מסננת.
הערה: מזער את שילובם של שרידי רקמות מעוכלות תוך כדי נטילת supernatant. הסר את שרידי הרקמה עם מסננת 40 מיקרומטר כדי למזער את הכישלון. שרידי רקמות עשויים לעבור דרך מסנני 70 מיקרומטר ולעכב היווצרות המושבה. FBS במדיום קרטינוציט ינטרל את האנזימים. - חזור על שלבים 2.7 ו- 2.8.
- העבר את ההשעיה שנאספו לצינור חרוט 15 מ"ל.
- צנטריפוגה צינור חרוט 15 מ"ל ב 288 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (5 °F). הסר את סופר-טבעי.
הערה: היזהר כדי למנוע הסרה מקרית של תאים כדוריים, שהם בעיקר בלתי נראים. - הוסף 3 מ"ל של קרטינוציט SFM ולשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל pipette עם centrifugation כמו בשלב 2.11.
- צלחת האוכלוסייה של תא יחיד לתוך צלחת תרבות 60 מ"מ באמצעות קרטינוציט SFM. לשמור על צלחת התרבות עם נפח סופי של 5 מ"ל באווירה לחה של 5% CO2 ב 37 °C (5 °F). לשנות את המדיום התרבות מדי יום עד אין רקמה או פסולת התא נצפים.
הערה: הסר פסולת צפה במדיום התרבות על-ידי שינוי המדיום. הסרה מאוחרת של פסולת רקמות או תאים מתים יש השפעה שלילית על התרבות העיקרית. - בדקו את הלוחית החל מ-2.13 כדי לבדוק את הצמיחה של תאי האפיתל (איור 3A).
הערה: תאי אפיתל לגדול בתוך 7-10 ימים לאחר ציפוי אוכלוסיות תא יחיד. - להרחיב את מושבות האפיתל ותת-תרבות התאים.
- לשאוף את המדיום ולשטוף את החלק התחתון של צלחת התרבות פעם אחת עם 3 מ"ל של קרטינוציט SFM.
- הוסף 2 מ"ל של פרוטאז דיסוציאציה לתא ודגרה באטמוספירה לחה של 5% CO2 ב 37 °C (7 °F) במשך 3 דקות.
הערה: חזור על שלב 2.15.2 אם ניתוק התא אינו יעיל. - מוסיפים 2 מ"ל של קרטינוציט בינוני לצלחת התרבות ומעבירים את התוכן בצינור חרוטי 15 מ"ל.
הערה: אין צורך להוסיף אמצעי קרטינוציטים נוסף אם שלב 2.15.2 חוזר על עצמו. - צנטריפוגה צינור חרוט 15 מ"ל ב 288 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (5 °F).
- הסר את supernatant ולשטוף את גלולה התא פעמיים עם 3 מ"ל של קרטינוציט SFM.
- צלחת התאים בצלחת תרבית 100 מ"מ באמצעות קרטינוציט SFM (נפח סופי של 10 מ"ל לכל צלחת 100 מ"מ).
- הכן ולאחסן מלאי תאים במיכל חנקן נוזלי.
- תאי קציר כמתואר בשלבים 2.15.1-2.15.5.
- להפיץ את התאים לתוך cryovials ב 1 מ"ל של בינוני מקפיא (80% קרטינוציט SFM, 10% דימתילסולפוקסיד, 10% FBS).
- מניחים את הבקבוקונים במיכל הקפאה ומאחסנים אותם ב -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- מעבירים את הבקבוקונים מהמקפיא העמוק למיכל חנקן נוזלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קצירת DF
הניתוח בוצע על ידי מנתח מקסילופסיאלי אוראלי. חומרים שמקורם בבני אדם, כולל שבר השן, רקמת חניך ו-DF, נאספו על ידי מנתח (איור 1A). ייתכן שהמו"ר מחובר לרסיס השן. מנתח מקסילופסיאלי אוראלי יוכל לזהות את DF. שיתוף פעולה ותקשורת עם המנתח נדרשים לאיסוף רקמות. DF הוא רקמה דמוית ממברנה בצורה לא סדירה. רקמת חניך יש משטח קרטין והוא יכול להיות נבדל מן DF. רקמת עיסת שוכנת בתא עיסת והוא מופרד לעתים רחוקות מן השיניים במהלך הניתוח. ה-DF מאוחסן ב-DPBS עם 3% פניצילין-סטרפטומיצין ב-4 °C לפני השימוש (איור 1B).
טיפול מכני של DF
פסולת רקמות ודם הוסרו על ידי שטיפת DF עם DPBS. שלושה צינורות חרוט הוכנו עם תמיסת כביסה. לאחר הכביסה, ה-DF הועבר לצלחת תרבות של 60 מ"מ או 100 מ"מ (איור 2A). יש לכרות את ה-DF במספריים עד שלרקמה יש מראה עגמום או רגשני (איור 2B, C).
הופעתה של אוכלוסיית האפיתל
לאחר ציפוי אוכלוסיות תאים הטרוגניים, תאים רבים ופסולת קטנה צפו במדיום התרבות. מספר התאים הצפים ירד בהדרגה עם שינויים בינוניים רצופים. שינוי בינוני מושהה עלול לגרום לסביבת תרבות עגמומית. בשלב הראשוני, סוגי תאים שונים מופיעים בתחתית צלחת התרבות אך נעלמים כאשר הם נשמרים בקרטינוציט SFM. תאים עם מורפולוגיה אפיתל מופיעים בתוך 7-10 ימים לאחר ציפוי אוכלוסיות חד-תאיות (איור 3A). מספר התאים בצורת אבן הריצוף נע בין 1 ל-10 בעת הופעתם של תאי אפיתל, המתרחבים למושבות לאורך זמן (איור 3B).
הליך הכרייה חזר על עצמו כדי להגדיל את אזור המגע של DF עם 0.05% טריפסין-EDTA כדי לקדם דיסוציאציה לתא. יותר תאים בודדים נקצרו מעיסת DF מאשר DF שלם. הדביקות של עיסת DF הצביעה על ההסתברות להצלחה של בידוד של תאי אפיתל. שינויים בינוניים יומיים מנעו את ה- SFM של קרטינוציטים להפוך לערד, וזה חשוב להישרדות תאי האפיתל.
איור 1: חומרים שמקורם בבני אדם. (א) חומרים שמקורם בבני אדם נאספו על ידי מנתח מקסילופסיאלי אוראלי. החץ הצהוב מציין את DF. חצים שחורים מצביעים על שבר השן ועל הרקמה הרכה המחוברת לשיניים. (B) DF מאוחסן PBS בתוספת 3% פניצילין-סטרפטומיצין ב 4 °C (50 °F). נהלי הבידוד בוצעו תוך 24 שעות מהאיסוף. קיצורים: DF = זקיק שיניים; PBS = תמיסת מלח עם אגירה בפוספט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: טיפול זקיקי שיניים. (A) ה-DF הועבר לצלחת תרבות של 60 מ"מ לאחר שטיפה עם DPBS שלוש פעמים. (ב) DF היה טחון עם מספריים רקמה. (ג) ל-DF הטחון היה מראה עמוץ או רגשני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הופעתם של תאי אפיתל. (A) תאים עם מורפולוגיה אפיתל מופיעים בתוך 7-10 ימים לאחר ציפוי אוכלוסיות של תאים בודדים. (B) הרחבת Ex vivo של תאי אפיתל שמקורם ב- DF על ידי תת-תרבות. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצור: DF = זקיק שיניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה כולל שלבים קריטיים. קצירת אוכלוסיות חד-תאיות חיונית לבידוד מוצלח של תאי אפיתל מ-DF. ביקשנו לבודד תאי אפיתל מה-DF בהתבסס על ההשערה שלנו שיש יותר תאי אפיתל ב-DF. הליך הכרייה משפר את הניתוק והשחרור של תאים מה- DF. הליך הכרייה שופר, וכרייה חוזרת על עצמה עד DF נראה pulpy כדי להקל על שחרור של תאים בודדים. השגת המספר המרבי של תאים בודדים מגדילה את ההסתברות להופעתה של אוכלוסיית האפיתל. זיהום מתרחש לעתים קרובות במהלך הבידוד של תאי אפיתל מן DF. השימוש במסננים של 40 מיקרומטר ממזער את הכללת פסולת הרקמות באוכלוסיות חד-תאיות, שכן שרידי רקמות יכולים לעבור דרך מסנני 70 מיקרומטר ולעכב קולוניזציה של תאי אפיתל.
תאי אפיתל נראים פגיעים יותר לסביבות מסוימות מאשר תאים מזנכילים, והשינוי היומיומי של המדיום התרבותי סיפק גם סביבה נקייה להופעת אוכלוסיית האפיתל. אובדן תאים עקב שינוי בינוני תכוף עשוי להיות מגבלה של פרוטוקול זה. עם זאת, שינוי יומי של המדיום בוצע לאחר פתרון בעיות עבור פרוטוקול זה, וכתוצאה מכך, תאי אפיתל הופיעו והתרחבו. עיכוב השינוי הבינוני יכול להשפיע על התרבויות. כמו גלולה התא לאחר centrifugation הוא כמעט בלתי נראה, הקצה הצר של צינור חרוטי 15 מ"ל מגביר את הקלות של הסרת supernatant מבלי לאבד את גלולה התא. לכן, פרוטוקול זה מציע להעביר את התוכן של צינור חרוט 50 מ"ל לצינור חרוט 15 מ"ל.
ה-DF מספק נפח גדול יותר של רקמה ויותר תאים בודדים מה-PDL. לפיכך, DF יכול לשמש במקום PDL כמקור רקמה לבידוד של תאי אפיתל שיניים אנושיים. בחירה ועיכוב של סוגי תאים ב- DF יכול להיעשות פשוט באמצעות מדיום תרבות סלקטיבית. SFM גורמת לצמיחה אפיתל, בעוד בינוני המכיל סרום בוחר עבור תאים mesenchymal. מתודולוגיה זו מאפשרת נגישות קלה לתאי אפיתל שיניים אנושיים. מורצ'ק ועמיתיו בודדו בעבר מבשרים מזנכימליים שמקורם ב-DF. מחקר זה שונה משלהם על ידי בחירת אוכלוסיות אפיתל ועיכוב של תאים mesenchymal.
התפקיד הרגולטורי של תאי אפיתל שיניים במהלך היווצרות שיניים הוא עניין רב במחקר שיניים. לימוד אינטראקציות אפיתל-mesenchymal במהלך התפתחות השיניים עשוי להציע רמזים לפתרון בעיות קליניות13. התחדשות רקמות על ידי שילוב רכיבים אפיתל ומנשימלי כבר ניסה14. גורמים שמקורם בתא אפיתל דנטלי, כגון נגזרת מטריצת אמייל, הוערכו כיעדים טיפוליים שמטרתם התחדשות חניכיים, התחדשות קומפלקס עיסת-דנטין, ו חיבור חניכיים2,15. השילוב של גורמי התחדשות, כולל תאי גזע, יריעות תאים אפיתל-מזנכימליים, גורמים שמקורם בתאים וביו-חומרים, עשוי ליצור ביו-שיניים במקרה של אובדן שיניים או agenesis16. גנים הקשורים לגילאי שיניים, כגון PAX9, MSX1, AXIN2, EDA, EDAR ו- WNT10A, הם גנים רגולטוריים מרכזיים פוטנציאליים עבור אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות17. יתר על כן, הדור הבא של נתונים נגזרים שיטת רצף ממחקרים הקשורים לעידן השיניים עשוי להציע באופן דומה גנים חדשניים putative היעד המסדיר שליטה מולקולרית במהלך אינטראקציות אפיתל-מזנכימלי שיניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מקרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (NRF-2017R1C1B2008406 ו- NRF-2021R1F1A1064350). ד"ר הי-יון באי סיפק בחביבות את ה-DF לתרבות העיקרית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
References
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).
- Choung, H. W., et al. The effect of CPNE7 on periodontal regeneration. Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).
- Li, X., et al. Development of immortalized Hertwig's epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3 (2019).
- Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. Fate of HERS during tooth root development. Developmental Biology. 334 (1), 22-30 (2009).
- Farea, M., et al. Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig's epithelial root sheath cell population. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).
- Jung, H. S., et al. Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells. Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).
- Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment. International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).
- Oh, J. E., Yi, J. K. Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig's epithelial root sheath cells. Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).
- Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Lee, J. H., et al. Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig's epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway. European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).
- Wan, A. C. A. Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction - are biomaterials dispensable. Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
- Guo, Y., et al. Are Hertwig's epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells. Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).
- Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots. Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).
- Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. The crowning achievement: getting to the root of the problem. Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).
- Bonczek, O., et al. Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer. Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).
