Summary
Le follicule dentaire contient une population épithéliale et des cellules mésenchymateuses. La population épithéliale a été sélectionnée parmi la population hétérogène de cellules folliculaires dentaires en fournissant un milieu de culture distinct. Les cellules épithéliales ont survécu et ont formé des colonies dans un milieu sans sérum.
Abstract
Le follicule dentaire (DF) a été prélevé lors de l’ablation d’une troisième molaire impactée par un chirurgien maxillo-facial buccal. L’isolement des cellules épithéliales a été effectué le jour de la récolte de DF. Le DF a été lavé trois fois avec du DPBS, puis disséqué avec des ciseaux à tissu jusqu’à ce que le tissu ait une consistance pulpeuse ou squishy. Les populations unicellulaires ont été granulées par centrifugation et lavées avec un milieu sans sérum de kératinocytes. Des populations cellulaires hétérogènes ont été distribuées dans une boîte de culture. Un milieu sans sérum de kératinocytes a été utilisé pour sélectionner les cellules épithéliales. Le milieu de culture a été modifié quotidiennement jusqu’à ce qu’aucun débris flottant ou cellules mortes n’ait été observé. Les cellules épithéliales sont apparues dans les 7 à 10 jours suivant la distribution de la population cellulaire. Les cellules épithéliales ont survécu dans un milieu sans sérum, tandis que le milieu essentiel minimal α-modification complété par 10% de sérum bovin fœtal a permis la prolifération de cellules de type mésenchymateux. Le DF est une source tissulaire pour l’isolement des cellules épithéliales dentaires.
Le but de cette étude était d’établir une méthode pour l’isolement des cellules épithéliales de la DF humaine. Le ligament parodontal (PDL) a été utilisé pour l’isolement des cellules épithéliales dentaires humaines. L’obtention de cellules épithéliales à partir de PDL humaine n’est pas toujours efficace en raison du petit volume de tissu, ce qui entraîne un faible nombre de cellules épithéliales. DF a un volume plus grand que PDL et contient plus de cellules. Le DF peut être une source tissulaire pour la culture primaire de cellules épithéliales dentaires humaines. Ce protocole est plus facile et plus efficace que la méthode d’isolement utilisant PDL. L’obtention de cellules épithéliales dentaires humaines peut faciliter d’autres études sur les interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires.
Introduction
La formation des dents commence par l’invagination de l’épithélium buccal1. Selon le stade de développement de la dent, l’épithélium buccal a différents noms, y compris l’épithélium de l’émail interne et externe, l’anse cervicale et la gaine de la racine épithéliale de Hertwig (HERS). Les compartiments épithéliaux communiquent avec les cellules mésenchymateuses environnantes. Les interactions épithéliales-mésenchymateuses régulent la formation des dents et la régénération des tissus. L’obtention de cellules épithéliales dentaires, telles que les kératinocytes oraux et les cellules de la gaine de la racine épithéliale de Hertwig (HERSC), est cruciale pour l’étude des interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires2.
Les cellules épithéliales dentaires dérivées de rongeurs sont isolées de la structure épithéliale, comme le HERS. Li et ses collègues ont isolé et immortalisé des HERSC dérivés de molaires de rat après avoir récolté la partie apicale des germes dentaires en développement de rats âgés de 8 jours3. Le HERS a été séparé du tissu apical sous grossissement. Compte tenu du stade de développement et de l’âge des dents, il est presque impossible de prélever le HERS sur les humains en raison de problèmes éthiques: un germe dentaire en développement doit être retiré d’un jeune enfant pour récolter le HERS humain. Les germes dentaires immatures sont rarement extraits. Les cellules épithéliales dentaires humaines peuvent être isolées de la gencive et du ligament parodontal (PDL). Les cellules dérivées de la structure épithéliale participent à la formation des dents avec des composants mésenchymateux et pourraient être plus appropriées pour l’étude des interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires que les kératinocytes oraux. Les restes épithéliaux de Malassez (ERM) sont des restes épithéliaux dérivés de HERS et résident en petit nombre dans le PDL4. Des études font état de l’isolement des HERSC humains de PDL5. Cependant, la récolte de HERSC humains à partir de tissu PDL n’est pas toujours couronnée de succès en raison de la rareté de la population épithéliale à cet endroit5,6.
Bien que les HERSC dérivés de rongeurs soient maintenus dans des milieux contenant du sérum3,7, les cellules épithéliales humaines dérivées du DF sont cultivées avec des milieux sans sérum similaires à d’autres cellules épithéliales humaines, telles que les kératinocytes épidermiques humains normaux et les kératinocytes oraux humains normaux8,9. Cela implique des différences physiologiques ou fonctionnelles entre les cellules épithéliales dentaires des rongeurs et les cellules épithéliales dentaires humaines. La compréhension du mécanisme concernant les interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires pourrait contribuer au développement d’applications cliniques, y compris la réattachement parodontal pendant la replantation, la régénération parodontale dans les maladies parodontales, la régénération du complexe pulpe-dentine et la génération de bio-dent. Compte tenu des caractéristiques de la recherche translationnelle, les cellules épithéliales dentaires humaines peuvent être plus appropriées que les cellules épithéliales dentaires de rongeurs pour l’étude des interactions épithéliales-mésenchymateuses.
Le DF humain est un tissu conjonctif lâche et réside souvent dans une dent touchée. Le DF contient des précurseurs mésenchymateux10. Cependant, à notre connaissance, aucune étude n’a rapporté l’isolement des cellules épithéliales des follicules dentaires avant 2021. Oh et Yi ont rapporté l’isolement des cellules épithéliales de la DF humaine en 20218. Le phénotype épithélial a été confirmé par transfert occidental et analyse morphologique. L’analyse de l’origine des cellules épithéliales dérivées du DF a montré des résultats similaires avec d’autres études. Les cellules épithéliales dérivées du DF n’étaient ni endothéliales ni hématopoïétiques5,11, et Oh et Yi ont suggéré de nommer ces cellules comme DF-HERSC. Le DF a un volume plus important que le PDL, et plus de cellules épithéliales peuvent être isolées du DF. Cela favorise l’émergence de colonies épithéliales et se traduit par un taux de réussite élevé dans la récolte des cellules épithéliales à partir de DF. Cette étude suggère d’utiliser le DF comme source tissulaire pour l’isolement des cellules épithéliales dentaires.
Dans la présente étude, des cellules individuelles ont été isolées du DF selon les procédures décrites précédemment10,12. Le DF contient des populations cellulaires hétérogènes, et plusieurs types de cellules pourraient être présents au début de la procédure. Morsczek et ses collègues ont isolé des cellules souches mésenchymateuses dérivées du DF10. Nous avons émis l’hypothèse que le DF contient des cellules épithéliales et que seules les cellules épithéliales peuvent survivre dans des conditions sans sérum. Cette étude diffère de celle de Morsczek et al. en termes de sélection de la population épithéliale et d’inhibition des cellules mésenchymateuses. La sélection a été réalisée à l’aide de milieux sans sérum kératinocytes (SFM), qui permettent la prolifération des cellules épithéliales et inhibent la prolifération des cellules mésenchymateuses. Cette étude provient d’un rapport de Oh et Yi8. L’objectif de cette étude était de décrire les détails de la méthode utilisée dans ce rapport pour isoler les cellules épithéliales de la DF humaine.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le Comité d’examen institutionnel de l’hôpital universitaire Kyung Hee de Gangdong (approbation de la CISR no. KHNMC 2017-06-009).
1. Collecter DF
REMARQUE: Les patients ont donné leur consentement éclairé avant la chirurgie pour l’ablation d’une troisième molaire touchée mature ou immature. Les patients atteints de la maladie suivante ont été exclus: diabète, hypertension, tuberculose, hépatite, syndrome d’immunodéficience acquise. Les femmes enceintes ont également été exclues.
- Récolter le DF lors de l’extraction chirurgicale des troisièmes molaires touchées (Figure 1A).
REMARQUE: La chirurgie a été effectuée par un chirurgien maxillo-facial buccal. Une coopération est nécessaire avec un dentiste pour la collecte de tissus. - Conserver le DF dans la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco avec 3 % de pénicilline-streptomycine à 4 °C avant utilisation. Effectuer des procédures d’isolement le jour de la récolte du DF (Figure 1B).
2. Isoler les populations unicellulaires de DF
- Préparer des solutions mères de collagénase de type I et de protéase dans du DPBS de sorte que les concentrations finales de collagénase de type I et de protéase soient respectivement de 1 mg/mL et de 2,4 mg/mL.
- Préparez trois tubes de lavage de 50 mL avec 20 mL de DPBS par tube. Étiquetez les tubes comme 1, 2 et 3.
- Lavez le DF dans les tubes de lavage séquentiellement. Tenez le DF avec une pince à épiler et placez le DF dans le tube 1. Sortez le DF du tube 1 et placez-le dans le tube 2. Sortez le DF du tube 2 et placez-le dans le tube 3. Agiter doucement DF 10-15 fois dans chaque tube. Après trois lavages, placez le DF dans une boîte de culture de 60 mm (Figure 2A).
- Hachez le DF avec des ciseaux à tissu (Figure 2B). Ne transférez qu’une petite partie dans le plat de culture pour minimiser la perte de tissu. Répétez la coupe jusqu’à ce que le DF ait un aspect pulpeux ou squishy (Figure 2C).
- Mélanger 1 mL de collagénase de type I et 1 mL de solution de protéase dans un tube conique de 15 mL pour obtenir des concentrations finales de 1 mg/mL et 2,4 mg/mL, respectivement.
- Transférer le DF haché dans le tube conique de 15 mL à partir de l’étape 2.5. Agiter doucement et incuber le tube pendant 1 h à 37 °C.
- Ajouter 5 mL de 0,05 % de trypsine-EDTA dans le tube, agiter et incuber le tube pendant 15 min à 37 °C.
- Préparer un milieu kératinocyte contenant du Kératinocyte SFM 10% de sérum fœtal bovin (FBS). Ajouter 3 mL de milieu kératinocyte dans un nouveau tube conique de 50 mL. Placez une passoire de 40 μm sur le dessus de ce tube et utilisez une pipette sérologique de 10 mL pour aspirer le surnageant de l’étape 2.6 et le faire passer à travers la passoire.
REMARQUE: Minimiser l’incorporation des restes de tissu digérés pendant la prise du surnageant. Retirez les restes de tissu avec une passoire de 40 μm pour minimiser la défaillance. Les restes tissulaires peuvent passer à travers des passoires de 70 μm et entraver la formation de colonies. FBS dans le milieu kératinocytes va inactiver les enzymes. - Répétez les étapes 2.7 et 2.8.
- Transférer la suspension collectée dans un tube conique de 15 mL.
- Centrifuger le tube conique de 15 mL à 288 × g pendant 3 min à 4 °C. Retirez le surnageant.
REMARQUE: Veillez à éviter tout retrait accidentel des cellules granulées, qui sont pour la plupart invisibles. - Ajouter 3 mL de MFM kératinocytes et laver les cellules deux fois avec une pipette de 1 mL avec centrifugation comme à l’étape 2.11.
- Plaquer la population unicellulaire dans une boîte de culture de 60 mm à l’aide de SFM kératinocytes. Maintenir la boîte de culture avec un volume final de 5 mL dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 °C. Changer le milieu de culture quotidiennement jusqu’à ce qu’aucun débris tissulaire ou cellulaire ne soit observé.
REMARQUE: Enlevez les débris flottants dans le milieu de culture en changeant le milieu. L’élimination tardive des débris tissulaires ou des cellules mortes a un effet défavorable sur la culture primaire. - Examinez la plaque à partir de l’étape 2.13 pour vérifier la croissance des cellules épithéliales (Figure 3A).
REMARQUE: Les cellules épithéliales se développent dans les 7 à 10 jours suivant le placage des populations unicellulaires. - Développer les colonies épithéliales et sous-cultiver les cellules.
- Aspirer le milieu et laver le fond de la plaque de culture une fois avec 3 mL de MDF kératinocytes.
- Ajouter 2 mL de protéase de dissociation cellulaire et incuber dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 °C pendant 3 min.
REMARQUE : Répétez l’étape 2.15.2 si le détachement de cellule n’est pas efficace. - Ajouter 2 mL de milieu kératinocyte à la plaque de culture et transférer le contenu dans un tube conique de 15 mL.
REMARQUE: L’ajout de plus de milieu kératinocyte n’est pas nécessaire si l’étape 2.15.2 est répétée. - Centrifuger le tube conique de 15 mL à 288 × g pendant 3 min à 4 °C.
- Retirez le surnageant et lavez la pastille cellulaire deux fois avec 3 mL de MDF kératinocyte.
- Plaquer les cellules dans une boîte de culture de 100 mm à l’aide de SFM kératinocytes (volume final de 10 mL par boîte de 100 mm).
- Préparez et stockez les stocks de cellules dans un réservoir d’azote liquide.
- Récolter les cellules comme décrit aux étapes 2.15.1 à 2.15.5.
- Distribuer les cellules en cryoviales dans 1 mL de milieu de congélation (80% de SFM de kératinocytes, 10% de diméthylsulfoxyde, 10% de FBS).
- Placer les flacons dans un récipient congelé et les conserver à -80 °C pendant 24 h.
- Transférer les flacons du congélateur dans un réservoir d’azote liquide.
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Representative Results
Récolte de DF
La chirurgie a été réalisée par un chirurgien maxillo-facial buccal. Les matériaux d’origine humaine, y compris le fragment de dent, le tissu gingival et le DF, ont été recueillis par un chirurgien (Figure 1A). Le DF peut être attaché au fragment de dent. Un chirurgien maxillo-facial buccal sera en mesure d’identifier le DF. La coopération et la communication avec le chirurgien sont nécessaires pour la collecte de tissus. Le DF est un tissu membranaire de forme irrégulière. Le tissu gingival a une surface kératinisée et peut être distingué du DF. Le tissu pulpaire réside dans la chambre pulpaire et est rarement séparé des dents pendant la chirurgie. Le DF a été stocké dans le DPBS avec 3 % de pénicilline-streptomycine à 4 °C avant utilisation (figure 1B).
Traitement mécanique du DF
Les débris tissulaires et le sang ont été enlevés en lavant le DF avec du DPBS. Trois tubes coniques ont été préparés avec une solution de lavage. Après le lavage, le DF a été transféré sur une boîte de culture de 60 mm ou 100 mm (figure 2A). Le DF doit être haché avec des ciseaux jusqu’à ce que le tissu ait un aspect pulpeux ou pâteux (Figure 2B, C).
Émergence de la population épithéliale
Après avoir plaqué des populations cellulaires hétérogènes, de nombreuses cellules et de petits débris ont flotté dans le milieu de culture. Le nombre de cellules flottantes a progressivement diminué avec les changements successifs du milieu. Un changement de milieu retardé peut causer un environnement de culture trouble. Au stade initial, différents types de cellules apparaissent au fond de la boîte de culture, mais disparaissent lorsqu’ils sont maintenus dans la GDF kératinocytes. Les cellules ayant une morphologie épithéliale apparaissent dans les 7 à 10 jours suivant le placage des populations unicellulaires (figure 3A). Le nombre de cellules en forme de pavé varie de 1 à 10 au moment de l’émergence des cellules épithéliales, qui se développent en colonies au fil du temps (figure 3B).
La procédure de hachage a été répétée pour augmenter la zone de contact DF avec 0,05% de trypsine-EDTA pour favoriser la dissociation cellulaire. Plus de cellules individuelles ont été récoltées à partir de la pulpe de DF que de DF intacte. L’adhérence de la pulpe DF indiquait la probabilité de succès de l’isolement des cellules épithéliales. Les changements quotidiens du milieu ont empêché la MDF kératinocytes de devenir trouble, ce qui est important pour la survie des cellules épithéliales.
Figure 1 : Matériaux d’origine humaine. (A) Des matériaux d’origine humaine ont été collectés par un chirurgien maxillo-facial buccal. La flèche jaune indique le DF. Des flèches noires indiquent le fragment de dent et les tissus mous attachés aux dents. (B) Le DF a été stocké dans du PBS complété par 3 % de pénicilline-streptomycine à 4 °C. Les procédures d’isolement ont été effectuées dans les 24 heures suivant la collecte. Abréviations : DF = follicule dentaire; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Traitement des follicules dentaires. (A) Le DF a été transféré dans une boîte de culture de 60 mm après avoir été lavé trois fois avec du DPBS. (B) Le DF a été haché avec des ciseaux à tissu. (C) Le DF haché avait un aspect pulpeux ou pâteux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Émergence des cellules épithéliales. (A) Les cellules à morphologie épithéliale apparaissent dans les 7 à 10 jours suivant le placage des populations unicellulaires. (B) Expansion ex vivo de cellules épithéliales dérivées du DF par sous-culture. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviation : DF = follicule dentaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole comprend des étapes critiques. La récolte de populations unicellulaires est essentielle à l’isolement réussi des cellules épithéliales de la DF. Nous avons cherché à isoler les cellules épithéliales du DF en nous basant sur notre hypothèse qu’il y a plus de cellules épithéliales dans le DF. La procédure de hachage améliore le détachement et la libération des cellules du DF. La procédure de hachage a été améliorée et le hachage a été répété jusqu’à ce que le DF apparaisse pulpeux pour faciliter la libération de cellules individuelles. L’obtention du nombre maximum de cellules individuelles augmente la probabilité de l’émergence de la population épithéliale. La contamination se produit fréquemment lors de l’isolement des cellules épithéliales du DF. L’utilisation de passoires de 40 μm minimise l’inclusion de débris tissulaires dans les populations unicellulaires, car les restes tissulaires peuvent traverser des passoires de 70 μm et inhiber la colonisation des cellules épithéliales.
Les cellules épithéliales semblent être plus vulnérables à certains environnements que les cellules mésenchymateuses, et le changement quotidien du milieu de culture a également fourni un environnement propre pour l’émergence de la population épithéliale. La perte de cellules due à un changement fréquent de milieu peut être une limitation de ce protocole. Cependant, un changement quotidien du milieu a été effectué après le dépannage de ce protocole et, par conséquent, des cellules épithéliales sont apparues et se sont développées. Retarder le changement de milieu peut affecter les cultures. Comme la pastille cellulaire après centrifugation est presque invisible, l’extrémité étroite d’un tube conique de 15 mL augmente la facilité d’élimination du surnageant sans perdre la pastille cellulaire. Par conséquent, ce protocole suggère de transférer le contenu du tube conique de 50 mL dans un tube conique de 15 mL.
Le DF fournit un plus grand volume de tissu et plus de cellules individuelles que le PDL. Par conséquent, le DF peut être utilisé à la place du PDL comme source de tissu pour l’isolement des cellules épithéliales dentaires humaines. La sélection et l’inhibition des types cellulaires dans le DF peuvent se faire simplement à travers un milieu de culture sélectif. La GDF induit la croissance épithéliale, tandis que le milieu contenant du sérum sélectionne les cellules mésenchymateuses. Cette méthodologie permet un accès facile aux cellules épithéliales dentaires humaines. Morsczek et ses collègues ont précédemment isolé des précurseurs mésenchymateux dérivés du DF. Cette étude diffère de la leur par la sélection des populations épithéliales et l’inhibition des cellules mésenchymateuses.
Le rôle régulateur des cellules épithéliales dentaires lors de la formation des dents est d’un grand intérêt dans la recherche dentaire. L’étude des interactions épithéliales-mésenchymateuses au cours du développement des dents peut suggérer des indices pour la résolution de problèmes cliniques13. La régénération tissulaire par combinaison de composants épithéliaux et mésenchymateux a été tentée14. Les facteurs dérivés des cellules épithéliales dentaires, tels qu’un dérivé de la matrice de l’émail, ont été évalués comme cibles thérapeutiques visant la régénération parodontale, la régénération du complexe pulpe-dentine et le rattachement parodontal2,15. La combinaison de facteurs de régénération, y compris les cellules souches, les feuilles de cellules épithéliales-mésenchymateuses, les facteurs dérivés de cellules et les biomatériaux, peut générer des bio-dents en cas de perte de dents ou d’agénésie16. Les gènes associés à l’agénésie dentaire, tels que les gènes PAX9, MSX1, AXIN2, EDA, EDAR et WNT10A, sont des gènes régulateurs clés potentiellement candidats pour les interactions épithéliales-mésenchymateuses17. En outre, les données dérivées de la méthode de séquençage de nouvelle génération provenant d’études associées à l’agénésie dentaire peuvent également proposer de nouveaux gènes cibles putatifs régulant le contrôle moléculaire au cours des interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par des subventions de la National Research Foundation of Korea (NRF) financées par le gouvernement coréen (NRF-2017R1C1B2008406 et NRF-2021R1F1A1064350). Le Dr Hee-Yeon Bae a gentiment fourni le DF pour la culture primaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
References
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