Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds

Published: February 16, 2022 doi: 10.3791/63107
Automatic Translation
1,3, 1,3, 2,3, 1,3
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Hier presenteren we protocollen voor het detecteren van stikstofmonoxide en zijn biologisch relevante derivaten met behulp van op chemiluminescentie gebaseerde assays met een hoge gevoeligheid.

Abstract

Stikstofmonoxide (NO) activiteit in vivo is de gecombineerde resultaten van de directe effecten, de werking van de derivaten gegenereerd door NO autoxidatie, en de effecten van nitrosated verbindingen. Het meten van NO-metabolieten is essentieel voor het bestuderen van NO-activiteit, zowel op vasculaire niveaus als in andere weefsels, vooral in de experimentele omgevingen waar exogene NO wordt toegediend. Op ozon gebaseerde chemiluminescentietests maken nauwkeurige metingen van NO- en NO-metabolieten mogelijk in zowel vloeistoffen (inclusief plasma, weefselhomogenaten, celculturen) als gasmengsels (bijv. Uitgeademde adem). NO reageert met ozon om stikstofdioxide te genereren in een aangeslagen toestand. De daaruit voortvloeiende lichtuitstraling maakt fotodetectie en het genereren van een elektrisch signaal mogelijk dat het NO-gehalte van het monster weerspiegelt. Aliquots uit hetzelfde monster kunnen worden gebruikt om specifieke NO-metabolieten te meten, zoals nitraat, nitriet, S-nitrosothiolen en ijzer-nitrosylcomplexen. Bovendien wordt NO geconsumeerd door celvrij hemoglobine ook gekwantificeerd met chemiluminescentieanalyse. Een illustratie van al deze technieken wordt gegeven.

Introduction

Sinds Salvador Moncada en Nobelprijswinnaars Robert Furchgott, Louis Ignarro en Ferid Murad stikstofmonoxide (NO) identificeerden als de eerder bekende endotheel-afgeleide relaxatiefactor (EDRF), is de centrale rol van NO vastgesteld in verschillende belangrijke mechanismen die zich uitstrekken over vasculaire biologie, neurowetenschappen, metabolisme en gastheerrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Exogene toediening van NO-gas is een gevestigde behandeling geworden voor respiratoire insufficiëntie als gevolg van pulmonale hypertensie bij de pasgeborene8. Stikstofmonoxidegas is ook onderzocht voor de behandeling van respiratoir syncytieel virus (RSV) infectie, malaria en andere infectieuze ziekten, ischemie-reperfusieletsel en voor de preventie van acuut nierletsel bij patiënten die hartchirurgie ondergaan 9,10,11,12. De behoefte aan nauwkeurige meettechnieken om de niveaus van NO, de metabolieten en die van de doeleiwitten en -verbindingen te beoordelen, komt voort uit zowel mechanistische als interventionele studies.

Vanwege de hoge reactiviteit kan NO verschillende reacties ondergaan, afhankelijk van de biologische matrix waarin het wordt geproduceerd en / of vrijgegeven. Bij afwezigheid van hemoglobine (Hb) of andere oxy-hemoproteïnen wordt NO bijna volledig geoxideerd tot nitriet (NO2-).

2NO + O2 → 2NO2

NO2 + NO → N2O3

N2O3 + H2O → NO2- + H+

NO ondergaat eerst autoxidatie met moleculaire zuurstof (O2) om stikstofdioxide (NO2) te verkrijgen en reageert met NO2 zelf om dinitrogentrioxide te genereren (N2O3). Eén molecuul van N2O3 reageert met water (H2O) om twee moleculen van NO2- en een proton (H+)13 te vormen. In volbloed worden14,15, NO en NO2- snel omgezet in nitraat (NO3-) omdat deze moleculen gretig reageren met de geoxideerde heemgroepen van Hb [Hb-Fe2+-O2 of oxyhemoglobine (oxyHb)] tot NO3-. Deze reactie gaat gepaard met de overgang van de heemgroep naar de ijzertoestand [Hb-Fe3+ of methemoglobine (metHb)]:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

De barrière van de rode bloedcel (RBC) en de ruimte direct grenzend aan het endotheel zijn de belangrijkste factoren die deze reactie beperken en waardoor een klein deel van het NO dat door het endotheel vrijkomt, kan fungeren als EDRF16,17. In feite is bekend dat celvrij Hb in de bloedsomloop de vaatverwijding in experimentele en klinische omgevingen verstoort17,18. Binnen de RBC reageert, afhankelijk van oxygenatie en NO 2-concentratie, een deel van NO met deoxyhemoglobine (Hb-Fe2+) om ijzer-nitrosyl Hb (Hb-Fe2+-NO of HbNO) te vormen:

Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO

In de RBC15,17 kan NO2- Hb-Fe3+ vormen door Hb-Fe2+ te verlagen wat leidt tot het vrijkomen van NO, wat op zijn beurt Hb-Fe2+-O 2 (bij voorkeur) of Hb-Fe2+ bindt.

De generatie van NO-derivaten moet niet strikt unidirectioneel worden beschouwd, aangezien NO kan worden geregenereerd uit NO2- en NO3- in verschillende weefsels en door verschillende enzymen (bijvoorbeeld door darmbacteriën of in mitochondriën, met name onder hypoxische omstandigheden)19,20.

Een variabele hoeveelheid geproduceerd (of toegediend) NO leidt tot de stroomafwaartse generatie van S-nitrosothiolen, voornamelijk door thioltransnitrosatie van N2O3 in aanwezigheid van een nucleofiel die een NO+ donortussenproduct creëert (Nuc-NO+-NO2-):

N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-

Een andere mogelijkheid voor het genereren van S-nitrosothiolen is nitrosylering van geoxideerde thiolen (NO reageren met een geoxideerd thiol):

RS• + NO → RS-NO

Dit mechanisme en de directe thioloxidatie met NO2 zouden alleen mogelijk kunnen zijn in zeer specifieke omstandigheden die elders worden beschreven21. S-nitrosothiolen variëren van lichte moleculen zoals S-nitrosoglutathione tot grote thiolbevattende eiwitten. S-nitrosohemoglobine (S-NO-Hb) wordt gevormd door nitrosatie van een thiolgroep van een geconserveerd cysteïneresidu in de β-keten (β93C)22.

De generatie en het metabolisme van S-nitrosothiolen maken deel uit van belangrijke regulerende mechanismen. Voorbeelden hiervan zijn regulatie van glutathion, caspasen, N-methyl-D-Aspartaat (NMDA) en ryanodinereceptoren 23,24,25,26,27,28. Eerder beschouwd als een belangrijke mediator van NO-biologie in vivo, lijkt nitrosated albumine (S-nitroso-albumine) een NO / NO + transporter te zijn zonder enige specifieke extra biologische activiteit29.

Bij het meten van de concentratie van NO en zijn derivaten van een specifiek biologisch monster binnen een biologische matrix, is het belangrijk om rekening te houden met kenmerken zoals zuurgraad, oxygenatie, temperatuur en de aanwezigheid van reagentia. Voorbeelden hiervan zijn toegediende exogene NO-donoren en, in de setting van acute ontsteking, waterstofperoxide (H2O2) dat reageert met NO2 , wat leidt tot het genereren van supernormale concentratie van vrije radicalen zoals peroxynitriet (ONOO-)21. Naast de analysemethode die wordt gebruikt, is de preanalytische fase van monstervoorbereiding en -opslag van fundamenteel belang. Stroomafwaartse reacties die niet de in vivo NO-activiteit vertegenwoordigen, moeten worden voorspeld, overwogen en geblokkeerd. Een geldig voorbeeld is de instabiliteit van S-NO-Hb, die een speciale behandeling van bloedmonsters vereist wanneer deze is gericht op meting22.

Chemiluminescentie-gebaseerde assays zijn de gouden standaard voor het detecteren van de niveaus van NO en zijn belangrijkste metabolieten [NO2-, NO3-, S-NO en ijzer-nitrosylcomplexen (Fe-NO)] in elke biologische vloeistof, inclusief weefselhomogenaten30,31. Deze methoden zijn gebaseerd op de chemiluminescentiedetector (CLD), een apparaat dat de reactie van NO met ozon (O3) herbergt en NO2 genereert in een aangeslagen toestand (NO2•). Relaxatie van NO2• veroorzaakt emissie van een foton van licht dat wordt gedetecteerd door een fotomultiplicatorbuis, waardoor een elektrisch signaal wordt gegenereerd dat recht evenredig is met het NO-gehalte van het bemonsterde gasmengsel32. Een vereenvoudigd schema van de CLD wordt weergegeven.

Figure 1
Figuur 1: Vereenvoudigd schema van een chemiluminescentiedetector voor stikstofmonoxidegas. Chemiluminescentie-gebaseerde detectie van stikstofmonoxide (NO) is de stoichiometrische generatie van één foton per NO-gasmolecuul die wordt geïntroduceerd in de chemiluminescentiedetector (CLD). De chemiluminescentiereactie wordt verkregen in een aangewezen kamer die wordt geleverd met ozon (O3) van een interne generator, die op negatieve druk wordt gehouden door verbinding met een externe pomp, waardoor een continue en constante instroom van monstergas mogelijk is. De generatie van O3 vereist diatomische zuurstof (O2) die wordt geleverd door een speciale O2-tank die is aangesloten op de CLD (andere fabrikanten leveren CLD's die werken met omgevingslucht). In de reactiekamer reageert elk molecuul NO-gas in het bemonsterde gas met zuurstof om één molecuul stikstofdioxide in de geactiveerde toestand (NO2*) op te leveren. Door terug te keren naar zijn grondtoestand zendt elk NO2*-molecuul één foton uit dat wordt gedetecteerd door een fotomultiplicatorbuis (PMT) die zich naast de reactiekamer bevindt. De PMT met de bijbehorende versterker en centrale verwerkingseenheid produceert een signaal dat evenredig is met het aantal fotonen en het aantal NO-moleculen in de reactiekamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De monsterinlaat van de CLD kan worden aangesloten op een glaswerksysteem met een reactiekamer voor vloeistofmonsters. Het systeem wordt continu gezuiverd met een inert gas zoals stikstof, helium of argon, waardoor NO van de reactiekamer naar de CLD wordt overgebracht. Vloeistoffasemonsters worden via een speciaal membraan in het spoelvat geïnjecteerd.

Figure 2
Figuur 2: Structuur van een zuiveringsvat voor op chemiluminescentie gebaseerde detectie van stikstofmonoxidegas Het spoelvat (rechts) maakt de detectie van stikstofmonoxide (NO) gas of een andere verbinding mogelijk die gemakkelijk kan worden omgezet in NO-gas wanneer deze vrijkomt uit een vloeibaar fasereagens. De inerte gasinlaat is verbonden met een bron (tank) van een inert gas zoals Argon, Xeon of diatomische stikstof (N2). De naaldklep (opent aan de linkerkant) wordt gebruikt voor drukregeling in het spoelvat en kan volledig worden verwijderd om het vat te reinigen. De injectiepoort wordt afgedekt door een dop met een membraantussenschot voor monsterinjectie. Het membraan moet vaak worden vervangen. Een verwarmde mantel omringt de reactiekamer en is aangesloten op een warmwaterbad om de VCl3 in HCl-assay uit te voeren. De afvoer van het spoelvat is aangesloten op de chemiluminescentiedetector (CLD) of op de NaOH-val (vereist voor VCl3 in HCl-assays). Om de inhoud van de reactiekamer af te tappen, sluit u eerst de stopkranen bij de inerte gasinlaat en de afvoer van het spoelvat, sluit u de naaldklep, verwijdert u de dop bij de injectiepoort en opent u ten slotte de stopkraan bij de afvoer. De NaOH-val (links) moet in lijn tussen het spoelvat en de CLD worden geplaatst als de VCl3 in HCl-test wordt uitgevoerd vanwege de corrosie van HCl. De verbinding met de CLD vereist altijd dat een intens veld diëlektrisch (IFD) filter wordt geplaatst tussen de CLD en de uitgang van het spoelvat (of de NaOH-val, indien gebruikt). Het IFD-filter verwijdert deeltjes in de lucht en voorkomt dat vloeistof door het spoelvat gaat. PTFE = polytetrafluorethyleen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Als gevolg hiervan kan elke verbinding die door een specifieke en gecontroleerde chemische reactie in NO kan worden omgezet, met hoge gevoeligheid worden gedetecteerd in elke biologische vloeistof en weefselhomogenaat24. Directe meting van gasfase NO door chemiluminescentie wordt uitgevoerd in zowel experimentele als klinische omgevingen. Deze technieken worden elders uitgebreid beschreven 33,34,35. Meting van NO2-, S-nitrosothiolen, S-nitrosated eiwitten en Fe-NOs kan worden uitgevoerd door monsters toe te voegen in een reactiemengsel met triiodide (I3-), dat stoichiometrisch GEEN gas vrijgeeft uit al deze verbindingen:

I3- → I2 + I-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

terwijl ik3- niet reageert met NO 3-15. Nauwkeurige metingen van elke verbinding worden mogelijk gemaakt door voorbehandeling van monsters met aangezuurd sulfanilamide (AS) met of zonder kwikchloride (HgCl2). In het bijzonder verwijdert de voorbehandeling met AS alle NO 2-inhoud. Als gevolg hiervan weerspiegelt het NO-gehalte gemeten door de CLD alleen de som van de concentratie van S-NOs en Fe-NOs. Injectie van HgCl2 in een monster aliquot vóór AS-injectie zorgt ervoor dat NO2- wordt vrijgegeven door S-NO. Behandeling met AS (leidend tot NO 2-verwijdering) zorgt ervoor dat het gemeten NO-gehalte alleen de concentratie van Fe-NOs weerspiegelt. Een reeks aftrekkingen tussen de beoordelingen maakt het mogelijk om de precieze concentratie van de drie NO-derivaten te berekenen22.

Figure 3
Figuur 3: Stappen in monstervoorbereiding voor de I3- in azijnzuur chemiluminescentietest. De opeenvolgende stappen voor de bereiding van de I3- in azijnzuur chemiluminescentietest worden geïllustreerd. Het gebruik van lichtbeveiligde centrifugebuizen is vereist. De buizen 1, 2 en 3 worden gebruikt om de test voor te bereiden. Een ander monster aliquot (buis 4) is nodig voor de VCl3 in HCl-test als de meting van nitraat (NO3-) vereist is. Stappen worden aangegeven met cijfers in het rood. Voorvullen (stap 1) zoals aangegeven met fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) of HgCl2 voordat het monstervolume wordt toegevoegd. Voeg het monstervolume (2) toe zoals aangegeven, vortex, en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT). Voeg (3) PBS of aangezuurd sulfanilamide (AS) toe zoals aangegeven, vortex en incubeer gedurende 3 minuten bij RT. Voer de test uit (4). De concentratie gemeten met de test is de som van de concentratie van de verbindingen die onder elke buis worden gerapporteerd. Buis nummer 1 maakt metingen van nitriet (NO2-), S-nitrosothiolen (S-NO) en ijzer-nitrosylcomplexen (Fe-NOs) als één signaal mogelijk. Voor nitraatmetingen (NO3-) moeten monsters worden uitgevoerd met zowel I3- in azijnzuur als VCl3 in HCl-assays, en de waarde verkregen uit buis 1 moet worden afgetrokken van die verkregen uit buis 4. *voorgestelde hoeveelheden die moeten worden gebruikt voor Hb-analyse voor de bepaling van restnummer2-, S-nitrosohemoglobine en ijzer-nitrosyl-hemoglobine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voor NO 3-meting wordt Vanadium (III) chloride (VCl3) in zoutzuur (HCl) gebruikt voor de omzetting van NO3- in NO in het spoelvat om NO3- stoichiometrisch te meten met de CLD:

2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+

Om een voldoende snelle omzetting te bereiken, moet de reactie worden uitgevoerd bij 90-95 °C. Reductie van NO3- naar NO2- gaat gepaard met reductie van NO2- naar NO door HCl. Vanadiummetaal vermindert ook S-NOs waardoor hun NO-deelwordt bevrijd 22,36. De eindconcentratie verkregen door CLD met VCl3 in HCl weerspiegelt de totale concentratie van NO3-, NO2 en andere nitrosaatverbindingen. Aftrekking van deze laatste waarde van de met CLD met I3- opgewekte concentratie maakt het mogelijk om NO3- concentratie36,37 te berekenen (figuur 3).

In de NO-consumptietest genereert de continue afgifte van NO in het spoelvat door NO-donoren zoals (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolaat (DETA-NONOaat) een stabiel signaal waardoor celvrije oxyHb in de geïnjecteerde monsters kan worden gekwantificeerd. De hoeveelheid NO die in het zuiveringsvat wordt verbruikt, staat in een stoichiometrische relatie met de hoeveelheid oxyHb in het monster38.

Protocollen voor het meten van NO2-, NO3-, S-nitrosothiolen, ijzer-nitrosylcomplexen en NO-consumptie door celvrij Hb in plasmamonsters worden geïllustreerd. Studies naar NO in de RBC-omgeving vereisen een specifieke monsterbehandeling gevolgd door exclusiechromatografie om extreem fragiele S-NO-Hb en Hb-NO te meten in combinatie met de bepaling van de totale Hb-concentratie15,22. Monstervoorbereiding is instrumenteel bij het corrigeren van metingen. Het pre-bestaan van NO2- in H2O en het vrijkomen van NO2- tijdens de test kan leiden tot meting van kunstmatig hogere concentraties NO-derivaten zoals S-NO-Hb14,39. Belangrijke aspecten van monstervoorbereiding worden ook gepresenteerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De procedures die in dit protocol worden aangegeven, zijn in overeenstemming met de beoordelingsraad van het Massachusetts General Hospital. De bloedmonsters die werden gebruikt, waren verzameld tijdens een eerdere studie en werden gedeïdentificeerd voor het huidige doel18.

OPMERKING: Zie de instructies van de fabrikant voor specifieke richtlijnen met betrekking tot optimale verbindingen tussen buizen en glaswerk die het spoelvat vormen, wassen en algemeen onderhoud. Verbindingen moeten stevig en zorgvuldig worden gemaakt om het glaswerk niet te beschadigen. Identificeer de componenten van het glazen spoelvat: gasinlaatleiding, spoelvat met verwarmingsmantel en condensor, natriumhydroxide (NaOH) gasbelvanger, verbindingslijn tussen het spoelvat en de bubbler, purgevat uitlaatgasleiding (naar CLD) begiftigd met een intens veld diëlektrisch (IFD) filter. Een IFD-filterlijn tussen het spoelvat en de monsterinlaat van de CLD moet aanwezig zijn telkens wanneer GEEN metabolieten in vloeibare vorm (plasma, celculturen, weefselhomogenaten) worden gemeten (alle in het protocol gepresenteerde testen). Monstervoorbereiding hangt af van de vloeistof of het weefsel dat wordt geanalyseerd en van de verbindingen van belang. Belangrijke aspecten van de preanalytische fase worden behandeld in hoofdstuk 1 en 2. Specifieke voorbereidingsstappen voor specifieke testen zijn opgenomen in rubrieken 3-5. Secties 6-8 zijn van toepassing op alle testen.

1. Voorbereiding van specifieke reagentia

OPMERKING: Voor meer details, zie eerdere publicaties15,22.

  1. Bereid 5% (290 mM) aangezuurde sulfanilamide (AS) oplossing voor NO 2-verwijdering door 500 mg sulfanilamide op te lossen in 10 ml 1N HCl. Deze oplossing is maandenlang stabiel.
  2. Bereid 50 mM kwikchloride (HgCl2) oplossing voor NO 2-afgifte van S-NOs door 67,9 mg HgCl2 op te lossen in 5 ml PBS. Bescherm de stockoplossing tegen licht.
  3. Bereid NO2- blokkerende oplossing met 800 mM ferricyanide [K3Fe(CN)6] om Hb te oxideren samen met 100 mM N-ethylmaleimide (NEM) om thiolgroepen te blokkeren en (OPTIONEEL) 10% nonylfenyl-polyethyleenglycoloplossing (Nonidet p-40) om de membranen van de rode cel op te lossen.
    1. Voeg K3Fe(CN)6 toe aan gedeïoniseerd en gedestilleerd water (ddH2O, 263,5 g poeder per liter) om een eindconcentratie van 800 mM te verkrijgen.
    2. Voeg NEM toe aan de 800 mM K3Fe(CN)6 in ddH2O-oplossing (12,5 g poeder per liter om een concentratie van 100 mM te hebben) en meng de oplossing om alle kristallen op te lossen.
    3. Voeg een deel van 10% NP-40 toe aan negen delen van de 800 mM NEM K3Fe(CN)6 100 mM NEM-oplossing (111 ml per liter) en meng goed (verplichte stap voor volbloedanalyse).
  4. Bereid de S-NO-Hb stabilisatieoplossing met 12 mM K3Fe(CN)6, 10 mM NEM, 100 μM diethyleentriaminepenta-azijnzuur (DTPA, voor metaalchelatie) en 1% Nonidet p-40 wasmiddel uit hun stamoplossingen.
    1. Bereid een NEM-oplossing van 200 mM door NEM-kristallen toe te voegen aan PBS (25 mg /ml, bijvoorbeeld 250 mg in 10 ml PBS) en meng de oplossing totdat alle kristallen zijn opgelost (te maken op de dag van het experiment).
    2. Bereid een 800 mM K3Fe(CN)6-oplossing door K3Fe(CN)6 toe te voegen aan ddH2O (263,5 mg/ml, bijvoorbeeld 1,32 g in 5 ml ddH2O om een eindconcentratie van 800 mM te verkrijgen) (te maken op de dag van het experiment).
    3. Bereid een 10 mM DTPA-stamoplossing door 786 mg DTPA toe te voegen aan 200 ml ddH2O en stel de pH in op 7,0 met 5N NaOH om DTPA volledig op te lossen.
    4. Voeg 5 ml 200 mM NEM-oplossing, 1,5 ml 800 mM K3Fe(CN)6-oplossing en 1 ml DTPA-stamoplossing toe aan 81,5 ml PBS bij 7,2 pH en voeg ten slotte ten slotte 11 ml 10% NP-40 toe om het uiteindelijke volume op 100 ml te brengen.

2. Monsterverzameling

OPMERKING: Voor meer informatie over het verzamelen van monsters, zie eerder gepubliceerde werken 15,22,40.

  1. Volbloed verzamelen
    1. Verzamel bloed in met heparine beklede buizen en geef de voorkeur aan veneuze boven arteriële bloedvaten (tenzij specifiek vereist) en geef de voorkeur aan katheterplaatsing boven venapunctuur (indien mogelijk) met katheter of naaldboring van ten minste 20 G of groter om hemolyse te minimaliseren.
    2. Voeg onmiddellijk de NO 2-blokkerende oplossing (1 deel van de oplossing aan 4 delen volbloed) toe, proces (rubrieken 3 of 4) of vries in en bewaar bij -80 °C.
  2. Verzamel plasma en rode bloedcellen (RBC's)
    1. Verzamel bloed in met heparine beklede buizen die de voorkeur geven aan veneus boven arterieel bloed (tenzij specifiek vereist) en naalden van ten minste 20 G of meer om hemolyse te minimaliseren en centrifugeer onmiddellijk gedurende 5 minuten bij 4000 x g bij 4 °C.
    2. Meng het supernatant (plasma) met de NO 2-blokkerende oplossing (1 deel van de oplossing op 4 delen van het supernatant) in een nieuwe buis en proces (secties 3 of 4), of vries in en bewaar bij -80 °C.
      OPMERKING: Voor de NO-verbruikstest kan de NO 2-blokkerende oplossing niet worden gebruikt. De test kan worden uitgevoerd zonder plasmavoorbehandeling.
    3. Resuspend de RBC-pellet van de bodem naar een nieuwe buis voorgevuld met S-NO stabilisatieoplossing (zie stap 1.4) (1 ml pellet tot 9 ml oplossing) en incubeer gedurende 5 minuten.
    4. Passeer het RBC-lysaat in een maatkolom met G-25 Sephadex-polymeer dat eerder is gespoeld met ddH2O voor uitsluitingschromatografie
    5. Verzamel de Hb-fractie om te verwerken (rubriek 4) en om de Hb-concentratie te meten met behulp van drabkin's reagens (voor Hb-meting, zie eerder gepubliceerd werk22).
      OPMERKING: Om een specifiek weefsel / orgaan voor te bereiden en te bemonsteren, identificeert u het hilum en isoleert u het chirurgisch. Snijd in de ader, doorprik de slagader en injecteer met gehepariniseerde zoutoplossing (10 E / ml) via de slagader. Verwijder het weefsel wanneer zoutoplossing begint terug te stromen bij de veneuze incisie. Homogeniseer het weefsel met een mechanische homogenisator en voeg 1 deel NO 2-blokkerende oplossing toe aan 4 delen gehomogeniseerd weefsel.

3. VCl3 in HCl-testpreparaat

OPMERKING: Voor meer details over VCl3 in HCl-assayvoorbereiding, zie eerder gepubliceerde werken37,41.

LET OP: De CLD zal beschadigd raken als de NaOH-val niet goed op zijn plaats zit bij het uitvoeren van deze test. Dit komt door de corrosie van HCl.

  1. Bereid standaardoplossingen van NO3- voor standaardcurve voor
    1. Los 85 mg NaNO3 op in 10 ml ddH2O om 0,1 M NaNO3- te verkrijgen (deze oplossing blijft enkele weken stabiel).
    2. Gebruik de stamoplossing om normen te bereiden door verdunning in ddH2O om concentraties van 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO3 te verkrijgen om een kalibratiecurve uit te voeren voor plasma- of urinemonsters (gebruik lagere concentraties bij het werken met celculturen).
  2. Bereid VCl3 (vanadiumchloride) verzadigde oplossing voor NO3- reductie in het spoelvat
    LET OP: De reactie van water en VCl3 is exotherm. Let op een hoge glaswerktemperatuur bij het toevoegen van zuur en bij het spoelen van het glaswerk aan het einde van het experiment.
    1. Los 1,6 g VCl3 op in 200 ml van 1 M HCl door eerst VCl3 toe te voegen in een schone kolf en vervolgens 200 ml van 1 M HCl toe te voegen.
    2. Filter de oplossing vacuüm door filterpapier (zoals 11 μm filtreerpapier, maar elk filtreerpapier kan worden gebruikt).
      OPMERKING: De gefilterde oplossing moet helderblauw worden, terwijl de ongefilterde VCl3-oplossing bruin is vanwege onopgeloste deeltjes.
    3. Houd de verzadigde oplossing bedekt met aluminiumfolie of polytetrafluorethyleen (PTFE) tape omdat de verbinding lichtgevoelig is.
  3. Bereid het circulerende waterbad voor
    1. Sluit een circulerend waterbadapparaat aan op de watermantel van het spoelvat. Zorg ervoor dat de lijnen droog zijn voordat je gaat primen.
    2. Start het waterbad bij 95 °C en controleer of er geen lekken op de waterleidingen zijn door (niet-gevaarlijke) papieren handdoeken rond de lijnen aan te brengen.
  4. De gasbellerval instellen
    1. Controleer of de PTFE-huls van de bubbler op zijn plaats zit en of deze niet beschadigd is.
    2. Open de gasbeller en injecteer 15 ml van 1 M NaOH in de bubblerbasis.
    3. Verplaats de gasbeller en sluit de verbinding goed af door de onderkant naar boven te drukken en de twee delen lichtjes te draaien. De onmogelijkheid om de bovenkant van de bubbler te draaien zonder kracht uit te oefenen, duidt op een juiste afdichting.
    4. Sluit de uitlaat van het spoelvat aan op de inlaat van de gasborrelvanger.

4. I3- in azijnzuurtestpreparaat

OPMERKING: Voor meer details over I3- in azijnzuurtestpreparaat, zie eerder gepubliceerde werken 15,22,38,41,42.

  1. Standaardcurve voorbereiden voor NO2-
    1. Bereid een stamoplossing door 69 mg natriumnitriet (NaNO2) op te lossen in 10 ml ddH2O om een oplossing van 100 mM te verkrijgen. Deze oplossing is stabiel als deze wordt bewaard in een luchtdichte container, gekoeld en beschermd tegen licht.
    2. Verdun de stamoplossing serieel in een microcentrifugebuis van 1,5 ml, voorgevuld met 900 μL ddH2O: voeg 100 μL van de stamoplossing toe aan de eerste centrifugebuis, meng, etiketteer en gebruik 100 μL van de buis voor de tweede buis, herhaal dit, wat resulteert in 10 mM, 1 mM en vervolgens 100 μM.
    3. Verder verdunnen met ddH2O om 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM en 500 nM NaNO 2-aliquots te verkrijgen voor gebruik in de kalibratiecurve.
  2. Bereid het I3- in azijnzuur voor op het spoelvat (kan gedurende 1 week bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard)22
    1. Voeg 2 g kaliumjodide (KI) en 1,3 g jodium (I2) toe aan 40 ml ddH2O en 140 ml azijnzuur.
    2. Meng grondig door het mengsel minstens 30 minuten te roeren.
  3. Bereid de monsters voor voor differentiële bepaling van NO2-, S-nitrosothiolen (S-NO-Hb, als Hb wordt verzameld) en ijzer-nitrosylcomplexen (Hb-NO als Hb wordt verzameld) (figuur 3)
    1. Verdeel elk monster in 3 aliquots van 270 μL (900 μL Hb bij meting van S-NO-Hb en Hb-NO) in lichtbeveiligde microcentrifugebuizen, waarvan 2 vooraf gevuld met 30 μL 1x PBS (100 μL bij meting van S-NO-Hb en Hb-NO) en de derde buis met 30 μL HgCl2 (100 μL bij meting van S-NO-Hb en Hb-NO), vortex en incubateer bij RT gedurende 2 min (figuur 3).
    2. Voeg 30 μL van 5% AS toe aan het monster met HgCl2 om Fe-NOs te meten (100 μL voor Hb-NO) en aan een met toegevoegde PBS om S-NOs en Fe-NOs te meten (100 μL voor S-NO-Hb en Hb-NO) en voeg 30 μL PBS toe aan de derde die al vooraf gevuld is met 1x PBS om NO2-, S-NOs en Fe-NOs te meten (100 μL voor residuele NO2- uit Hb-verzameling, S-NO en Hb-NO). Vortex en incubeer bij RT gedurende 3 min (figuur 3).

5. GEEN verbruik door celvrije Hb-opstelling

OPMERKING: Raadpleeg voor meer details het eerder gepubliceerde werk38.

  1. Bereid standaard oxyHb-oplossingen uit een gezuiverde hb-oplossing met een bekende concentratie
    1. Verdun de stamoplossing serieel in microcentrifugebuizen van 1,5 ml door toevoeging van ddH2O om de oplossingen te verkrijgen die voor de kalibratiecurve zullen worden gebruikt: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
  2. Bereid de DETA-NONOate oplossing
    1. Voeg 10 mg DETA-NONOaat toe aan 610 μL 10 μM NaOH in pH 7,4 PBS om 100 mM DETA-NONOaat te genereren en houd het op ijs.

6. Start de chemiluminescentiedetector (CLD) en bereid het spoelvat voor

OPMERKING: Voor de voorbereiding van het zuiveringsvat, zie het eerder gepubliceerde werk43.

  1. Controleer de hoofdverbindingen van en naar de CLD
    1. Sluit de zuurstofleiding aan op de CLD en open de zuurstoftank met een druk die in overeenstemming is met de fabrikant van de CLD.
    2. Zorg ervoor dat de Intense Field Dielectric (IFD) filterleiding is aangesloten op de CLD, maar niet op het spoelvat of de NaOH-val
  2. Start de CLD
    1. Begin op de CLD-interface met het uitvoeren van het detectieprogramma voor vloeistoffasetests.
    2. Controleer of de zuurstoftoevoer voldoende is. Als dit het geval is, zal de CLD met succes beginnen met het nemen van monsters vanaf de inlaat en detectie aangeven door een signaal in millivolts (0-5 mV). Anders zal de CLD een negatief diagnostisch signaal geven.
  3. Bereid het zuiveringsvat voor
    1. Sluit het spoelvat op alle drie de poorten: schroef de naaldklep volledig naar rechts, sluit de inlaat- en uitlaatstopkranen.
    2. Verwijder de dop van het spoelvat en voeg een voldoende hoeveelheid van het reagens dat specifiek is voor de geplande test toe aan de reactiekamer (tabel 1) zodat de naald van de spuit die wordt gebruikt om de monsters te injecteren, de vloeistofkolom kan bereiken.
    3. Controleer de aanwezigheid van een stabiele gewenste uitgangswaarde (tabel 1).
  4. Start de spoelgasstroom
    1. Zorg ervoor dat de inerte gastank (bijv. N2) is uitgerust met een tweetrapsregelaar en sluit de inerte gastank aan op de gasinlaat van het vat.
    2. Open het gas met een uitlaatdruk op de regelaar van 1-5 psi, open de inlaat van het spoelvat en open langzaam de naaldklep van het spoelvat om de instroom van gas mogelijk te maken. Controleer of het borrelt in het zuiveringsvat.
  5. Pas de gasstroom aan
    1. Registreer de celdruk gemeten door de CLD met de IFD-filterleiding die omgevingslucht bemonstert.
    2. Plaats de dop op het spoelvat, sluit de IFD-filterleiding aan op het spoelvat (of op de NaOH-val in de VCl3 in HCl-test) en open de uitlaat van het spoelvat.
    3. Gebruik de naaldklep om dezelfde celdruk te bereiken op CLD-niveau dat wordt geregistreerd in de omgevingslucht.

7. Experimenteer

OPMERKING: Voor meer details over het experiment, zie het eerder gepubliceerde werk43.

  1. Start het chemiluminescentiesignaalacquisitieprogramma
    1. Sluit de seriële poort van de CLD aan op de seriële poort van de computer waarop het acquisitieprogramma is geïnstalleerd.
    2. Voer het analyseprogramma uit.
    3. Klik op Verwerven, selecteer de map om het .data-bestand op te slaan, typ de bestandsnaam en klik op Opslaan.
      OPMERKING: Let op de vooraf ingestelde uitvoeringstijd op het scherm, omdat de opname automatisch stopt wanneer de vooraf ingestelde tijd is verstreken. Indien nodig kan de vooraf ingestelde looptijd worden verlengd.
  2. Bereid u voor op herhaalde monsterinjecties
    1. Pas de spanningsschaal op het scherm aan om controle te hebben over de beoogde basislijn door op de knoppen Minimum en/of Maximum te klikken en vervolgens de gewenste waarde in te voeren.
    2. Neem een buis van 20 of 50 ml gevuld met ddH2O om de spuit tussen de monsters door te spoelen.
    3. Zorg dat er een doos met delicate taakdoekjes bij de hand is.
  3. Monster injectie
    OPMERKING: Begin met de standaardoplossingen voor de kalibratiecurve (injecteer van de minst geconcentreerde naar de meest geconcentreerde monsters) en ga vervolgens verder met de experimentmonsters (overweeg dit in duplicaten of drielicaten te doen).
    1. Spoel de spuit ten minste tweemaal of meer met ddH2O voordat u elk monster optrekt (en na elke injectie) en controleer elke keer dat onbelemmerd water wordt uitgeworpen op een taakdoekje.
    2. Plaats de spuit in de monsterbuis terwijl u zowel de spuit als de buis op korte afstand houdt, trek de zuiger op tot het gewenste volume terwijl u ervoor zorgt dat er geen luchtbel en/of niet-gehomogeniseerde vaste delen worden opgesloten.
    3. Reinig de punt van de spuit met een taakwisser, steek de spuit vervolgens in de septa-dop bij de injectiepoort en injecteer nadat u hebt gecontroleerd of de punt van de spuit zich in de vloeistoffase in de reactiekamer bevindt.
  4. Markeer de injectie in het softwareprogramma en wacht
    1. Controleer of de injectie een opwaartse verandering in het signaal veroorzaakt (aanvullende figuur 1) (naar beneden in de NO-consumptie door celvrije Hb-test) en typ de monsternaam door op het grijze vak onder Monsternamen te klikken en klik vervolgens op Injectie markeren.
      OPMERKING: Vermoed obstructie van de spuit als het monsterinjectie geen signaal genereert.
    2. Wacht tot het elektrische signaal de basislijn weer bereikt (dit duurt meestal 3-4 minuten). Deze tijd kan worden gebruikt om stap 7.3.1 uit te voeren.
  5. Herhaal alle stappen die zijn aangegeven in stap 7.3 en 7.4 tijdens en na elke injectie tot het einde van het experiment. Vergeet niet om een voorbeeld van de conserveringsoplossing uit te voeren (indien gebruikt)
  6. Het experiment stoppen
    1. Klik op STOP om de signaalacquisitie te onderbreken, stop de CLD en schakel het waterbad uit (als NO3- wordt gemeten).
    2. Onderbreek de gasstroom, open de naaldklep, verwijder de dop van het spoelvat, plaats een afvalcontainer onder de afvoer en open de afvoerstopkraan.
      OPMERKING: Als het experiment langer dan 60 minuten gegevensverzameling vereist, moet u de acquisitie na 60 minuten runtime opnieuw starten (herhaal stap 7.1.3) en een nieuw bestand maken.

8. Metingen en berekeningen

OPMERKING: Metingen en berekeningen worden offline uitgevoerd en kunnen op een ander moment worden uitgevoerd.

  1. Start het chemiluminescentie-acquisitieprogramma voor offline data-analyse
    1. Start het programma en klik op Verwerken.
    2. Selecteer het experimentbestand en klik vervolgens op Openen.
  2. Bereken het gebied onder de curve voor elke toediening
    1. De software brengt automatisch de basislijn (aanvullende figuur 2A, horizontale gele lijn) en de piekas van elke golf die door elke monsteradministratie wordt gegenereerd (verticale gele lijnen) op het scherm in kaart: controleer hun juiste positie (of pas deze aan door op elke lijn te klikken en deze met de muis of de pijlen te verplaatsen) en klik op Threshold OK (Supplemental Figure 2B).
      OPMERKING: In de NO consumption by cell-free Hb measurement assay slaagt de software er doorgaans niet in om de golfvorm die door monsterinjectie wordt gegenereerd, correct vast te leggen. Door in te zoomen op elke golfvorm kan de operator de software eenvoudig helpen bij de gebiedsberekening (aanvullende figuur 2).
    2. De software brengt automatisch het begin (verticale groene lijn) en het einde (verticale rode lijn) van elke piek veroorzaakt door elke monsteradministratie in kaart: controleer hun juiste positie (of pas aan door op elke lijn te klikken en deze met de muis of de pijlen te verplaatsen) en klik op Integreren (aanvullende figuur 2C).
      OPMERKING: Sommige gebieden in het spoor kunnen op dit punt ten onrechte worden gedefinieerd als injecties en sommige pieken kunnen automatisch twee keer worden geteld. Beide fouten kunnen opnieuw worden geïdentificeerd en verwijderd tijdens stap 8.2.2
    3. De software matcht automatisch elk signaalgebied na een injectie die tijdens het experiment is gemarkeerd en de toegewezen naam: navigeer door elke piek (aangegeven door een gele verticale lijn) met de toegewezen naam door op Next Peak en Previous Peak te klikken en klik vervolgens op de knop All OK om uiteindelijk de berekening voor alle gebieden op het scherm te verkrijgen.
    4. Om alle naamgevings- of matchingfouten van de gebruiker of het programma te corrigeren, gebruikt u indien nodig de knoppen die worden aangegeven in Aanvullend bestand 1.
  3. Breng de waarden van de kalibratiecurve over naar een spreadsheet en genereer een lineaire regressievergelijking (aanvullende figuur 3)
    1. Breng de gegevens van het CLD-programma over naar een nieuwe spreadsheet via copy-paste. Rangschik de twee kolommen in het gegevensblad als Monsterconcentratie en Gebied onder de curve en voeg een overeenkomende waarde van nul toe aan beide kolommen.
    2. Selecteer de twee kolommen, klik op Invoegen > spreiding en selecteer vervolgens onder het menu Grafiekontwerp de optie Grafiekelement toevoegen > Trendlijn > Lineair.
    3. Klik met de rechtermuisknop op de gegenereerde trendlijn, klik op Trendlijn opmaken en klik vervolgens op de opties Vergelijkingen weergeven in Grafiek en R-kwadraatwaarde weergeven in Grafiek in het menu Trendlijn opmaken om een eenvoudige lineaire kalibratievergelijking te verkrijgen.
  4. Breng het berekende gebied van elk monster over om de concentratie te berekenen (aanvullende figuur 3)
    1. Rapporteer elke waarde in de spreadsheet. Pas in de volgende kolom de vergelijking uit stap 8.3.3 toe om de concentratie van elk geïnjecteerd monster te verkrijgen, waarbij y de concentratie is (waarde van de nieuwe kolom) en x het gebied onder de curve is dat na injectie is gemeten.
      OPMERKING: Vergeet niet om rekening te houden met de concentratie gemeten in de conserveringsoplossing (indien gebruikt) en trek de waarden dienovereenkomstig af.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De NO-consumptie door celvrije Hb-test werd gebruikt in monsters met bekende concentraties celvrij oxyHb (figuur 4). Omdat één heem oxyHb stoichiometrisch één NO-molecuul vrijgeeft in de test, wordt gezuiverde celvrije oxyHb gebruikt om de kalibratiecurve voor de test te bouwen (aanvullende figuur 3).

De dosis-responsrelatie tussen celvrij Hb (gemeten met een colorimetrische assay) en NO-consumptie bij patiënten die tijdens hartchirurgie van cardiopulmonale bypass (CPB) afkwamen, is weergegeven in figuur 5. Aangenomen kan worden dat er na CPB een hogere concentratie heemgroepen is in de Hb-Fe2+-O2 status (figuur 5, rood) in vergelijking met patiënten die NO krijgen tijdens CPB waarvan slechts een minderheid van de heemgroepen celvrij Hb NO consumeert (Figuur 5, groen).

Het protocol voor het beoordelen van NO-consumptie door celvrij Hb werd eerder toegepast op het testen van plasmamonsters van 50 patiënten die een hartoperatie ondergaan en CPB nodig hebben. Bloed werd verzameld bij baseline en 15 min, 4 uur en 12 uur na CPB. Het doel van het onderzoek was om de bestaande relatie tussen zowel pulmonale als systemische vasculaire resistentie en de toename van hemolyse waargenomen na het CPB te onderzoeken. De celvrije Hb-concentratie werd beoordeeld met een Hb-colorimetrische test. Hemolyse piekte 15 minuten na CPB. Het geaccumuleerde vrije Hb werd langzaam uit plasma geëlimineerd binnen 12 h18 (figuur 6A). IN PLAATS DAARVAN piekte NO consumption na 15 minuten en bereikte de uitgangswaarden in slechts 4 uur (figuur 6B). Lineaire regressiecurven van NO-consumptie door celvrij Hb vertoonden een stoichiometrische relatie op het 15 min post-CPB tijdspunt in tegenstelling tot baseline, 4 h en 12 h post-CPB (figuur 6C). De verklaring voor het waargenomen verschil in kinetiek ligt in de overvloed aan nieuw vrijgegeven vrij Hb dat nog geen moleculen heeft aangetroffen die worden vrijgegeven door het endotheel van de patiënt. De concentratie van oxyHb (poep no opruimen en resulteren in consumptie in de test) was in feite hoger op 15 minuten dan op enig ander tijdstip. Plasma verzameld bij baseline en op andere tijdpunten had een relatief hogere component van metHb, die al door NO was geoxideerd, geen NO bindde en geen consumptie in de test veroorzaakte. Pulmonale en systemische vasculaire weerstanden werden invasief gemeten en piekten na 15 minuten. Voor het eerst in deze specifieke patiëntenpopulatie werd no-consumptie door vrij Hb waargenomen als tijdelijk gekoppeld aan vasoconstrictie, wat eerdere observaties in diermodellen en bij patiënten met sikkelcelziekte bevestigde18.

De toediening van NO gas tijdens CPB en na de operatie verhoogt de relatieve hoeveelheid circulerend metHb vs. oxyHb. Wanneer patiënten die een hartoperatie ondergingen intraoperatief en postoperatief met NO-gas werden behandeld, ging de waargenomen toename van vrij Hb na CPB (figuur 7A) niet gepaard met een toename van het NO-verbruik, zoals gemeten met het bovengenoemde protocol (figuur 7B). Het exogene toegediende NO-gas zet de meeste oxyHb om in metHb, dat op zijn beurt geen NO in vivo opruimt of NO in vitro verbruikt (ongepubliceerde gegevens).

Figure 4
Figuur 4: Stikstofmonoxideverbruik door gezuiverd celvrij oxyhemoglobine. Stikstofmonoxide consumptietest uitgevoerd door het injecteren van monsters van bekende concentraties van gezuiverd celvrij oxyhemoglobine. De regressielijn wordt in het rood weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5. Stikstofmonoxideconsumptie en celvrije hemoglobineconcentratie van patiënten die een hartoperatie ondergaan met cardiopulmonale bypass. Het celvrije hemoglobinegehalte van elke patiënt, zoals gemeten met een colorimetrische kit, werd uitgezet met de stikstofmonoxide (NO) consumptie gemeten door chemiluminescentie. Bloedmonsters werden 15 minuten na het einde van het CPB afgenomen. Regressielijnen worden getoond voor patiënten met hartchirurgie die geen (in rood) of (in groen) NO krijgen tijdens cardiopulmonale bypass (CPB). Hemoglobine wordt uitgedrukt in μM van heemgroepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Stikstofmonoxideconsumptie en celvrij hemoglobine bij patiënten met hartchirurgie. (A) De celvrije hemoglobine (Hb) concentratie in het plasma van patiënten die een hartoperatie ondergaan met cardiopulmonale bypass (CPB) (N = 50) werd op verschillende tijdstippen bepaald met behulp van een in de handel verkrijgbare colorimetrische bepalingskit. Gegevens werden geanalyseerd door een gemengd model te passen met bewijs van een vast effect tussen tijdspunten. De plasmaconcentratie op verschillende tijdstippen werd vergeleken met de uitgangswaarde met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. (B) Stikstofmonoxide (NO) consumptie door plasma verkregen uit dezelfde monsters die worden gebruikt voor de kwantificering van vrij Hb. De gegevens werden geanalyseerd door een gemengd model te monteren met bewijs van een vast effect tussen tijdspunten. De plasmaconcentratie op verschillende tijdstippen werd vergeleken met de uitgangswaarde met dunnett's meervoudige vergelijkingstest. (C) Regressielijnen voor celvrij Hb-plasmagehalte gematcht met NO consumptie. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns niet significant. De gegevens worden gepresenteerd als mediaan ± interkwartielbereik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Effecten van stikstofmonoxidegastoediening op stikstofmonoxideconsumptie bij patiënten die hartchirurgie ondergaan. (A) Celvrije hemoglobineconcentratie in het plasma van patiënten die een hartoperatie ondergaan met cardiopulmonale bypass (CPB) die gedurende 24 uur sinds het begin van het CPB een placebo (N = 28) of stikstofmonoxide (NO) gas (N = 22) krijgen. De concentratie werd op verschillende tijdstippen bepaald met behulp van een in de handel verkrijgbare colorimetrische kit. Gegevens werden geanalyseerd door de test van Friedman, wat wijst op de aanwezigheid van een effect tussen tijdpunten in beide groepen. De plasmaconcentratie op verschillende tijdstippen werd vergeleken met de uitgangswaarde met de meervoudige vergelijkingstest van Dunn. (B) GEEN consumptie door plasma verkregen uit dezelfde monsters die worden gebruikt voor de kwantificering van celvrije Hb. Gegevens werden geanalyseerd door Friedman's test, wat wijst op de aanwezigheid van een effect tussen tijdspunten in beide groepen. De plasmaconcentratie op verschillende tijdstippen werd vergeleken met de uitgangswaarde met de meervoudige vergelijkingstest van Dunn. ** p < 0,01, *** p < 0,001. De gegevens worden gepresenteerd als mediaan ± interkwartielbereik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Test Reagens mengsel Streefbasislijn (mV)
VCl3 in HCl 5 ml VCl3 in HCl verzadigde oplossing + 100 μL antischuimmiddel 0-5 mV*
I3– in azijnzuur 5-7 ml I3- reagens 0-5 mV*
GEEN consumptie door celvrij hemoglobine 5-7 ml PBS bij pH 7,4 + 100 μl antischuimmiddel + 20 μl geëxpandeerde DETA-NONOate-oplossing 70–100 mV**
*ideale waarde: basislijn kan hoger zijn vanwege de kwaliteit van de lucht in de experimenteeromgeving
**zorg voor stabiliteit gedurende 20 minuten voordat u met het experiment begint.

Tabel 1: Samenstelling van purgevatreagens en streefbasislijn voor verschillende chemiluminescentietests. Purge vat reagens samenstelling voor elke beschreven test. NO = stikstofmonoxide; PBS = fosfaatbufferzoutoplossing; DETA-NONOaat: (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolaat. *ideale waarde: de uitgangswaarde kan hoger zijn vanwege de kwaliteit van de lucht in de experimenteeromgeving. **zorg voor stabiliteit gedurende 20 minuten voordat u met het experiment begint. Om de NO-verbruikstest uit te voeren, moet de schaal op de software worden gewijzigd om waarden tussen 70 mV en 100 mV (bijv. 0-100 mV) vast te leggen, wat de beoogde basislijnspanning is. Deze aanpassing wordt voorgesteld om volledige controle te hebben over de monsterinjectie, die het mogelijk maakt om het signaal te documenteren dat zich vanaf de basislijn beweegt na de injectie van een monster en om het signaal te observeren dat terugkeert naar de basislijn. Gegevensregistratie wordt niet beïnvloed door of beperkt tot de gevisualiseerde schaal.

Aanvullende figuur 1: Pieken na NO-detectie in de VCl3 in HCl-assay. De pieken die volgen op monsteradministratie in de VCl3 in HCl worden weergegeven op de CLD-bundelsoftware. De berekening van het gebied onder de piek voor elke injectie wordt voor het gemak weergegeven en uitgelegd in aanvullende figuur 2. In dit experiment zijn normen van verschillende concentraties toegediend voor de kalibratiecurve, gevolgd door plasmamonsters. Verdunning is een nuttige oplossing om metabolieten te berekenen uit monsters die NO opleveren aan de bovenkant of zelfs buiten de kalibratiecurve. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Door de gebruiker ondersteunde geautomatiseerde berekening van het gebied onder de piek. Bij het uitvoeren van de NO-consumptietest door celvrij hemoglobine, kan het nodig zijn om pieken handmatig in te stellen om de software de meest nauwkeurige limieten te bieden om het gebied onder de piek te meten die door elke monsterinjectie wordt gegenereerd. (A) Representatief volledig beeld van een opgenomen experiment. Het wordt bereikt door in het hoofdmenu op Verwerken te klikken en door het opgenomen interessante bestand te selecteren en te openen. De gele lijn vertegenwoordigt de signaaldrempel (mV) die het rechte segment van het gebied onder de piek vormt. Door erop te klikken, kan de gebruiker het naar het signaalgebied slepen. De x- en y-as kunnen worden gewijzigd om in te zoomen op de piek van interesse voor nauwkeurige meting door op de knoppen linksonder te klikken of door de gewenste minimum- en maximumwaarde voor elk in te voeren. B) Plaatsbepaling van de drempels. De gebruiker kan de optimale basisdrempel selecteren door de gele lijn naar het signaalmiddenpunt te slepen vlak voordat het signaal wordt teruggevallen dat door de monsterinjectie wordt veroorzaakt. Om het gebied verder te beperken, klikt de gebruiker op de knop Pieken handmatig instellen . (C) Start- en eindcursors positioneren. Door op de knop Startcursor instellen te klikken, verschijnt er een groene lijn op het scherm. De groene lijn moet worden geplaatst (door slepen en loslaten) helemaal aan het begin van de daling veroorzaakt door de monsterinjectie. Dezelfde knop verandert het label in Eindcursor instellen door te klikken op welke rode lijn op het scherm verschijnt. De rode lijn moet worden geplaatst op het punt waar het signaal de basislijn weer bereikt na de afbuiging veroorzaakt door NO-consumptie van het geïnjecteerde monster. Al met al geven de drempellijn (geel, B), de groene lijn en de rode lijn het gebied dat door de monsterinjectie wordt gegenereerd nauwkeurig weer. (D) Het opbrengen van het gebied onder de piek. Door op de knop Integreren (C) te klikken, wordt het berekende gebied onder de piek rechtsboven in het scherm weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Representatieve spreadsheet met kalibratiecurve en resultaten. De berekende gebieden onder de pieken gegenereerd door stikstofmonoxide (NO) consumptie door injectie van monsters met een bekende concentratie van celvrij hemoglobine (uitgedrukt als [μM] van heem) worden linksboven (op gele achtergrond) weergegeven. De waarden worden uitgezet om de kalibratiecurve en de resulterende lineaire vergelijking y= mx + q te bouwen. De helling (m) is het aantal oxyHb-heemgroepen (μM) dat nodig is om het signaal dat door de fotomultiplicatorbuis wordt gedetecteerd met 1 mV te verminderen. Berekende waarden van drievoudige injecties (Run N 1,2,3) van monsters van één patiënt verkregen op vier verschillende tijdstippen (gemarkeerd door verschillende achtergrondkleuren) werden in de spreadsheet ingevoerd. Het gemiddelde van elk drievoud werd gebruikt om de waarde van NO-verbruik veroorzaakt door elk monster op te leveren door de lineaire vergelijking op te lossen: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Equation 1

Aanvullend bestand 1: De pieken bekijken met behulp van de meegeleverde software. Dit bestand bevat een screenshot van de meegeleverde software en de acties die voor elke knop zijn toegestaan. Voor elke piek (inclusief valse pieken veroorzaakt door artefacten), kan de gebruiker de knoppen in het bestand gebruiken om een specifieke piek naar behoefte te bevestigen, te negeren of te verwijderen of een naam te geven. De gebruiker kan ook een piek opnemen die niet eerder is gedetecteerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vanwege de hoge gevoeligheid hebben op chemiluminescentie gebaseerde assays voor de bepaling van NO en gerelateerde verbindingen een hoog risico op NO 2-contaminatie. Elk reagens (met name de NO2-blokkerende oplossing) en verdunningsmiddel (inclusief ddH2O) dat in het experiment wordt gebruikt, moet worden getest op zijn NO 2-gehalte om te corrigeren voor achtergrondsignaal. Nitriet is extreem reactief met een halfwaardetijd in volbloed rond de 10 min en genereert snel NO3-. De tijd die verstrijkt tussen bloedafname en centrifugering, of NO 2-blokkering, kan daarom preanalytische fouten veroorzaken en moet worden geminimaliseerd15. Verzamel in een test met behulp van plasmamonsters bij voorkeur bloed in heparinebuizen en centrifugeer bij 750 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C na thiolgroepblokkade met 40 μL van 200 nM NEM geproduceerd door 250 mg NEM op te lossen in 10 ml fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS). De stockoplossing kan bij 4 °C worden bewaard. Verbindingen zoals nitroarginine, nitroprusside en nitroglycerine die NO-synthase (NOS) remmen, ondergaan een langzame niet-kwantitatieve conversie naar NO, wat resulteert in een verhoging van de uitgangswaarde. Als het gebruik van NOS-remmers deel uitmaakt van het onderzoek, wordt geadviseerd blokkers te gebruiken die geen nitrogroepen bevatten43. De inlaatdruk in het spoelvat moet overeenkomen met de continue onderdruk die door de CLD voor bemonstering wordt gemaakt. Als de inlaatdruk laag is, kan de vacuümdestillatie van het medium leiden tot verontreinigde gaszuiveringsleidingen en -kamers, wat resulteert in signaalvervorming. Bovendien kunnen kleine hoeveelheden lucht het spoelvat binnendringen en met de oplossing reageren om overmatig NO te genereren. Integendeel, overmatige druk veroorzaakt door een stroomsnelheid die hoger is dan de stroom van het monster kan NO in de atmosfeer afgeven, wat leidt tot een onderschatting van het signaal15. Bovendien vereisen zowel het VCl3 in HCl als het I3- in azijnzuurprotocol meerdere verdunningen tijdens de bereiding en meerdere berekeningen om de monsterconcentratie op te leveren. Elke stap moet zorgvuldig worden geregistreerd als verdunningen en berekeningen worden door veel groepen herkend als de belangrijkste bron van fout44.

Toevoeging van NO 2-blokkerende oplossing (stap 2.1.2) zorgt ervoor dat rode bloedcellen lyseren, waardoor alle OxyHb tot MetHb wordt gereduceerd. Het vermijdt de snelle reductie van ijzerhoudende eiwitten (voornamelijk OxyHb) met NO2- met de volgende generatie van NO3-. Behandeling van monsters met deze oplossing bij het verzamelen is vereist om NO2- en/of NO3- correct te meten. De oplossing mag daarentegen niet worden gebruikt bij het plannen van het NO-verbruik door celvrije Hb-assay. Aliquots van de NO2-blokkerende oplossing moeten samen met de monsters worden opgeslagen en worden gebruikt om het deel van het signaal dat door de oplossing zelf wordt veroorzaakt, te verwijderen. Ten slotte moet bij de berekening van de eindconcentratie van de gemeten metaboliet rekening worden gehouden met de verdunningsfactoren. In de I 3-in-azijnzuurtest wordt de NO 2-concentratie verkregen door de concentratie van het aliquot dat AS bevat zonder HgCl2 (S-NO en Fe-NO) af te trekken van die van aliquot die alleen PBS bevat (NO 2-, S-NO, Fe-NO). Om de concentratie van S-NO (kwik-labiele eiwitten) te berekenen, moet de concentratie van de aliquot behandeld met AS met HgCl2 (Fe-NOs of kwikstabiele nitroso-eiwitten) worden afgetrokken van die van de aliquot die met AS is behandeld zonder HgCl2. Alvorens af te trekken, moet de gebruiker zich herinneren dat de concentratie van elke aliquot is vermenigvuldigd met 0,8181 (270/330) om rekening te houden met de verdunningsfactor die tijdens monsterpreparaten wordt gebruikt (figuur 3). Hetzelfde concept is van toepassing op S-NO-Hb- en Hb-NO-metingen, waarbij absolute concentraties een fractie zijn van gemeten Hb22. Afhankelijk van het type monster kan het voor een nauwkeurige telling van de NO3-concentratie nodig zijn om zowel het VCl3 in HCl-protocol als het I3- in azijnzuurprotocol uit te voeren om uiteindelijk de concentratie van NO2- af te trekken van die van NO3- en NO2-. Dit is niet altijd nodig in bijvoorbeeld volbloed- en plasmamonsters, waar NO3- meestal veel hoger is dan NO2-.

Het is erg belangrijk om eraan te herinneren dat de CLD zal worden beschadigd als de NaOH-val niet op de juiste plaats zit bij het uitvoeren van een VCl3 in HCl-assay vanwege de corrosie van HCl. De 1 M NaOH-oplossing die wordt gebruikt om de NaOH-val te vullen, kan worden gekocht of bereid door 4 g NaOH-zout op te lossen in 100 ml ddH2O of door 5 ml van 50% NaOH te verdunnen in 100 ml ddH2O. Bij verdere verdunning tot 10 μM met ddH2O is de NaOH zeer nuttig om eiwitresten te verwijderen door injectie in het spoelvat.

Het door de CLD gedetecteerde uitgangssignaal moet stabiel zijn en binnen 0-5 mV. Een hoger basissignaal kan worden veroorzaakt door luchtvervuiling (door NO en derivaten), en dit kan worden geverifieerd door de inlaat in de open lucht te laten. Als een hogere spanning alleen in het spoelvat wordt waargenomen, terwijl verontreiniging van de tank met inert gas moet worden overwogen, is dit meestal te wijten aan de persistentie van organische overblijfselen of de aanwezigheid van NO2- in de buis. Het meerdere keren wassen van het spoelvat met ddH2O kan helpen de basislijnspanning te minimaliseren. Als dit niet lukt, helpt de incubatie van het spoelvat met 100 mM NaOH gedurende 24-48 uur gevolgd door meerdere wasbeurten met ddH2O verontreinigende stoffen te elimineren. In de NO-consumptie door celvrije Hb-assay is het vereiste CLD-signaal 70-100 mV gedurende ten minste 20-30 minuten. Als het signaal niet stabiel is (d.w.z. de spanning neemt af), kan een extra dosis van 10 μL DETA NONOate aan het spoelvat worden toegevoegd. Dit kan indien nodig worden herhaald. Het is essentieel om te onthouden dat zowel ongebruikt poeder als reeds geëxpandeerd DETA NONOaat bij -80 °C moeten worden bewaard. Dit reagens vervalt snel ondanks optimale opslag en presteert misschien ondermaats wanneer het niet vers wordt bereid, waardoor meerdere injecties in het spoelvat nodig zijn en dit leidt tot een minder stabiel iso-elektrisch signaal. Wat nog belangrijker is, het moet worden uitgebreid in PBS met pH 7,4, omdat dit de halfwaardetijd optimaliseert (56 h bij pH 7,4 bij kamertemperatuur versus quasi-onmiddellijke dissociatie bij pH van 5,0) 45. De spuit die wordt gebruikt voor de injectie van DETA NONOate mag uitsluitend voor die actie worden gebruikt en mag niet worden gebruikt voor de injectie van monsters.

Als de injectie van een monster een piek genereert die hoger is dan het bovenste punt van de kalibratiecurve, vooral als het een spanning van meer dan 700 mv genereert, wordt geadviseerd om het monster te verdunnen (2x of 4x) om fouten te minimaliseren. Dit geldt ook voor de NO-verbruikstest als de dip veroorzaakt door monsterinjectie dieper is dan die veroorzaakt door de injectie van het meest geconcentreerde monster dat in de kalibratiecurve wordt gebruikt. Het bewijs van een piek (of een tot en toe) in het signaal na injectie die minder is dan verwacht of afwezig is, kan wijzen op verstopping van de precisiespuit die voor injectie wordt gebruikt. Vanwege de kleine volumes die worden gebruikt (10-20 μL/monster), met name als plasma- of urinetests worden uitgevoerd, kan het moeilijk zijn om onderscheid te maken tussen een gevulde spuit en de afwezigheid van het monster als gevolg van verstopping van de spuit. Het wordt geadviseerd om aandacht te besteden aan de weerstand van de zuiger. Na bevestiging door inspectie van de spuit kan worden geprobeerd de obstructie te verwijderen door de spuit herhaaldelijk te wassen met ddH2O en door de spuit op een delicaat taakdoekje te wrijven als de obstructie uitwendig zichtbaar is. Bij twijfel wordt geadviseerd om het monstervolume op een taakdoekje uit te werpen en terug te gaan om de spuit met ddH2O te wassen en te proberen de monstertoediening te herhalen. Schuimvorming is een veel voorkomende complicatie en dwingt het experiment te beëindigen zodra de hoogte van de vloeistofkolom die van de reactiekolom overschrijdt, waardoor signaalinstabiliteit ontstaat. Overschrijding van de in het protocol aangegeven dosis antischuimmiddel kan leiden tot een toename van het uitgangssignaal en moet worden vermeden. Het aantal monsters dat de vorming van overmatig schuimvorming veroorzaakt, wordt voorspelbaar wanneer herhaalde testen worden uitgevoerd, een fenomeen dat zou moeten informeren hoe het experiment optimaal kan worden gepland. Een optionele stap om het schuimen te verminderen is het mengen van plasma of weefselsupernatant met koude methanol (verhouding 1:1) en centrifugeren gedurende 15 min, 13000 x g bij 4 °C. Er moet rekening mee worden gehouden dat methanol ervoor zorgt dat eiwitten neerslaan. Alleen lichte S-NOs en Fe-NOs die niet proteïsch van aard zijn, worden gemeten. Daardoor kan deze optie niet worden gebruikt in studies op volbloed of in andere gevallen waarin er interesse is in S-NO- en Fe-NO-eiwitten.

Meer andere reagensoplossingen dan VCl3 in HCl en de I3- in azijnzuur zijn beschreven en met succes toegepast. Ascorbinezuur vermindert specifiek NO2-, reageert niet met NO3- noch S-NOs, en kan worden gebruikt om het grootste deel van de geïnjecteerde monsters en berekeningen te verminderen in situaties waarin NO2- het enige molecuul van belang is. De belangrijkste valkuil is de beperkte stabiliteit van het reagens, waardoor frequentere veranderingen van de reagensoplossing en daardoor herhaalde kalibratiesnodig zijn 46. Een test met koolmonoxide en koperchloride (CuCl)-verzadigde cysteïne (3C-methode) kan specifiek S-NOs detecteren met een gevoeligheid die vergelijkbaar is met I3- maar vereist nog steeds behandeling met en zonder HgCl2 om niet-specifieke reacties te voorkomen47. Om een hogere precisie in signaalanalyse te bereiken, worden experimenten opgenomen in het .data-formaat, zodat offline golfvormanalyse kan worden voltooid met andere software dan het bundelprogramma dat in het protocol wordt weergegeven.

Zodra de eerste injectie is gemaakt, kan het experiment niet worden gestopt. Als een pauze nodig is en/of als een toestand wordt gewijzigd (samenstelling van het purgevatmedium, spoelgasstroom, basislijnspanning), is het experiment alleen geldig voor de monsters die tot dat moment zijn geïnjecteerd. Er moet een nieuwe standaardcurve worden uitgevoerd voordat meer monsters worden gemeten. De precisie die wordt toegestaan door op chemiluminescentie gebaseerde assays heeft een prijs. De testen zijn om een aantal redenen tijdrovend: 1) automatisering is niet mogelijk omdat handmatige monsterinjectie in duplicaten vereist is; 2) de meeste reagentia die worden gebruikt, kunnen niet voor lange perioden worden opgeslagen; 3) elk experiment moet worden gestart met standaardmonsters in bekende concentraties voor kalibratie en kan niet worden gepauzeerd tenzij de kalibratie wordt herhaald; 4) elk monster is verdeeld in aliquots die verschillende mengsels van reagentia bevatten om specifieke reacties te blokkeren om uiteindelijk de concentratie van specifieke metabolieten te berekenen door andere af te trekken.

Dit werk is gericht op het apparaat Zysense NOA 280i, dat een detectiedrempel heeft van <1 ppb NO in de gasfase (overeenkomend met maximaal 1 pM NO in de vloeibare fase) en een bemonsteringsstroom van 10-300 ml / min. Andere CLD's zijn verkrijgbaar met een bundelbuissysteem voor de meting van metabolieten in de vloeibare fase. Ecofysische CLD's hebben een hogere gevoeligheidsdrempel, 1 ppb in hun meest gevoelige model, maar het voordeel dat er geen zuurstoftank nodig is voor ozongeneratie. Aan de andere kant is hun gerapporteerde bemonsteringsstroom 1000 ml / min, wat een hoger verbruik van de inerte gastank impliceert die wordt gebruikt voor het spoelvat. Andere CLD-machines zijn gewijd aan uitgeademde NO-analyse voor klinisch gebruik.

Chemiluminescentie is de meest gevoelige en gevalideerde methode om specifiek NO-consumptie door celvrij Hb op het gebied van hemolyse te beoordelen. Er zijn andere technieken beschikbaar om NO, NO2-, NO3-, S-NOs en kwik-labiele nitrosoverbindingen te meten. De directe meting van NO-gas kan worden verkregen door chemiluminescentie of met behulp van speciale elektroden die variëren van de meting van het uitgeademde gas tot eencellige elektroden. Deze meten alleen GEEN gas, zijn minder duur (maar toch bederfelijker), vereisen vaker kalibratie en zijn minder nauwkeurig in vergelijking met een CLD31. Nitrieten en NO3- zijn historisch gemeten met de Griess-reactie, een colorimetrische techniek die in zijn oorspronkelijke versie beide moleculen detecteert zonder de mogelijkheid om hun relatieve concentratie in het monster te onderscheiden. Moderne varianten van de techniek omvatten omgekeerde fasechromatografie waarbij het monster in twee kolommen wordt gescheiden, waardoor twee onafhankelijke reacties met NO3- en NO2- mogelijk zijn. De gevoeligheid van die methoden is micromolair of iets minder, in vergelijking met 1 nM met CLD. De belangrijkste valkuilen zijn tijdsbesteding en incompatibiliteit met monsters die voorbehandeld zijn met kwik en/of ferricyanide14. S-NOs kunnen ook worden gedetecteerd met colorimetrische en fluorometrische technieken met een gevoeligheid tot 0,5 μM in vergelijking met 100 fM beschreven met behulp van chemiluminescentie zoals weergegeven in het I3- in azijnzuurprotocol 14,41,42. De biotine-switch-test heeft, ondanks het feit dat S-NOs in het picomolaire bereik niet worden gedetecteerd, het voordeel dat het biotine-gelabelde eiwitten genereert die kunnen worden gezuiverd en geïdentificeerd met proteomische analyse48. Wanneer in detail bekeken, deelt elke techniek één gemeenschappelijke valkuil, namelijk de extreme reactiviteit van NO en zijn derivaten die blokkade van reacties vereisen voor in vitro metingen. Voorbehandeling van monsters is van cruciaal belang, en het beantwoorden van de vraag of een bepaalde voorbehandeling een reactie volledig blokkeert of dit beter doet dan een andere, is tot nu toe een drijvende kracht geweest naar een toename van methodologische studies. Hoewel de extreme reactiviteit in vivo van NO zeker een drijfveer is geweest om gevoelige methoden voor de detectie van zijn metabolieten te onderzoeken, heeft directe meting van NO de afgelopen drie decennia aanzienlijke vooruitgang geboekt sinds de eerste amperometrische detector in 1990 werd ontwikkeld. Sindsdien zijn meer dan twintig verschillende sondes beschreven, waaronder nanosensoren die worden gebruikt om eencellige NO-inhoud49 te bestuderen. Elektrochemische sensoren zijn de belangrijkste hulpmiddelen die NO zowel in vivo als in real-time kunnen detecteren. In de longgeneeskunde hebben meerdere studies op elektroden gebaseerde machines vergeleken met CLD's. Meting van uitgeademd NO is eenvoudiger dan andere testen voor metabolietdetectie, waarbij ofwel directe verbinding van de gasleiding (via IFD-filter) met een ademhalingsbijlage van een gesloten systeem of een paar ademhalingen in een zak voor offline analyse vereist is, maar de kosten en slechtere draagbaarheid van CLD's stagneren. Een aantal elektrochemische apparaten voldoet momenteel aan de criteria voor klinisch gebruik, hoewel ze een lagere gevoeligheid en reproduceerbaarheid hebben in vergelijking met CLD's. Bovendien is de concordantie in termen van absolute gemeten waarden suboptimaal tussen apparaten, dus het wordt aanbevolen dat patiënten altijd worden opgevolgd met hetzelfde elektrochemische apparaat50. Het gebruik van CLD's in omgevingen zoals het meten van nasaal uitgeademd NO en in onderzoeksinstellingen zoals therapeutische lage en hoge dosis geïnhaleerd NO is nog steeds noodzakelijk.

Nauwkeurige metingen van NO, zijn derivaten en NO-bindende eiwitten zijn op vele niveaus nodig om een over het hoofd gezien en nog steeds grotendeels onbekend mechanisme van signalering te begrijpen. De toepassingsgebieden omvatten biologie en pathologie op zowel preklinisch als klinisch niveau met specifieke doelgebieden, waaronder immunobiologie, neurowetenschappen, cardiovasculaire wetenschappen en infectieziekten. Preklinische studies en klinische studies onderzoeken het gebruik van geïnhaleerd NO-gas als een therapeutisch middel. Diepere kennis over hoe exogene NO-gas de concentratie van NO-metabolieten en NO-gebonden eiwitten op elk niveau, van plasma tot celcompartimenten, beïnvloedt, zal nodig zijn. Implementatie van hoogrenderende proteomica kan waarschijnlijk het aantal bekende mediatoren verhogen die worden beïnvloed door NO en zijn derivaten en kan nieuwe mechanistische onderzoeken vereisen die nauwkeurige metingen van NO-metabolieten vereisen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.B. ontvangt salarissteun van K23 HL128882/NHLBI NIH als hoofdonderzoeker voor zijn werk aan hemolyse en stikstofmonoxide. LB ontvangt subsidies van "Fast Grants for COVID-19 research" aan het Mercatus Center van de George Mason University en van iNO Therapeutics LLC. B.Y. wordt ondersteund door subsidies van een NHLBI/#R21HL130956 en DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. ontving patenten bij MGH op de elektrische opwekking van stikstofmonoxide.

L.B. en B.Y. hebben een patentaanvraag ingediend voor NO delivery in COVID-19 disease PCT application number: PCT/US2021/036269 ingediend op 7 juni 2021. RWC ontvangt salarissteun van Unitaid als hoofdonderzoeker voor technologische ontwikkeling gericht op gedecentraliseerde diagnose van tuberculose bij kinderen in omgevingen met weinig middelen.

Acknowledgments

De protocollen die in dit manuscript worden gerapporteerd, werden mogelijk gemaakt door de verzamelde bijdragen van eerdere fellows van Dr. Warren Zapol's laboratorium voor anesthesieonderzoek in kritieke zorg, afdeling anesthesie in het Massachusetts General Hospital. We erkennen de bijdrage van Drs. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli en Emanuele Rezoagli.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma 45754 500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion Sigma A5757 250 mL - liquid
DETA NONOate Cayman 82120 10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190144 500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M) Sigma 258148 500 mL - liquid
Iodine SAFC 207772 100 g - solid
Kimwipes Kimtech 34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5% Sigma 215465 100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe Hamilton 80530 Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe Hamilton 84854 Microliter syringe
N-ethylmaleimide Sigma 4260 25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel Zysense NOA 280i Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40) ThermoFisher 85125 10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99% Sigma 244023 100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99% Sigma 221945 100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS Supelco 105067 250 g - crystalline
PowerGen 125 Fisher Scientific 14-359-251 Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump Edwards A65201906 Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo BD Biosciences BD367871 75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97% Sigma 795429 1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99% Sigma 221341 500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99% Sigma S2252 500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98% Sigma S9251 100 g - solid
Vanadium (III) Chloride Sigma 112393 25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper Sigma WHA10010155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 276 (14), 1186 (1996).
  3. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Byrns, R. E., Wood, K. S., Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide possess identical pharmacologic properties as relaxants of bovine arterial and venous smooth muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 246 (1), 218-226 (1998).
  4. Arnold, W. P., Mittal, C. K., Katsuki, S., Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3203-3207 (1977).
  5. Hayashida, K., et al. Depletion of vascular nitric oxide contributes to poor outcomes after cardiac arrest. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (10), 1288-1290 (2019).
  6. Ignarro, L. J. Inhaled NO and COVID-19. British Journal of Pharmacology. 177 (16), 3848-3849 (2020).
  7. Gantner, B. N., LaFond, K. M., Bonini, M. G. Nitric oxide in cellular adaptation and disease. Redox Biology. 34, 101550 (2020).
  8. Clark, R. H., et al. Low-dose nitric oxide therapy for persistent pulmonary hypertension of the newborn. New England Journal of Medicine. 342 (7), 469-474 (2000).
  9. Goldbart, A., et al. Inhaled nitric oxide therapy in acute bronchiolitis: A multicenter randomized clinical trial. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  10. Bangirana, P., et al. Inhaled nitric oxide and cognition in pediatric severe malaria: A randomized double-blind placebo controlled trial. PloS One. 13 (1), 0191550 (2018).
  11. Jiang, S., Dandu, C., Geng, X. Clinical application of nitric oxide in ischemia and reperfusion injury: A literature review. Brain Circulation. 6 (4), 248-253 (2020).
  12. Lei, C., et al. Nitric oxide decreases acute kidney injury and stage 3 chronic kidney disease after cardiac surgery. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (10), 1279-1287 (2018).
  13. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  14. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radical Biology and Medicine. 43 (5), 645-657 (2007).
  15. Macarthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. Journal of Chromatography B. 851 (1-2), 93-105 (2007).
  16. Helms, C., Kim-Shapiro, D. B. Hemoglobin-mediated nitric oxide signaling. Free Radical Biology and Medicine. 61, 464-472 (2013).
  17. Kim-Shapiro, D. B., Schechter, A. N., Gladwin, M. T. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (4), 697-705 (2006).
  18. Rezoagli, E., et al. Pulmonary and systemic vascular resistances after cardiopulmonary bypass: role of hemolysis. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 31 (2), 505-515 (2017).
  19. Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
  20. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  21. Heinrich, T. A., Da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer, C. H., Wink, D. A., Fukuto, J. M. Biological nitric oxide signalling: chemistry and terminology. British Journal of Pharmacology. 169 (7), 1417-1429 (2013).
  22. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of s -nitrosothiols, iron-nitrosyls, and nitrite in biological samples. Free Radical Research. 37 (1), 1-10 (2003).
  23. Hayashida, K., et al. Improvement in outcomes after cardiac arrest and resuscitation by inhibition of s-nitrosoglutathione reductase. Circulation. 139 (6), 815-827 (2019).
  24. Rodríguez-Ortigosa, C. M., et al. Biliary secretion of S-nitrosoglutathione is involved in the hypercholeresis induced by ursodeoxycholic acid in the normal rat. Hepatology. 52 (2), Baltimore, Md. 667-677 (2010).
  25. Mitchell, D. A., Marletta, M. A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine. Nature Chemical Biology. 1 (3), 154-158 (2005).
  26. Mannick, J. B., et al. Fas-induced caspase denitrosylation. Science. 284 (5414), New York, NY. 651-654 (1999).
  27. Choi, Y. -B., et al. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation. Nature Neuroscience. 3 (1), 15-21 (2000).
  28. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stamler, J. S., Meissner, G. The skeletal muscle calcium release channel: Coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102 (4), 499-509 (2000).
  29. Stamler, J. S., et al. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (16), 7674-7677 (1992).
  30. Dunham, A. J., Barkley, R. M., Sievers, R. E. Aqueous nitrite ion determination by selective reduction and gas phase nitric oxide chemiluminescence. Analytical Chemistry. 67 (1), 220-224 (1995).
  31. Hogg, N., Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Detection of Nitric Oxide and Peroxynitrite in Biological Systems: A State-of-the-Art Review. Nitric Oxide (Third Edition). Ignarro, L. J., Freeman, B. A. , Academic Press. Chapter 3 23-44 (2017).
  32. Gudem, M., Hazra, A. Mechanism of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. The Journal of Physical Chemistry A. 123 (4), 715-722 (2019).
  33. Ishibe, Y., Liu, R., Hirosawa, J., Kawamura, K., Yamasaki, K., Saito, N. Exhaled nitric oxide level decreases after cardiopulmonary bypass in adult patients. Critical Care Medicine. 28 (12), 3823-3827 (2000).
  34. American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
  35. Cuthbertson, B. H., Stott, S. A., Webster, N. R. Exhaled nitric oxide as a marker of lung injury in coronary artery bypass surgery. British Journal of Anaesthesia. 89 (2), 247-250 (2002).
  36. Ewing, J. F., Janero, D. R. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radical Biology and Medicine. 25 (4-5), 621-628 (1998).
  37. Braman, R. S., Hendrix, S. A. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium(III) reduction with chemiluminescence detection. Analytical Chemistry. 61 (24), 2715-2718 (1989).
  38. Wang, X., et al. Biological activity of nitric oxide in the plasmatic compartment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11477-11482 (2004).
  39. Bryan, N. S., Rassaf, T., Rodriguez, J., Feelisch, M. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10 (4), 221-228 (2004).
  40. Kida, K., Shirozu, K., Yu, B., Mandeville, J. B., Bloch, K. D., Ichinose, F. Beneficial effects of nitric oxide on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice. Anesthesiology. 120 (4), 880-889 (2014).
  41. Gladwin, M. T., et al. S-Nitrosohemoglobin is unstable in the reductive erythrocyte environment and lacks O2/NO-linked allosteric function. The Journal of Biological Chemistry. 277 (31), 27818-27828 (2002).
  42. Feelisch, M., et al. and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. The FASEB Journal. 16 (13), 1775-1785 (2002).
  43. Liu, T., et al. L-NAME releases nitric oxide and potentiates subsequent nitroglycerin-mediated vasodilation. Redox Biology. 26, 101238 (2019).
  44. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54879 (2016).
  45. Keefer, L. K., Nims, R. W., Davies, K. M., Wink, D. A. 34;NONOates" (1-substituted diazen-1-ium-1,2-diolates) as nitric oxide donors: Convenient nitric oxide dosage forms. Methods in Enzymology. , Academic Press. 281-293 (1996).
  46. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radical Biology and Medicine. 42 (8), 1146-1154 (2007).
  47. Doctor, A., et al. Hemoglobin conformation couples erythrocyte S-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5709-5714 (2005).
  48. Zhang, Y., Keszler, A., Broniowska, K. A., Hogg, N. Characterization and application of the biotin-switch assay for the identification of S-nitrosated proteins. Free Radical Biology and Medicine. 38 (7), 874-881 (2005).
  49. Davies, I. R., Zhang, X. Nitric Oxide Selective Electrodes. Methods in enzymology. Poole, R. K. , Academic Press. Chapter 5 63-95 (2008).
  50. Saito, J., et al. Comparison of fractional exhaled nitric oxide levels measured by different analyzers produced by different manufacturers. Journal of Asthma. 57 (11), 1216-1226 (2020).

Tags

Geneeskunde Nummer 180
Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R.… More

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R. W., Berra, L. Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds. J. Vis. Exp. (180), e63107, doi:10.3791/63107 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter