Summary
מיקרוסקופיה של ליטוגרפיה וכוח המתיחה של כמעט UV משולבות כדי למדוד כוחות תאיים על הידרוג'לים מיקרו-מרופדים. שחרור ממוקד המושרה באור של תאים בודדים מאפשר מספר גבוה של מדידות באותה דגימה.
Abstract
מיקרוסקופיה כוח המתיחה (TFM) היא השיטה העיקרית המשמשת מכניולוגיה למדידת כוחות התא. בדרך כלל זה משמש עבור תאים דבקים מצעים רכים שטוחים כי לעוות תחת המתיחה של התא (2D-TFM). TFM מסתמכת על שימוש בחומרים אלסטיים ליניאריים, כגון פולידימתילסילוקסן (PDMS) או פוליאקרילמיד (PA). עבור 2D-TFM ב- PA, הקושי להשיג תפוקה גבוהה נובע בעיקר מהשונות הגדולה של צורות התאים והמתיחה, הקוראים לתקנון. אנו מציגים פרוטוקול לייצור הידרוג'לים של PA במהירות וביעילות עבור מחקרי 2D-TFM. המיקרו-פטרנים נוצרים לראשונה על ידי פוטוליתוגרפיה ללא מסכה באמצעות אור כמעט UV שבו חלבוני מטריצה חוץ-תאיים נקשרים רק לאזורים המיקרו-מרופדים, בעוד ששאר פני השטח נשארים לא דבקים לתאים. micropatterning של חלבוני מטריצה חוץ תאית נובע נוכחות של קבוצות אלדהיד פעיל, וכתוצאה מכך אזורים דבק של צורות שונות כדי להכיל תאים בודדים או קבוצות של תאים. עבור מדידות TFM, אנו משתמשים בהידרוג'לים של PA בעלי גמישות שונה על ידי שינוי כמויות האקרילאמיד והביס-אקרילאמיד ומעקב אחר עקירה של חרוזי פלורסנט משובצים כדי לשחזר שדות מתיחה של תאים עם Cytometry המתיחה של פורייה (FTTC).
כדי להשיג עוד יותר הקלטה מדויקת של כוחות התא, אנו מתארים את השימוש במינון מבוקר של אור בדוגמת כדי לשחרר מתיחה של תאים באזורים מוגדרים עבור תאים בודדים או קבוצות של תאים. אנו קוראים לשיטה זו מיקרוסקופיה כוח מתיחה UV מקומית (LUVI-TFM). עם טיפול אנזימטי, כל התאים מנותקים מהדגימה בו זמנית, ואילו עם כוחות המתיחה LUVI-TFM של תאים באזורים שונים של המדגם ניתן לרשום ברצף. אנו מדגימים את תחולתו של פרוטוקול זה (i) לחקור כוחות המתיחה של התא כפונקציה של הידבקות מבוקרת למצע, ו- (ii) כדי להשיג מספר גדול יותר של תצפיות ניסיוניות מאותה מדגם.
Introduction
בעת אינטראקציה עם הסביבה החוץ-תאית שלהם, תאים דבקים מפעילים כוחות המתווכים בעיקר על ידי הידבקויות מוקד מבוססות אינטילרין המחברות את המטריצה החוץ תאית (ECM) לציטוסקלטון actin. הידבקויות מוקדיות הן מכלולים רב-תכליתיים המרוכזים סביב כריכת האינתגרינים לחלבוני ECM כמו פיברונקטין וקולגן. קיבוץ אינטנגרין וצמיחה של הידבקויות מוקדים חיוני לא רק לכינון חיבור יציב מכנית, אלא גם לגיוס חלבוני הידבקות מוקדיים אחרים, כולל אלה המפעילים את מסלול RhoA להסדרת התכווצות הסלולר1. התכווצות תלוית RhoA של ציטוסקלטון actin מאפשר לתאים להתפשט ולעבור על ECM הבסיסי, וגם לחוש נוקשות שלה2. התפלגות כוחות המתיחה תלויה מאוד באזור ובצורת התפשטות התאים, שניהם מסתמכים על מאפייני מטריצה ולכן משפיעים על ארגון הציטוסלד, ובסופו של דבר יוצרים לולאת משוב סגורה בין מכניקת מטריקס לארגון הציטוסד3,4.
טכניקות מיקרו-מפטרינג פני השטח מאפשרות שליטה מוגדרת על צורת התא על ידי יצירת אזורים בגודל מיקרון המציגים חלבוני דבק ECM; בהתאם לגודל של אזורים אלה, תאים בודדים, או קבוצות של תאים לדבוק micropattern5. חלבוני ECM יכולים להיות מעוצבים על מצע זכוכית על ידי גישות שונות כגון הדפסת מיקרו-קונטקט, דפוסי תמונות או דפוס לייזר6. השימוש באור UV (λ = 185 או 375 ננומטר) בשילוב עם אסטרטגיות אנטי-פילינג פני השטח מציע את הגמישות לעיצוב צורות וגדלים שונים ושתקה של סוגי חלבון מרובים עם דיוק גבוה ליד קצוות פני השטח7,8. האזורים מצופים בכימיקלים דוחי חלבון כגון פוליאתילן גליקול (PEG) מוגנים עם מסכת צילום כרום או מערכת ליטוגרפיה מבוססת התקן מראה דיגיטלית (DMD). הדפוסים במסכות מאפשרים חשיפה לאור UV של אזורים שאז יהיו בדוגמת חלבוני ECM. דפוס של משטחי הידרוג'ל עם חלבוני ECM דורש שלב העברה כדי להסיר חלבונים מפני השטח זכוכית ולהצליב אותם לדפוסים. לחלופין, דפוס על חומרים רכים ניתן להשיג על ידי ציפוי הראשון של מסכת הצילום עם חלבון דוחה, ואחריו שריפת האזורים ללא מסכה באמצעות תאורת UV עמוקה. מכיוון ש-UV עמוק מייצר אוזון וגורם לפני השטח להגיב לכריכת חלבונים, האזורים ללא מסיכה מצופים בחלבוני ECM ולבסוף הג'ל ממומש ישירות על גבי האזורים ללא מסיכה9,10.
הידרוג'לים בדוגמת ניתן להשתמש כדי לבצע TFM, טכניקה המודדת כוחות תא בממשק החומר התא11. ב 2D-TFM, אחד משתמש במשטח השטוח של סרט פולימר עבה, שבו חרוזי סמן כבר מוטבעים כדי לעקוב אחר עיוותים12,13,14,15. על מנת לחלץ וקטורים של תזוזה, חיוני לשלב שתי תמונות, אחת מהמצב המעוות ותמונת הפניה אחת ללא עיוותים. לאחר מכן, שתי התמונות ממופות זו על זו באמצעות עיבוד תמונה. בצפיפות סמן גבוהה, זה נעשה בדרך כלל עם חלקיק תמונה Velocimetry (PIV), שהיא שיטה מבוססת היטב כדי לשחזר את הזרימה ההידרודינמית. בצפיפות סמן נמוכה וב 3D-TFM, זה נעשה בדרך כלל עם מעקב חלקיקים Velocimetry (PTV), הכולל תכונות ספציפיות של ערכת הנתונים הניסיוני. דוגמה לחלופה זולה יותר מבחינה חישובית היא זרימה אופטית, כגון אלגוריתם Kanade-Lucas-Tomasi (KLT)16. במקרה של מצעים הידרוג'ל, חרוזים פלואורסצנטיים מוטבעים בדרך כלל בצפיפות גבוהה במהלך פילמור החומר, ותמונות נרשמות לפני ואחרי שחרור התא על ניתוק אנזימטי. ניתוק אנזימטי של תאים דבקים, למשל, על ידי טריפסיניזציה, מוביל לשחרור סימולטני של המתיחה התאית מכל התאים על ההידרוגלים, מה שמקשה על קבלת ניתוח מפורט ממספר גבוה של תאים.
כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנת הידרוג'לים מיקרו-מרופדים לשליטה בצורת התא ולוקליזציה ושיטה למדידת כוחות המתיחה ביעילות ברצף באמצעות UV כדי לנתק תאים בודדים מהמצע. למדידות כוח המתיחה, אנו מציגים טכניקה לייצור הידרוג'ל PA דו שכבתי, שבו חרוזים פלואורסצנטיים מוטבעים רק בשכבה העליונה, מה שמגביר את צפיפותם ומפחית את ההתפשטות האנכית שלהם. שילוב של שחרור בתיווך UV של כוחות המתיחה התאית עם micropatterning מאפשר להשיג שליטה מרחבית על ניתוק התא (למשל, של תאים בודדים מבלי להשפיע על הידבקות של תאים אחרים באזור העניין), בתנאי שיש מרחק מספיק בין תאים בדוגמת. המתיחה התאית משוחזרת לאחר מכן בשיטה היעילה והאמינה ביותר עבור 2D-TFM, כלומר, Cytometry המתיחה של התמרת פורייה (FTTC) עם הסדרה17,18.
Protocol
1. הכנת כיסויים ממתקריליים
הערה: כיסויי זכוכית הם methacrylated לקשר covalentents PA הידרוג'ל ולכן למנוע את ניתוקם במהלך הדגירה עם תאים. כיסויי זכוכית מיקרוסקופ משמשים להשגת איכות תמונה גבוהה.
- כדי להכין פתרון 300 מל, לקחת זכוכית 400 מל נקי ומניחים אותו בתוך מכסה המנוע אדים.
- יש להוסיף 10 מ"ל של מים מזוקקים כפולים (ddH2O) לתוך הכיס. הוסף 18.75 מ"ל של חומצה אצטית (≥99.8% ניתוח פרו, p.a.), 18.75 מ"ל של 3-(Trimethoxysilyl)פרופיל מתקרילט ו 252.5 מ"ל של אתנול (≥99.8% p.a.) באמצעות פיפטה סרולוגית. יוצקים את הפתרון לצלחת מתגבשת.
- נקה כיסויי זכוכית עגולים 24 מ"מ עם מגבונים מדויקים. מניחים את כיסויי המכסים בארון פוליטרפלוראתילן בהתאמה אישית.
- טובלים את המדף בתמיסה ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- קח את המדף ולשטוף את כל כיסויים עם אתנול (99.8% p.a.). יבש את כיסויי המכסים תחת זרימת האוויר.
הערה: ניתן לאחסן כיסויים Methacrylated למשך עד חודש אחד ב- RT.
2. מיקרו-מפטרנינג של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים על כיסויי זכוכית
הערה: כיסויי זכוכית מצופים תחילה בשכבה של מולקולות, המורכבת מחלבון ודוחה תאים. שכבה זו מוסרת לאחר מכן באמצעות טכניקת photopatterning, כדי לאפשר את התצהיר הבא של חלבוני מטריצה חוץ תאית באזורים micropatterned.
- קח כיסוי זכוכית עגולה 15 מ"מ ומניחים אותו על צלחת פטרי. השתמש בעט יהלום כדי לסמן את הצד העליון של כיסוי. לאחר מכן, להמשיך לנקות באמצעות טיפול פלזמה חמצן ב 0.4 mbar ו 200 W במשך 2 דקות.
- Pipette 100 μL של 0.01% פולי-L-ליסין פתרון על פני השטח של כל כיסוי. דגירה במשך 30 דקות ב RT. לשטוף את כיסויים עם 10 mM 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) pH 8.5. הסר כל נוזל עודף אבל לשמור על פני השטח רטובים.
- פיפט 100 μL של 50 מ"ג / מ"ל פולי (אתילן גליקול) מתיל אתר סוצ'ינימידיל חומצה ולרית (mPEG-SVA) ב 10 mM HEPES pH 8.5 על פני השטח של כל כיסוי. דגירה במשך שעה אחת ב RT. לשטוף את כיסויים עם 10 mM HEPES pH 8.5 להתייבש תחת זרימת האוויר.
- הוסף 2 μL של פוטוניטיאטור רגיש UV (למשל, PLPP-ג'ל) ואחריו 40 μL של אתנול (≥99.8% p.a.) על פני השטח. כדי להשיג התפלגות הומוגנית של הג'ל והאתנול על פני השטח, הטה בעדינות את צלחת הפטרי קדימה ואחורה. המתן 5 דקות עד שהפתרון יתאים פילמור.
- מניחים כיסוי יחיד בתוך צלחת פטרי 35 מ"מ עם חור של 20 מ"מ בתחתית. זה מאפשר לקרן הלייזר שמגיעה מלמטה להגיע ישירות למשטח הזכוכית.
- הפעל את המיקרוסקופ ומודול דפוס אור (עבודה עם התקן זה מותרת רק לאחר הקדמת בטיחות מקציני הבטיחות בלייזר). כייל את לייזר UV-A על יעד האוויר 20x. שים את הדגימה עם הפוטוטיניטור על הבמה. התאימו את המיקוד על פני הזכוכית והדליקו את בקרת המוקד. טען ונעל את התבנית שצוירה מראש.
- הכן את התבנית באמצעות תוכנה גרפית כגון Inkscape. ודא שקובץ התבנית אינו חורג ממדי DMD (1824 x 1140 px, התואם ל- 552 x 325 מיקרומטר ב- 20 x עדשה (0.28 מיקרומטר/px)).
הערה: מומלץ להשתמש בגודל DMD (1824 x 1140 פיקסלים) כגודל קובץ התבנית, מכיוון שהדבר יבטיח שאין שגיאה במהלך התבניות. לדוגמה, אל תפיק קובץ תבנית עם ממד של 1830 x 1130 פיקסלים. - לצורך העברת תבנית לפוליאקרילמיד, ודא כי התבנית נעשית רק עד 60%-70% מהרדיוס ממרכז הזכוכית לקצה.
- לתבנית תא בודד, השתמש בקוטר של 50-100 מיקרומטר עם מרחק של 100 מיקרומטר בין דפוסים וקוטר של 150-300 מיקרומטר עבור קבוצת תאים. גודל התבנית המתאים תלוי מאוד בגודל התא הטיפוסי, והוא צריך להיות גדול מספיק כדי לאפשר לתאים לדבוק.
- הכן את התבנית באמצעות תוכנה גרפית כגון Inkscape. ודא שקובץ התבנית אינו חורג ממדי DMD (1824 x 1140 px, התואם ל- 552 x 325 מיקרומטר ב- 20 x עדשה (0.28 מיקרומטר/px)).
- התחל את דפוס על ידי מינון UV של 30 mJ / mm2. משך התבניות תלוי במספר התבניות. יצירת תבנית אחת אורכת כשנה אחת.
- לאחר השלמת שלב התבנית, יש לשטוף את המשטח עם תמיסת מלח (PBS) עם אגירת פוספט שלוש פעמים. לדגור על המדגם עם 100 μL של 25 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין מומס ב 1x PBS ו 25 מיקרוגרם / מ"ל פיברינוגן Alexa488 מצומדים ב- PBS במשך שעה אחת ב- RT. עבור חלבוני ECM אחרים, מצא את הריכוזים האופטימליים המכסים לחלוטין את האזורים בדוגמת.
- יש לשטוף את המשטח עם PBS 1x שלוש פעמים. ודא כי הזכוכית בדוגמת משמש מיד להעברת זכוכית-PA. לאחסן את הזכוכית בדוגמת PBS ב RT במהלך הכנת הידרוג'ל.
3. ייצור של הידרוג'ל פוליאקרילמיד בדוגמת
הערה: הידרוג'לים Polyacrylamide מוכנים, כולל N-הידרוקסיאתיל אקרילאמיד מחומצן (HEA) כדי להציג קבוצות אלדהיד תגובתי עבור כריכה קוולנטית של חלבוני מטריצה על פני השטח. בנוסף, גישה דו שכבתית להטמעת חרוזים פלואורסצנטיים רק בשכבה העליונה של ההידרוג'ל משמשת לשיפור ההקלטה של תזוזת חרוזים במהלך ניסויי מיקרוסקופיה בכוח המתיחה.
- שים את כיסויי הזכוכית המהקריליים בצלחת פטרי.
- כדי להכין פתרון HEA מחומצן טרי, להוסיף 9.55 מ"ל של מים מזוקקים כפולים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. לאחר מכן, להוסיף 0.5 מ"ל של HEA, ו 42 מ ג של נתרן (meta) periodate כדי לקבל 10 מ"ל של הפתרון. מערבבים ללא הרף את הפתרון בחושך במשך 4 שעות.
- מערבבים אקרילאמיד, ביס-אקרילאמיד ומים מזוקקים כפולים על פי טבלה 1, כדי לקבל 10 מ"ל של הידרוג'ל פתרון מלאי (לעשות את זה מתחת למכסה המנוע אדים, מונומרים הם neurotoxic). דגה ולסגור את המכסה לכלב ים אטום.
הערה: פתרון המלאי ניתן לשמור aliquots עד שנה אחת ב 4 °C (75 °F). תמיד לאפיין את המודולוס של יאנג של הידרוג'ל לפני השימוש. - הכן הידרוג'ל PA דו שכבתי (לעשות את זה מתחת למכסה המנוע אדים, מונומרים הם neurotoxic).
- התחל עם השכבה התחתונה על ידי ערבוב עדין של 99.3 μL של תמיסת מלאי, 0.5 μL של 1% אמוניום אסולפט (APS), ו 0.2 μL של tetramethyl אתילנדיאמין (TEMED) בצינור 1.5 מ"ל. קח 10 μL מהפתרון ו pipette זה טיפה חכם על מרכז כיסוי methacrylated.
- מניחים בזהירות כיסוי עגול של 15 מ"מ על הטיפה וממתינים 45 דקות לפיפולימר. נתק בעדינות את הכיסוי העליון עם אזמל.
- עבור השכבה העליונה, לערבב בעדינות 93.3 פתרון מלאי μLof עם 1 μL של פתרון HEA מחומצן טרי, 5 μL של חרוזים פלואורסצנטיים (המקביל לשלושה חרוזים למיקרון מרובע עבור חרוזים של 200 ננומטר חרוזים בגודל), 0.5 μL של 1% APS, ו 0.2 μL של TEMED בצינור 1.5 מ"ל. קח 5 μL מהפתרון ו pipette זה טיפה חכם על מרכז השכבה התחתונה כבר פילמור.
- מניחים בעדינות את כיסוי המיקרו-מפטר על הטיפה. המתן 45 דקות ב RT עבור טיפה כדי פולימר. ודא שהצד עם הדוגמת נוגע בטיפת. נתק בעדינות את כיסוי עם אזמל.
- הדבק את כיסויי 24 מ"מ לתחתית לוחות 6 בארות שנקדחו בהתאמה אישית באמצעות דבק סיליקון דו-רכיבים. לאחר 5 דקות, מוסיפים PBS לבארות.
- לאפיין את המודולוס של יאנג של דגימות הידרוג'ל polyacrylamide על ידי מיקרוסקופיה כוח אטומי (AFM).
- הר קצה כדורי cantilever על מחזיק AFM.
- כייל כל cantilever על ידי רכישת עקומת מרחק כוח (3-4 V setpoint) על מצע קשה (למשל, זכוכית או נציץ), להסיק את הרגישות cantilever, לסגת מפני השטח, ולבצע מנגינה תרמית כדי לקבל קבוע הקפיץ שלהם.
- מקם את cantilevers מכויל מעל מדגם הידרוג'ל ולרכוש עקומות כוח במאגר PBS, באמצעות הפרמטרים הבאים: 20-30 nN נקודת כוח, גישה 5 או 10 מיקרומטר / s ומהירות נסיגה, גודל רמפה 5 מיקרומטר.
הערה: מיקרוסקופ אופטי הפוך, המצויד במטרה 40x אוויר ומסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שימש להדמיה ולמטרה של אזורים ECM-micropatterned בתוך דגימות הידרוג'ל PA. - התווה את הכוח הנרכש לעומת עקומות מרחק עם תוכנת הניתוח של AFM.
- מצא את נקודת המגע והמר את העקומות של כוח לעומת מרחק לכוח לעומת עקומות כניסה.
- התאם את חלק הכניסה של העקומה לדגם הרץ (או מודל מכניקה מתאים בפונקציה של גיאומטריית הקצה), באמצעות יחס פואסון בין 0.2 ל- 0.5.
4. שחרור מקומי של כוחות המתיחה של התא על ידי תאורת לייזר UV-A (LUVI-TFM)
הערה: לייזר UV-A מוחל לשחרר כוחות המתיחה בתאים המותאמים לשפות אחרים באזורים מוגדרים של הידרוג'ל. לייזר UV-A (כלומר, λ = לייזר מצב מוצק 375 ננומטר, <15 mW) הוא לייזר 3B בכיתה. קרן הלייזר הלא מסולסכת מסוכנת לעיניים ולעתים קרובות לעור. אור וקרינה משתקפים ומפוזורים יכולים להיות מסוכנים. יתר על כן, קרינת UV עלולה לגרום לסרטן העור. עבודה עם מכשירים מותרת רק לאחר הצגת בטיחות מקציני הבטיחות בלייזר.
- שאפו את PBS מהבארות.
- זרע 3 x 106 תאים לכל צלחת 6-באר במדיום צמיחה. עבור פיברובלסטים, השתמשו במדיום הנשר המעודכן (DMEM) של דולבק גבוה המכיל L-גלוטמין בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. לדגור על התאים בלילה ב 37 °C /5% CO2. יש לשטוף דגימות כדי להסיר תאים צפים לפני הפעלת מיקרוסקופיה.
- הפעל את תא הדגירה המיקרוסקופי ואספקת הגז כדי להשיג טמפרטורה של 37 °C (5° C) ואטמוספירת CO2 של 5%.
- הפעל את המיקרוסקופ ואת מודול דפוס הלייזר. במידת הצורך, כייל מחדש את לייזר UV-A על מטרת האוויר 20x באמצעות תוכנת לאונרדו. מניחים את צלחת 6-באר בהתאמה אישית עם הדגימות על הבמה. התאם את המיקוד על פני השטח של הרשות הפלסטינית.
- הגדר את תבנית התאורה וסמן את התאים בעלי עניין. להתמקד מחדש על פני השטח של הידרוג'ל. השג את התמונה של התאים בערוץ ברייטפילד. עבור לערוץ Cy5 (מסנן אדום רחוק, עירור של 650 ננומטר, פליטה של 670 ננומטר) וצלם תמונה של חרוזים במצב המעוות.
- עבור לערוץ הלייזר. הפעל את הלייזר במשך 3 דקות. במערך המסוים שלנו, זה התאים למנה קלה של 6,000 mJ / mm2.
- עבור לערוץ Cy5 ורכוש תמונה של החרוזים במצב לא מעוצב.
הערה: לניסוי באמצעות פיברובלסטים עובריים של עכבר, המתן 15 דקות לאחר החשיפה כדי לתעד את התמונה של הפניה/לא מעוצבת (עיין בסעיף תוצאות מייצגות ). זה עשוי להיות שונה עבור סוג אחר של תאים. חזור שוב על שלבים 4.5-4.7 עבור תאים אחרים בעלי עניין. - כדי למדוד את הלחץ החמצוני הגבוה לאחר תאורת UV-A, השתמש ריאגנט זמין מסחרית (CellRox). CellRox אינו פלואורסצנטי במצב מופחת, וכאשר הוא מחומצן על ידי מינים חמצן תגובתי, פלואורסים עם פליטה מקסימלית של ~ 665 ננומטר.
- על פי הפרוטוקול שסופק, להוסיף 5 ריאגנט μM למדיית ההדמיה ודגור במשך 30 דקות ב 37 °C /5% CO2. לאחר מכן, לשטוף את התאים 3x עם PBS חם 1x ולהחליף את מדיית ההדמיה. הקלט את אות Cy5 על ידי הדמיית פלואורסצנטיות לפני ואחרי תאורת UV-A באמצעות חשיפה דומה לאור.
5. עיבוד תמונה, ולוצימיטריה של תמונת חלקיקים וחישוב כוחות המתיחה
הערה: כוחות המתיחה של התא נרשמים על ידי ניתוח תזוזה של חרוזים פלואורסצנטיים ומחושבים באמצעות כלי ניתוח תמונה המבוססים על ולוצימיטריה של תמונת חלקיקים.
- תמונות חרוזים פלואורסצנטיות פתוחות, לפני (כלומר, מעוותות) ואחרי לייזר (כלומר, לא מעוצב) באמצעות פיג'י. מיזוג שתי תמונות כערימה אחת (תמונה | ערימות | תמונות לערימה).
- תקן סחיפה לרוחב בין שתי התמונות באמצעות תוסף StackReg (P. Thévenaz, המכון הפדרלי השוויצרי ללוזאן). שינוי תמונות ל- 8 סיביות (תמונה | הקלד | 8 סיביות) וקנה מידה מחדש ל- 1024 x 1024 פיקס (תמונה | קנה מידה). שמור כרצף תמונות (תבנית TIFF) עם תמונת הייחוס תמיד בהתחלה.
- השג את שדה וקטור ההעתקה באמצעות טכניקת מתאם צולב19 משדה PIV כפי שיושם בפרוייקט OpenPIV.
- ודאו שהתמונה הרגועה (הלא מעוצבת) והתמונה המעוותת מכוסים בחלונות חיפוש בגודל wR וב-wD בפיקסלים. עבור כל חלון חיפוש, הגדר פונקציית מתאם צולב באמצעות הנוסחה הבאה:
כאן, R(i,j) ו- D(i,j) מתארים את שדות העוצמה של שתי התמונות שנחתך לחלון החיפוש שנבחר ולאחר מכן משוקף במראה.
ולתאר 
את הערך הממוצע שלהם. גדלי החלונות נבחרים להיות wR = 32 ו- wD = 32 וחפיפה של 70% משמשת בין חלונות החיפוש הסמוכים. - עבור כל חלון חיפוש, קבעו וקטור
תזוזה הממטב את פונקציית המתאם הצולב ומוקצים למיקום המרכזי של חלון החיפוש. דיוק תת-פיקסל מתקבל באמצעות התאמה גאוסית סביב אזור מקסימה כמתואר20. - מצא והסר וקטורים של תזוזה רב-משמעית. וקטורים של תזוזה המתאימים לחלונות חיפוש שבהם היחס בין שני מקסימום מקומי הגבוה ביותר של פונקציית המתאם הצולב מתחת לסף של 1.5 נחשבים לדו-משמעיים21.
- בטל וקטורים של תזוזה שנכשלים בבדיקה החציונית המנורמלת עבור סף שיורית של 1.522.
- (אופציונלי) תקן את הסחף לרוחב הנותר על-ידי חיסור וקטור
קבוע מכל ההעתקות. פעולה זו נעשית מכיוון שההעתקה באזור נבחר הרחק מהתא נעלמת. - אינטרפולציה של שדה וקטור ההעתקה המתקבל לרשת רגילה עם מרווח של 4 px של תמונות הקלט באמצעות אינטרפולציה פולינומית מעוקב. נקודות נתונים חסרות מתמלאות באמצעות אקסטרפולציה חלקה של סיביות. וקטור תזוזה בפיקסלים קשור לעיוות מקומי לפי יחס הפיקסלים של התמונה (0.33 מיקרומטר/px בעדשת אוויר של פי 20).
- (אופציונלי) רפד מראה את התמונה כדי להפחית צלצולים חפצים בניתוח הבא.
- הכפל את שדה העיוות בפונקציית חלון Tukey כדי לבטל את אפקט הקצה עקב תיקון הסחף, עם פרמטר של 0.2-0.3. בניסוי זה, האזור micropatterned אשר נמצא במרכז FOV הוא עניין.
- ודאו שהתמונה הרגועה (הלא מעוצבת) והתמונה המעוותת מכוסים בחלונות חיפוש בגודל wR וב-wD בפיקסלים. עבור כל חלון חיפוש, הגדר פונקציית מתאם צולב באמצעות הנוסחה הבאה:
- לשחזר את המתיחה באמצעות ציטומטריית המתיחה פורייה הסדירה (FTTC)18. כהסדרה אנו משתמשים בבחירה הסבירה הפשוטה ביותר, כלומר, הסדרת Tikhonov (L2) מסדר 023,24,25. פרמטר הסדרה אופטימלי λ נבחר כך שהוא ממזער את הפונקציה אימות הצלב כללי (GCV) המוגדרת על ידי 26:
כאן τλ הוא וקטור מוערם המכיל את רכיבי x ו- y של שדה המתיחה המשוחזר עבור הערך הנתון של λ עבור כל מצבי הדגימה של פורייה ו- G הוא שדות המתיחה של האופרטור הליניארי לשדה ההעתקה המתאים שלהם, כהגדרתו עבור FTTC. הסכום פועל על פני רכיבים וקטוריים. ui הם רכיבי x ו- y של שדה ההעתקה עבור כל מצבי הדגימה של פורייה. GCV נמצא בשימוש נרחב בתחום הבעיות ההופכיות שאינן מוצגות כראוי ומהווה חלופה טובה לקריטריון עקומת L המשמש לעתים קרובות ב- TFM. מסנן Lanzcos משמש להפחתת חפצים מציג בשל שטח התדר המוגבל ואת דגימת שדה ההעתקה. חישוב המתיחה תלוי במודולוס של הצעירים של הרשות הפלסטינית (למשל, 11.3 kPa) וביחס של פואסון (למשל, עבור הרשות הפלסטינית בטווח שבין 0.2 ל-0.5 בהתאם לריכוז ההצלבה).
ולתאר 
את הערך הממוצע שלהם. גדלי החלונות נבחרים להיות wR = 32 ו- wD = 32 וחפיפה של 70% משמשת בין חלונות החיפוש הסמוכים.
תזוזה הממטב את פונקציית המתאם הצולב ומוקצים למיקום המרכזי של חלון החיפוש. דיוק תת-פיקסל מתקבל באמצעות התאמה גאוסית סביב אזור מקסימה כמתואר20.
קבוע מכל ההעתקות. פעולה זו נעשית מכיוון שההעתקה באזור נבחר הרחק מהתא נעלמת.
Representative Results
ההידרולג'לים של הרשות הפלסטינית היו פולימריים על כיסויי זכוכית methacrylated, המציגים קבוצות תגובתיות עבור הצמדה covalent של הרשות הפלסטינית. בדרך זו, בעת הצבת ההידרוג'ל בתמיסה מימית, נמנעה התנתקותם מהמצע (איור 1A-D). כדי להשיג צפיפות גבוהה של סמנים פידוקיאליים ליד פני השטח ההידרוג'ל, פיתחנו את ההכנה של הידרוג'ל PA דו שכבתי. השכבה התחתונה, ללא חרוזי פלורסנט, הייתה פולימר על כיסוי methacrylated. לאחר מכן, שכבה נוספת המכילה חרוזים הייתה פילמור על גבי השכבה התחתונה (איור 1E-H), החלפת הצורך משקעים, אשר משמש לעתים קרובות כדי להשיג התפלגות חרוזים במישור מוקד אחד ולהגדיל את צפיפות החרוזים. כדי להשיג שליטה על צורת התא במהלך מדידות TFM, ייצרנו הידרוג'לים PA מיקרו-מרופטים באמצעות העברה ישירה של מיקרו-מבנים בדוגמת פיברונקטין מכיסוי זכוכית ל- PA הפולימרי מראש (איור 1F-F'). התוספת של 1% crosslinker לא קונבנציונאלי (HEA מחומצן) בתמיסת שכבת הידרוג'ל העליון מספק קבוצות אלדהיד כי covalently לאגד קבוצות אמין של פיברונקטין.
הכנו הידרוג'לים PA, אשר הם כ 60 מיקרומטר בעובי וחרוזים פלואורסצנטיים מוגבלים בשכבה העליונה קרוב למשטח הידרוג'ל. סוג זה של הידרוג'ל הוא מצע מתאים להדמיית מתיחה תאית עם מיקרוסקופים הפוכים ועבה מספיק (עובי מינימלי לביצוע TFM דווח להיות 20-30 מיקרומטר)18 כדי למנוע כל השפעה של מצע הזכוכית. לוקליזציה של החרוזים הפלואורסצנטיים פוצצתה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1I). כדי לדמיין את העברת החלבון על ההידרוג'ל, השתמשנו בחלבוני ECM עם תווית פלואורסצנטית ודמיינו אותם באמצעות מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית (איור 1J). הכנו עיגולים מיקרו-מרופטים של פיברונקטין בקוטר של 100 מיקרומטר (צד שמאל) ו-50 מיקרומטר (צד ימין) כדי לאפשר הידבקות של קבוצות תאים או תאים בודדים, כפי שמוצג בשכבת-על של תמונות שדה בהירות של תאים דבקים, וחרוזים פיודוציונליים ומיקרו-פטרנים פיברונקטין. במדגם אחר, תגובת ההדבקה של תאים בודדים לפיברונקטין מיקרו-מרופטים אומתה על ידי מיקרוסקופיה חיסונית עקיפה כדי לדמות לוקליזציה של חלבוני הידבקות מוקד כגון פקסילין (איור 1K).
הן ציפוי חלבון ECM והן נוקשות הידרוג'ל הם פרמטרים חיוניים להידבקות תאים26. כדי לאפיין את התכונות המכניות של הידרוג'ל PA שלנו, ביצענו ניסויי nanoindentation על ידי AFM27, יחד עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות. מצעים הידרוג'ל של שלוש נוקשויות שונות הוכנו ונבדקו עם ההתקנה שלנו (איור 2 ושולחן 1). קנטילנים בצורת כדור AFM ניגשו באופן מחזורי וחזרו בהם מהידרוג'לים ופיברינוגן לא מלוטשים שהוצמדו לאזורים עם מיקרו-שטחים של Alexa488, תוך תיעוד עקומות מרחק כוח. לאחר מכן, הערכת נקודת מגע ויישום מודל הרץ אפשרו לנו להעריך את המודולוס של יאנג (E) של כל מדגם. מיקרו-מפטרנינג ECM לא שינה את המודולוס של הצעיר, שנותר דומה לכל אחד מההידרוג'לים של הרשות הפלסטינית שלא נופחו.
כדי למדוד כוחות אחיזה המופעלים על ידי תאים חסידים על המצע, פיתחנו מערך ניסיוני ל- TFM מבוסס התייחסות המבוצע על מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי רחב היקף המצויד במודול לייזר UV קרוב (UV-A 6000 mJ/mm2) לשחרור מתיחות תאים (איור 3A). כמו תאורת קרן לייזר יכול להיות נשלט spatio-זמנית, לא רק שניתן לחשוף באופן סלקטיבי תא יחיד או אשכול תא עם מינון לייזר גבוה, אלא גם וחשוב מכך, שלב הביניים המפריע של הסרת התאים מן המדגם כולו באמצעות אנזים עיכול כמו טריפסין כבר לא הכרחי. תאים מאירים עם מינון לייזר כה גבוה גרמו ללחץ חמצוני גבוה המוביל למוות של תאים (איור 3B). מוות תאי הניב שחרור של משיכות מהמצע, כפי שמעיד עקירת החרוזים (מאויר באיור 3A). שילבנו את תאורת UV-A עם מודול דפוס אור כדי להאיר באופן סלקטיבי אזורים בגודל מיקרון של הידרוג'לים של הרשות הפלסטינית (איור 3B-C). בדרך זו ניתן לשחרר את המתיחה של אשכולות תאים זעירים (איור 3C,F) או תאים בודדים (איור 3B). חשוב לציין, בזמננו, המאפיינים המכניים של ההידרוג'לים בדוגמת ECM לא הושפעו באופן משמעותי מחשיפה לקרינת UV (איור 2C). עלייה בלחץ חמצוני מוצגת באיור 3D,E. כוחות המתיחה שוחזרו באמצעות FTTC סדיר עם פרמטר הסדרה שנבחר על-ידי אימות צולב כללי (איור 3B,F). שחרור הכוחות לתאים בודדים התרחש במשך תקופה של 15 דקות, והתוצאה של ה-LUVI-TFM דומה ל-TFM המבוסס על טריפסין (איור 3G-H).
איור 1: ערכה של הכנת פיברונקטין-מצע בדוגמת TFM. (A) הפתרון לשכבה התחתונה מוזרם על משטח מתקרילי. (ב) כיסוי נקי קטן יותר ממוקם בזהירות על הטיפה. (ג) זמן הג'ל הוא 45 דקות. (D) כיסוי העליון מנותק. השכבה התחתונה מוכנה. (ה) הפתרון לשכבה העליונה הוא pipetted על הידרוג'ל. (ו) כיסוי הדוגמת ממוקם בזהירות על הטיפה. (פ') המיקרו-מפטרנג של חלבוני דבק על זכוכית מיוצר על ידי ללא מסכה ליד ליטוגרפיה UV, ולאחר מכן מועבר מזכוכית הידרוג'ל PA. קבוצות האמין החופשיות של חלבוני דבק, למשל פיברונקטין, נקשרות באופן קוולנטי לקבוצות אלדהיד על פני השטח של הרשות הפלסטינית. (ז) זמן הג'ל הוא 45 דקות. (ח) כיסוי העליון מנותק. הידרוג'ל PA בדוגמת מוכן. (I) ייצוג תלת מימדי של מיקרוגרף xyz קונפוקל המציג צפיפות גבוהה של חרוזים פיודואליים ליד פני השטח. (J) מיקרוגרף של פיברונקטין (מגנטה) בעל תווית פלואורסצנטית על פני השטח של הרשות הפלסטינית עם חרוזים פלואורסצנטיים משובצים (ירוק), עם תמונת שדה בהירה של תאים. (K) הדמיה מיקרוסקופית חיסונית עקיפה של תא בודד ההצמדה למיקרופנטרן פיברונקטין בצורת עיגול (100 מיקרומטר). גרעין (כחול), פקסילין (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אפיון תכונות מכניות לדוגמה על ידי AFM. (A) מערך ניסיוני ננו-יתדנטיציה AFM. cantilever בצורת כדור משמש כדי לחקור מיקרופטרנים ECM לפני או אחרי טיפול UV, ואת האזורים שאינם בדוגמת PA כפול שכבות (5% אקרילאמיד, 0.3% ביס-אקרילאמיד) אזורים. (B) כוח מייצג לעומת עקומת כניסה עבור מיקרו-פלטרן ECM (שחור). הרץ מתאים (אדום) משמש לחישוב המודולוס של יאנג (E) של המדגם. (C) מדידות מכניות עבור אזורי PA דו-שכבתיים שאינם בדוגמת (ללא ECM), מיקרו-פלטרן ECM ומיקרו-פטרן ECM לאחר חשיפה ל- UV-A. הברים מראים פירושו ± S.E. .M . (בראון-פורסייט וולש ANOVA מבחן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. תאורת UV-A מקומית TFM (LUVI-TFM) מאפשרת מדידות כוח משיכה מקומיות בתוך שדה ראייה גדול. (A) תוכנית של TFM תאורת UV-A מקומית. תאים מטופלים עם מינון גבוה של לייזר UV-A כדי לקבל את התמונה לא מעוצבת (התייחסות). (B) תמונת הבהירה של תא בודד לפני תאורת לייזר UV-A. אמצע: תמונת הבהירות של תא בודד לאחר תאורת לייזר UV-A. מימין: כוח משיכה של MEF יחיד דבק הידרוג'ל PA מצופה פיברונקטין (E = 5.74 kPa) מואר עם קרן אור UV בקוטר 50 מיקרומטר (קו מקווקו אדום). (ג) משמאל: הקלטה של כוחות המתיחה של מקבץ של פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEF) הנצמדים לפיברונקטין מיקרו-מרופט (מעגל, קוטר 100 מיקרומטר). האשכול הואר עם קרן אור UV בקוטר 200 מיקרומטר (קו מקווקו אדום). מימין: הקלטה של כוחות המתיחה של מקבץ של פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEF) הנצמדים לפיברונקטין מיקרו-מרופט (מעגל, קוטר 300 מיקרומטר). האשכול הואר עם קרן אור UV בקוטר 300 מיקרומטר (קו מקווקו אדום). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (D,E) עלייה בלחץ חמצוני בתאים המצוינת על ידי עוצמת האות Cy5 מוגברת לאחר מינון לייזר UV-A גבוה מזוהה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הלחץ החמצוני מוביל למוות תאי. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (ו) משמאל: מפת חום הלחץ מאשכול של פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEF) הנצמדים לפיברונקטין מיקרו-מרופט (מעגל, קוטר 100 מיקרומטר). מימין: מפת חום הלחץ מאשכול של פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEF) הנצמדים לפיברונקטין מיקרו-מרופט (עיגול, קוטר 300 מיקרומטר). (G) תאי MEF דבק 100 מיקרופנטין מיקרופנטין מיקרופנטין לאט לשחרר את המתיחה שלהם לאחר חשיפה UV-A. שחרור מלא מושגת לאחר 15 דקות (תמונת הייחוס צולמה לאחר 15 דקות לאחר החשיפה). (H) השוואה עם טריפסין קונבנציונאלי מבוסס TFM עבור תאי MEF דבק 300 מיקרומטר בדוגמת פיברונקטין. התוצאה של תאורת UV-A (6,000 mJ / mm2) ואחריו 15 דקות המתנה שונה באופן לא משמעותי מטיפול טריפסין קונבנציונלי (כלומר, 0.05% במשך 20 דקות). הסורגים מראים ש-S.E.M. (מבחן t-t דו-זנבי של סטודנט, ****P < 0.0001, * P < 0.05, ns P ≤0.5). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| אקרילאמיד (%) | ביס-אקרילאמיד (%) | אקרילאמיד מפתרון מלאי של 40% (ml) | ביס-אקרילאמיד מפתרון מניות של 2% (ml) | מים (מיליליטר) | מודולוס יאנג (kPa) |
| 4 | 0.1 | 1 | 0.5 | 8.5 | 5,74 ± 0,53 |
| 5 | 0.15 | 1.25 | 0.75 | 8 | 9,69 ± 0,68 |
| 5 | 0.3 | 1.25 | 1.5 | 7.25 | 11,33 ± 1,06 |
טבלה 1: תערובות תמיסת מלאי הידרוג'ל וגמישות וכתוצאה מכך
כל הנתונים מופקדים במאגר נתוני הגישה הפתוחה של חברת מקס פלאנק (אדמונד) וניתן לגשת אליהם באמצעות הכתובת הבאה: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הכנת הידרוג'ל PA micropa מרופטים המכילים חרוזי פלואורסצנטיים, המשמשים כסמנים פיודוקסיים למחקרי TFM. הגישה שלנו מבוססת על שלושה שלבים: 1) הכנת הידרוג'לים דו-שכבתיים של הרשות הפלסטינית; 2) מיקרו-מפטרים של חלבוני ECM והעברתם למשטח ההידרוג'ל; 3) שימוש באור כמעט UV בדוגמת TFM. ההתקנה הניסיונית לניתוח מתיחה של תאים למצע דורשת שימוש בחומרים אלסטיים ליניאריים עם ערכי נוקשות ידועים כדי לחשב את הכוחות הקשורים לעקירה של החרוזים הפלואורסצנטיים26. הידרוג'לים PA קלים להכנה, הנוקשות יכולה להיות מכוונת בקלות, והם משמשים בדרך כלל עבור חישת קשיחות ו TFM18,28. עם זאת, כדי להשיג זמני פילמור לשחזור ופילינג הומוגני של ההידרוג'ל כולו, יש לשים לב לאחסון תנאים וזמן עבור ריאגנטים, למשל, APS צריך להישמר חיטוי כדי למנוע לאבד את פעילותה; יש להגן על TEMED מפני אור ישיר. השימוש ב- HEA מחומצן מאפשר כריכה קוולנטית של חלבוני מטריצה על פני השטח ההידרוג'ל, אשר עשוי להיות יתרון כדי להשיג היווצרות של שכבת חלבון מלאה ויציבה. פתרון HEA מחומצן צריך להיות מוכן טרי בכל פעם הידרוג'ל PA מפוברקים. הידרוג'ל PA הדו שכבתי מציע שלושה יתרונות עיקריים: 1) הוא מספק דרך חלופית כדי להתרבות חלוקה הומוגנית של חרוזים fiducial ליד פני השטח הידרוג'ל, ללא צורך להפוך את הג'ל דק מאוד (כלומר, <20 מיקרומטר). שליטה על עובי הידרוג'ל חיונית להשגת מדידות מדויקות עם TFM. כאשר המצע האלסטי דק מדי, תאים דבקים חזקים כגון פיברובלסטים עשויים לחוש ולהגיב באופן מכני למצע הזכוכית הנוקשה שבבסיסו29,30. הידרוג'לים עבים הופכים את רכישת התמונה לשחזור הכוח למאתגרת יותר. יתר על כן, מיקרוסקופים רבים לא יהיה מספיק מקום כדי להכיל אותם, בהתחשב בעובי הנוסף של מצע הזכוכית המשמש לחיבור הידרוג'ל, אלא אם כן שקופיות מיקרוסקופיה ultrathin משמשים. 2) בהידרוג'ל PA הדו-שכבתי, ההתפלגות ההומוגנית של חרוזים פיודו-ריאליים ליד פני השטח של הידרוג'ל הרשות הפלסטינית מושגת ללא שימוש בצנטריפוגה, אלא בדגורה פשוטה של כמויות מדויקות של פתרונות הידרוג'ל וחרוזים פלואורסצנטיים. צפיפות חרוזים גבוהה היא יתרון משמעותי בעת ביצוע ניתוח PIV מכיוון שהיא מגבירה את הרזולוציה של כוחות המתיחה ואת יחס האות לרעש ללא צורך במיקרוסקופיה קונפוקלית. 3) שילוב חרוזים בשכבה דקה הקרובה לממשק החומר התאי מאפשר הדמיה של כוחות המתיחה עם מיקרוסקופים אפיפלואורסצנטיים כמו גם מיקרוסקופים קונפוקליים. בעת הכנת הידרוג'ל, המשתמש צריך לוודא כי הוא דבק בחוזקה זכוכית התחתונה לפני שתמשיך עם השלבים הבאים של הפרוטוקול. אנו ממליצים לעקוב אחר זמן הדגירה המצוין עבור פילמור של שכבות הידרוג'ל, כפי שהוא עלול להיות קשה להסיר את הזכוכית על גבי פני השטח מבלי לפגוע פני השטח הידרוג'ל.
הטכניקות הידועות ביותר למדידת תכונות אלסטיות הן AFM, ננו-אינפנטציה, בדיקות מתיחה ורומטריה. עם זאת, nanoindentation מגרם זנים גבוהים מאוד על החומרים שיכולים להשפיע על קביעת תכונות אלסטיות. בדיקות מתיחה ורומטריה לעומת זאת הן טכניקות מדידה מקרוסקופיות, בעוד תאים אינטראקציה בקנה מידה מיקרוסקופי31,32. AFM מאפשר מדידות בקנה מידה מיקרו עם זנים מופחתים בתנאים פיזיולוגיים. המהימנות של מדידות AFM עלולה להיות מושפעת לרעה אם חסרים פרטים ניסיוניים (למשל, כוח כניסה ומהירות) או שלא נרשמים נתונים מספיקים27. Huth et al. מתאר אלגוריתם לחילוץ המודולי של יאנג מנתוני AFM, המדגיש שמירה על פרטי מדידה קבועים27. אלגוריתם זה מציע קביעה מדויקת ואמינה של המודולי של יאנג ושימש לניסויים שלנו. בנוסף, מדדנו עקומות רבות על דגימות מפוברקות בימים שונים וקיבלנו תוצאות דומות מאוד (וריאציה של ערכים ממוצעים של כ 1-2 kPa). זה מראה כי נוקשות של הג'לים שלנו ניתן לחזות באופן אמין.
בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במודול photopatterning כדי ליצור אזורים micropatterned על זכוכית, אשר מועברים לאחר מכן למשטחי הידרוג'ל. המיקרו-מפטרציה המוצגת בפרוטוקול זה מבוססת על ליטוגרפיה ללא מסכה ללא מסכה (λ = 375 ננומטר)7. DMD מורכב ממספר רב של מיקרו-מירזורים על שבב. פיקסל בודד מתאים למיקרו-שיקוף יחיד. קובץ תמונת התבנית המפוקסל ממחשב מוקרן באמצעות DMD ומתמקד במשטח באמצעות עדשה אובייקטיבית. עבור מיקרו-מפטרנינג של חלבונים, אור הלייזר הממוקד משמש לבקעת מברשות פולימר דוחות בעזרת פוטו-סיניטור. לאחר מכן, האזורים החשופים מלאים בחלבוני ECM. שיטת אבלציה ללא מסכה זו מציעה גמישות רבה בעיצוב דפוסים חדשים, שכן היא אינה מסתמכת על שימוש במסכת צילום. עיצוב ויישום דפוס הוא קל מאוד כפי שהוא לוקח רק כמה דקות באמצעות תוכנה חופשית כמו Inkscape. עם זאת, מספר התבניות והדוגמה המיוצרים בפרק זמן קצר הוא חיסרון משמעותי, שכן שיטה זו יכולה לשמש רק כדי ליצור תבנית מצע יחיד בכל פעם. מודול photopatterning משתמש במקור לייזר מצב מוצק UV קרוב הפולט כמה מילי-וואט. קרן הלייזר הלא מסולסכת מסוכנת לעיניים ולעור. אור וקרינה משתקפים ומפוזורים יכולים גם להיות מסוכנים. הטיפול חייב להיות מלווה בהוראה בטיחותית של קציני לייזר. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול בעת שימוש במודול photopatterning הוא להבטיח כי במהלך micropatterning ואת אבלציה הלייזר מתמקד כראוי על פני השטח. מינון תאורה עקבי (עוצמה כפולה בזמן) של אור UV במהלך דפוס תלוי באופן שבו הלייזר מתמקד על פני השטח. עוצמה חלשה על פני השטח עקב מיקוד לקוי עלולה לגרום לכישלון של העברת ECM למשטח ההידרוג'ל וכתוצאה מכך אף תאים לא נקשרים להידרוג'ל.
בניסויי TFM, לאחר הדמיה ראשונית של תאים חסידיים והסמנים הפידוציליים, תאים משתחררים מההידרוג'ל של הרשות הפלסטינית על ידי טיפול טריפסין כדי לתעד את מצבם הרגוע. החיסרון בביצוע שלב זה הוא טיפול במדגם בשלב המיקרוסקופיה. ללא תא זלוף, פתיחת המכסה של המנה, שאיפה לפתרון הטריפסין הבינוני, השטיפה והצינורות מהווים אתגר למתחילים ולמשתמשים מנוסים. למעשה, הליכים אלה הם מקור עיקרי של הסחף בצירי xyz , וכתוצאה מכך אובדן מיקום ומיקוד. פרוטוקול התאורה המקומי-UV שלנו הופך את TFM לטכניקה נגישה יותר למתחילים. יש לציין כי השתמשנו במודול photopatterning ללא מסכה המבוסס על מיקרוסקופיה, אך באופן עקרוני ניתן להשתמש בכל מערכת תאורת UV-A, בסופו של דבר בשילוב עם מסכה כדי להגן על אזורים של המצעים, שבהם אין להקליט כוחות המתיחה של התא. חשיפת תאים עם מינון משמעותי של אור נראה באורך גל נמוך (למשל, האור הסגול שמרגש את פליטת DAPI) תוביל להגברת עקה חמצונית, אשר עלולה לגרום פוטוטוקסיות ומוות תאים. לכן, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת אפילו במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי ללא מודול לייזר UV. עם זאת, כמו האינטנסיביות היא הרבה יותר חלשה, זה יהיה הרבה יותר קל להשיג TFM עם הטיפול אנזימטי במקרה זה.
עם LUVI-TFM ניתן להשתמש באותה דגימה עבור מספר מדידות בגלל הניתוק המקומי של תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים. עם זאת, יש לשים לב לבחירת התאים כדי לנתק, כדי למנוע הקלטת כוחות מתאים שכנים. לכן, עבור מדידות תא יחיד בהיעדר מיקרו-פטרנים, יש להימנע מאזורים צפופים; עבור מדידות על תאים מיקרו-מרופדים יחידים, יש לעצב את התבניות כך שהמרחק בין מבנים בודדים הוא לפחות כפול מהקוטר של האזור המעוצב. אנו ממליצים גם לא להשתמש בתאים מתבניות סמוכות ברצף, אלא לדגום אותם מאזורים רחוקים על המצע. המדידה שלנו מתבצעת היטב על מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד בתכונת בקרת מיקוד ועדשת NA אווירית 40 x = 0.9, כאשר מרחק העבודה של העדשה ארוך מספיק והתנועה המהירה מבאר אחת לאחרת היא מאוד טונה. הניתוק הממוקד של תאים עבור יישומי TFM יעיל למדידת כוח תאי של תא בודד או של אשכול תאים קטן שלם (לדוגמה, קוטר של עד 300 מיקרומטר). באמצעות ההתקנה שלנו, ראינו עיגול תאים וניתוק לטיפול UV של תאים בודדים (איור 3A), בעוד ניתוק לעתים רחוקות התרחש עבור אשכולות תאים קטנים. זה עלול להוביל להמעיט בערכם של כוחות המתיחה של התאים. עבור אשכולות תאים גדולים יותר, מומלץ לנתק אנזימטית, מכיוון שהמשתמשים צריכים להשתמש במטרה אווירית של פי 20 כדי לדמיין את האשכול כולו ויש צורך בתכונת בקרת מיקוד. מכיוון שעומק המיקוד של עדשת האוויר 20x ארוך בהרבה, הטיפול לא יהיה קריטי כמו יעד ההגדלה הגבוה יותר. המשתמש צריך לוודא כי המוקד מוגדר כראוי עבור אבלציה של תאים, שכן מינון התאורה תלויה במיקוד הלייזר על פני השטח. בעוד אנו מודעים למגבלות האפשריות בשימוש LUVI-TFM בקולקטיבים תאים בגלל אינטראקציות מכניות אפשריות עם תאים לא מטופלים שכנים, היבט זה יכול למעשה להתברר שימושי עבור מחקרים על המכניקה של שחול תאים ממוקדים, למשל, מן monolayers אפיתל.
לסיכום, עם גישת TFM שלנו בשילוב עם שחרור המושרה אור של תאים micropatterned, אנו מספקים פרוטוקול חזק ותפוקה גבוהה כדי למדוד כוחות הידבקות תאים. ניתן לנצל עוד יותר את הרבגוניות של שיטה זו באמצעות מיקרוסקופיה ומערך הדמיה שמטרתם לשפר את הרזולוציה והרגישות.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לגברת רבקה אלברדו על התמיכה בהפקת הווידאו של הפרוטוקול ולמר סטיבן קזל על ביקורת בונה על כתב היד. אנו מודים לעמיתים מהמחלקה לביופיזיקה סלולרית, מכון מקס פלנק למחקר רפואי על הדיונים המועילים. התמיכה הכספית ממקס-פלאנק-גסלצ'אפט לאי.איי.C.א. ודויטשה פורשונגסגמיינסצ'אפט (DFG SFB1129, פרוג'קטאנומר 240245660, P15 ל- E.A.A.C.A. ו- P4 לארה"ב; DFG EXC 2082/1-3907617111 לארה"ב) הוא גם מוכר מאוד. ג'יי.B מודה לקרן קארל זייס על התמיכה הכספית. E.A.C.-A., C.S. וארה"ב מכירים במימון באמצעות "חומר החיים לחיים" של בית הספר מקס פלאנק, הנתמך על ידי משרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF). C.S. נתמך על ידי מועצת המחקר האירופית (איחוד גרנט PHOTOMECH, מס '101001797).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | #440159 | Sigma Aldrich | |
| Acetic acid | #33209 | Honeywell | |
| Acrylamide 40 % | #1610140 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| AFM cantilever | #CP-CONT-BSG-A-G | NanoAndMore | 5 μm spherical tip |
| AFM system | #NanoWizard3 | JPK | Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter |
| Ammonium persulfate | #A3678 | Sigma | |
| Bis-acrylamide 2 % | #1610142 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| Camera sCMOS | #C11440-42U30 | Hamamatsu | |
| Camera sCMOS | #ANDORZYLA4.2 | Oxford Instrument | |
| CellRox | #C10422 | Thermo Fisher | |
| Custom incubator chamber | EMBLEM | ||
| Dental glue | #1300 100 | Picodent | |
| DMEM | #41965 | Thermo Fisher | |
| Epifluorescence microscope | #Eclipse Ti2E | Nikon | |
| Epifluorescence microscope | #Axiovert200 | Zeiss | |
| Ethanol | #9065.3 | Carl Roth | |
| FBS South America | #S181T | Thermo Fisher | |
| Fibrinogen | #F13191 | Invitrogen | Alexa488 conjugate |
| Fibronectin | #F1141 | Sigma | |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8805 | Invitrogen | Carboxylated (365/415) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8848 | Invitrogen | Carboxylated (505/515) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8810 | Invitrogen | Carboxylated (580/605) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8807 | Invitrogen | Carboxylated (660/680) |
| Glass coverslip 15 mm round | #41001115 | Assistent | |
| Glass coverslip 24 mm round | #41001124 | Assistent | |
| Microscope Objective | #MRH08230 | Nikon | 20x air NA 0.45 |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | #CRL-2991 | ATCC | |
| mPEG-SVA | #MPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | |
| N-Hydroxyethyl acrylamide | #697931 | Aldrich | |
| Plasma cleaner | #100-E | TePla | |
| PLPP gel | #PLPPgel | Alveole | |
| Poly-L-lysine | #P4823 | Sigma Aldrich | |
| Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) | #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) | SuSoS | |
| Sodium(meta) periodate | #S1878 | Sigma Aldrich | |
| TEMED | #17919 | Thermo Scientific | |
| UV Patterning module | #PRIMO | Alveole | |
| UVO cleaner | #342-220 | Jelight |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A. Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors. Cell. 110 (2), 139-142 (2002).
- Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -l, Hosoya, H. Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7 (2006).
- Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
- Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation. Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology. , 133-146 (2010).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. Polyacrylamide hydrogel micropatterning. Methods Cell Biology. 120, 93-116 (2014).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Polacheck, W. J., Chen, C. S. Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools. Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
- Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. Dynamics of force generation by spreading platelets. Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
- Willert, C. E., Gharib, M. Digital particle image velocimetry. Experiments in Fluids. 10, 181-193 (1991).
- Lourenco, L., Krothapalli, A. On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV. Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).
- Adrian, R. J., Westerweel, J. Particle Image Velocimetry. , Cambridge University Press. (2011).
- Westerweel, J., Scarano, F. Universal outlier detection for PIV data. Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).
- Dembo, M., Wang, Y. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Schwarz, U. S., et al. Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization. Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).
- Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package. Computer Physics Communications. 256, 107313 (2020).
- Vedadghavami, A., et al. Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications. Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Oria, R., et al. Force loading explains spatial sensing of ligands by cells. Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Galluzzi, M., et al. Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials. Nat Communications. 9 (1), 3584 (2018).
