Summary
近紫外線リソグラフィーとトラクションフォース顕微鏡を組み合わせて、マイクロパターン化されたヒドロゲル上の細胞力を測定します。単一細胞のターゲット光誘導放出により、同じサンプル上で多数の測定が可能になります。
Abstract
牽引力顕微鏡(TFM)は、細胞力を測定するためにメカノバイオロジーで使用される主な方法です。一般的にこれは、細胞の牽引下で変形する平らなソフト基質(2D-TFM)に付着した細胞に使用されています。TFM は、ポリジメチルシロキサン (PDMS) やポリアクリルアミド (PA) などの線形弾性材料の使用に依存しています。PA上の2D-TFMでは、主に細胞形状と牽引力の大きなばらつきから高スループットを達成するのが難しくなり、標準化が求められております。我々は、2D-TFM研究のために、マイクロパターン化PAヒドロゲルを迅速かつ効率的に製造するためのプロトコルを提示する。マイクロパターンは、細胞外マトリックスタンパク質がマイクロパターン化された領域にのみ結合する近紫外線光を使用したマスクレスフォトリソグラフィーによって最初に作成され、残りの表面は細胞に対して非接着剤のままです。細胞外マトリックスタンパク質のマイクロパターニングは、活性アルデヒド基の存在に起因し、単一細胞または細胞群に対応するために異なる形状の接着領域を生じる。TFM測定では、アクリルアミドとビスアクリルアミドの量を変化させ、埋め込み蛍光ビーズの変位を追跡して、規則化フーリエ変換トラクションサイトメトリー(FTTC)で細胞牽引フィールドを再構築することで、異なる弾性のPAヒドロゲルを使用します。
さらに細胞力の正確な記録を達成するために、我々は、単一細胞または細胞群の定義された領域における細胞牽引を放出するために、制御されたパターン光の用量の使用を記述する。このメソッドをローカル UV 照明牽引力顕微鏡(LUVI-TFM)と呼びます。酵素処理では、すべての細胞が同時にサンプルから切り離され、一方、サンプルの異なる領域にある細胞のLUVI-TFM牽引力を順番に記録することができます。我々は、このプロトコル(i)が基板への制御接着の関数として細胞牽引力を研究し、(ii)同じサンプルからより多くの実験観測を達成することを実証する。
Introduction
細胞外の環境と相互作用する場合、接着細胞は主にインテグリンベースの焦点接着によって媒介される力を発揮し、細胞外マトリックス(ECM)をアクチン細胞骨格に接続します。焦点付着は、フィブロネクチンやコラーゲンのようなECMタンパク質へのインテグリンの結合を中心とするマルチタンパク質集合体です。インテグリンクラスタリングと焦点接着の成長は、機械的に安定した接続の確立のためだけでなく、細胞収縮性の調節のためのRhoA経路を活性化するものを含む他の焦点接着タンパク質の募集のためにも重要です1。ローア依存性のアクチン細胞骨格の収縮性は、細胞が広がり、基礎となるECM上で移動することを可能にし、また、その剛性を感知する2。牽引力の分布は、細胞の広がり領域と形状に強く依存し、どちらもマトリックス特性に依存し、したがって細胞骨格組織に影響を与え、最終的にはマトリックス力学と細胞骨格組織3,4の間に閉じたフィードバックループを形成する。
表面マイクロパターニング技術は、ECM接着タンパク質を提示するミクロンサイズの領域を作成することによって、細胞形状の定義された制御を可能にします。これらの領域のサイズに従って、単一の細胞、またはマイクロパターン5に付着する細胞のグループ。ECMタンパク質は、マイクロコンタクト印刷、フォトパターニング、レーザーパターニング6などの異なるアプローチによってガラス基板上でパターン化することができます。UVライト(λ = 185または375 nm)を表面防汚戦略と組み合わせることで、異なる形状やサイズを設計し、表面エッジの近くに高精度で複数のタンパク質タイプを固定化するための柔軟性を提供します7,8。ポリエチレングリコール(PEG)などのタンパク質忌避剤化学物質でコーティングされた領域は、クロムフォトマスクまたはデジタルミラーデバイス(DMD)ベースのマスクレスリソグラフィーシステムのいずれかで保護されています。マスクのパターンは、ECMタンパク質でパターン化される領域のUV光への暴露を可能にします。ECMタンパク質を用いたヒドロゲル表面のパターニングには、ガラス表面からタンパク質を除去し、パターンに架橋する伝達ステップが必要です。あるいは、柔らかい材料に対するパターニングは、まずフォトマスクを忌避タンパク質でコーティングし、続いて深いUV照明を使用してマスクされていない領域を燃焼させることによって達成することができる。深い紫外線はオゾンを生成し、表面をタンパク質結合のために反応性にするので、マスクされていない領域はECMタンパク質でコーティングされ、最後にゲルはマスクされていない領域の上に直接重合される9,10。
パターン化されたヒドロゲルは、TFMを行うために使用され、細胞材料界面11における細胞力を測定する技術である。2D-TFMでは、1つは、マーカービーズが変形を追跡するために埋め込まれている厚いポリマーフィルムの平らな表面を使用しています12、13、14、15。変位ベクトルを抽出するには、変形のない変形状態と参照画像の2つの画像を組み合わせることが不可欠です。その後、2 つの画像は、画像処理によって相互にマッピングされます。高いマーカー密度では、これは通常、流体力学的流れを再構築するための確立された方法である粒子画像Velocimetry(PIV)で行われます。低マーカー密度および3D-TFMでは、これは通常、実験データセットの特定の特徴を含む粒子追跡ヴェロシメトリー(PTV)で行われます。計算上安価な代替手段の例として、カナデ・ルーカス・トマシ(KLT)アルゴリズム16のようなオプティカルフローがあります。ヒドロゲル基質の場合、蛍光ビーズは通常、材料重合中に高密度で埋め込まれ、酵素剥離時に細胞放出の前後に画像が記録されます。接着性細胞の酵素剥離、例えばトリプシン法により、ヒドロゲル上のすべての細胞からの細胞牽引の同時放出を招き、多数の細胞から詳細な分析を得ることが困難になる。
ここでは、細胞の形状と局在を制御するマイクロパターン化ヒドロゲルを調製するプロトコルと、UVを用いてシーケンス内の牽引力を効率よく測定し、個々の細胞を基板から切り離す方法を提示する。牽引力測定では、蛍光ビーズが最上層にのみ埋め込まれ、密度が高まり、垂直拡散を低減する二重層PAヒドロゲルを製造する技術を紹介します。細胞牽引力のUV媒介放出をマイクロパターニングと組み合わせることで、細胞剥離(例えば、対象領域における他の細胞の接着に影響を与えることなく単一細胞の)に対する空間制御を得ることを可能にする、パターン化された細胞間の十分な距離がある場合。その後、セルラートラクションは、2D-TFM、すなわち、正則化17,18を有するフーリエ変換トラクションサイトメトリー(FTTC)のための最も効率的で信頼性の高い方法を使用して再構築されます。
Protocol
1. メタクリレートされたカバーリップの調製
注:ガラスカバーリップはPAヒドロゲルを共有結合するためにメタクリレートされ、細胞とのインキュベーション中に剥離を防ぎます。顕微鏡のガラスカバーリップは、高い画質を達成するために使用されます。
- 300 mL溶液を調製するには、清潔な400 mLガラスビーカーを取り、ヒュームフードの内側に置きます。
- ビーカーに10mLの二重蒸留水(ddH2O)を加えます。18.75 mLの酢酸(≥99.8%プロ分析、p.a.)、18.75 mLの3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート、252.5 mLのエタノール(≥99.8%p.a.)を血清学的ピペットを使用して追加します。結晶化皿に溶液を注ぎます。
- 精密なワイプと24のmmの丸いガラスカバーリップをきれいにしなさい。カバーリップをカスタムメイドのポリテトラフルエチレンラックに入れます。
- ラックを溶液に浸し、室温(RT)で15分間インキュベートします。
- ラックを取り、エタノール(99.8%p.a.)ですべてのカバースリップをすすいでください。気流の下でカバースリップを乾かします。
注意:メタクリレートカバーリップは、RTで最大1ヶ月間保存することができます。
ガラスカバーリップ上の細胞外マトリックスタンパク質のマイクロパターン化
注:ガラスカバーリップは、タンパク質と細胞忌避剤で構成される分子の層でコーティングされています。この層は、次いで、光パターン化技術を用いて除去され、その後の微小パターン化領域における細胞外マトリックスタンパク質の沈着を可能にする。
- 15mmの丸いガラスのカバースリップを取り、ペトリ皿の上に置きます。カバースリップの上面にダイヤモンドペンを使用します。その後、0.4mbarで酸素プラズマ処理を 行い 、2分間200Wで洗浄を進めます。
- ピペット100 μLの0.01%ポリL-リジン溶液を各カバースリップの表面に取り付けます。RTで30分間インキュベート 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)pH 8.5でカバースリップを洗浄します。余分な液体を取り除くが、表面を濡らしたままにする。
- ピペット100 μL 50 mg/mLポリ(エチレングリコール)メチルエーテルコハニミジルバレリック酸(mPEG-SVA)を10 mM HEPES pH 8.5の各カバースリップの表面に。RTで1時間インキュベート、10 mM HEPES pH 8.5でカバーリップをリンスし、空気流下で乾燥させます。
- 2 μL の UV 感度光化用光化(例えば、PLPP-ゲル)を加え、その後に 40 μL のエタノール (≥99.8p.a.) を表面に加えます。表面にゲルとエタノールの均質な分布を得るために、ペトリ皿を前後に静かに傾けます。溶液が重合するまで5分待ちます。
- 35 mm のペトリ皿の中にカバースリップを 1 つ入れ、底に 20 mm の穴を開けます。これにより、下から来るレーザー光がガラス表面に直接到達することができます。
- 顕微鏡と光のパターニングモジュールをオンにします(この装置の操作は、レーザー安全担当者からの安全導入後にのみ許可されます)。20x空気の目的でUV-Aレーザーを較正します。フォトイチエータを使ってサンプルをステージに上ろします。ガラスの表面に焦点を合わせ、フォーカスコントロールをオンにします。描画済みパターンをロードしてロックします。
- Inkscape のようなグラフィックソフトウェアを使用してパターンを準備します。パターンファイルがDMD寸法(20 xレンズ(0.28 μm/px)の552 x 325 μmに相当する1824 x 1140 px)を超えないようにしてください。
注: パターンファイルサイズとして DMD サイズ(1824 x 1140 ピクセル)を使用することをお勧めします。たとえば、1830 x 1130 ピクセルのサイズのパターン ファイルは生成しないでください。 - ポリアクリルアミドへのパターン転送を目的として、ガラスの中心から端まで半径の60%~70%のパターン化を行ってください。
- 単一のセルのパターン化には、パターン間の距離が100 μm、直径が150~300 μmの直径50~100μmのセルグループを使用します。適切なパターンサイズは、典型的な細胞サイズに大きく依存し、細胞が付着できるように十分に大きくする必要があります。
- Inkscape のようなグラフィックソフトウェアを使用してパターンを準備します。パターンファイルがDMD寸法(20 xレンズ(0.28 μm/px)の552 x 325 μmに相当する1824 x 1140 px)を超えないようにしてください。
- 30 mJ/mm2のUV線量によるパターニングを開始します。パターン作成の期間は、パターンの数によって異なります。1 つのパターンを作成するには、約 1 s かかります。
- パターニングステップを完了した後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で表面を3回リンスします。1x PBSに溶解した25 μg/mLフィブロネクチンの100 μLと、25 μg/mL フィブリノーゲンAlexa488コンジュゲートをPBSで1時間RTでインキュベートします。他のECMタンパク質の場合、パターン化された領域を完全に覆う最適濃度を見つけてください。
- 1x PBSで表面を3回リンスします。パターン化されたガラスが直ちにガラスPAの転写に使用されることを確認します。ヒドロゲル調製中にパターン化ガラスをRTでPBSに保管します。
3. パターン化ポリアクリルアミドヒドロゲルの製造
注:ポリアクリルアミドヒドロゲルは、酸化N-ヒドロキセチルアクリルアミド(HEA)を含む、表面上のマトリックスタンパク質の共有結合のための反応性アルデヒド基を提示するために調製される。さらに、ハイドロゲルの最上層にのみ蛍光ビーズを埋め込む二層アプローチは、牽引力顕微鏡実験中のビーズ変位の記録を改善するために使用される。
- メタクリレートされたガラスのカバーリップをペトリ皿に入れます。
- 新鮮な酸化HEA溶液を調製するには、15 mL遠心分離管に9.55mLの二重蒸留水を加えます。その後、0.5 mLのHEAを加え、42mgのナトリウム(メタ)を加え、10mLの溶液を得る。溶液を暗闇の中で4時間連続にかき混ぜる。
- 表1に記載のアクリルアミド、ビスアクリルアミド、及び二重蒸留水を混合して、10mLのストック溶液ヒドロゲルを得る(フームフードの下で行う、モノマーは神経毒性である)。ドガと気密シールに蓋を閉じます。
注:ストックソリューションは、4°Cで最大1年間アリコートに保管することができます。 使用前に常にヒドロゲルのヤング率を特徴付ける。 - 二重層PAヒドロゲルを準備します(ヒュームフードの下でそれを行う、モノマーは神経毒性です)。
- 1.5 mLチューブに99.3 μLのストック液、1%の過硫酸アンモニウム(APS)の0.5 μL、テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)0.2 μL を軽く混合して下層から始めます。溶液から10μLを取り、メタクリレートカバースリップの中央に滴下します。
- 15mmの丸いカバースリップを液滴に慎重に置き、重合のために45分待ちます。上部カバースリップをメスでそっと取り外します。
- 最上層では、93.3 μLofストック溶液を1μLの新鮮な酸化HEA溶液、5 μLの蛍光ビーズ(200 nmサイズのビーズの場合は1平方マイクロンあたり3個)、1%APSの0.5 μL、TEMEDの0.2 μLを1.5mLチューブにそっと混合します。溶液から5μLを取り、ピペットは既に重合された底層の中心に滴下します。
- マイクロパターンのカバースリップを液滴の上にそっと置きます。液滴が重合するまでRTで45分待ちます。パターン化された側面が液滴に触れられるようにします。カバースリップをメスでそっと取り外します。
- 24 mm のカバーリップを、2 成分のシリコーン接着剤を使用して、カスタムドリル 6 ウェル プレートの底に接着します。5分後、井戸にPBSを加えます。
- 原子間力顕微鏡(AFM)によるポリアクリルアミドヒドロゲルサンプルのヤング率を特徴付ける。
- AFMホルダーに球状の先端の片持ち面を取り付けます。
- 硬質基板(例えば、ガラスやマイカ)上の力距離曲線(3-4 Vセットポイント)を取得して各片持ちレバーを校正し、カンチレバー感度を推定し、表面から引き込み、熱的なチューンを行ってばねを一定にします。
- 調整されたカンチレバーをヒドロゲルサンプルの上に置き、次のパラメータを使用して、PBSバッファーに力曲線を取得します:20-30 nN力セットポイント、5または10 μm/sアプローチと引き込み速度、5 μmランプサイズ。
注:逆向きの光学顕微鏡は、空気40x目的と緑色蛍光タンパク質(GFP)フィルタを装備し、PAヒドロゲルサンプル内のECMマイクロパターン化された領域を視覚化し、標的化するために使用されました。 - AFM 解析ソフトウェアを使用して、取得した力と距離曲線をプロットします。
- 接触点を見つけ、力対距離曲線を力とインデント曲線に変換します。
- 0.2 と 0.5 のポアソン比を使用して、Hertz モデル(または先端ジオメトリの機能で適切な力学モデル)でカーブのインデント部分をフィットさせます。
4. UV-Aレーザー照明による細胞牽引力の局所放出(LUVI-TFM)
注:UV-Aレーザーは、ヒドロゲルの定義された領域に局在する細胞の牽引力を放出するために適用されます。UV-Aレーザー(すなわち、λ=375 nmの固体レーザー、<15 mW)はクラス3Bレーザーである。シールドされていないレーザービームは、目には危険であり、しばしば皮膚にとって危険です。反射光と散乱光と放射線は危険な場合があります。また、紫外線は皮膚癌を引き起こす可能性があります。デバイスの操作は、レーザー安全担当者からの安全導入後にのみ許可されます。
- 井戸からPBSを吸引します。
- シード 3 x 106 細胞 6 ウェルプレートあたりの成長培地.線維芽細胞の場合は、L-グルタミンを含む高グルコースダルベックコの改変イーグル培地(DMEM)を使用し、10%胎児ウシ血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加します。細胞を一晩37°C/5%CO2でインキュベートする。サンプルを洗浄して、顕微鏡を開始する前に浮遊細胞を除去します。
- 顕微鏡のインキュベーションチャンバーとガス供給をオンにして、37°Cと5%のCO2 雰囲気の温度を得ます。
- 顕微鏡とレーザーパターニングモジュールをオンにします。必要に応じて、レオナルドソフトウェアを使用して20x空気目標にUV-Aレーザーを再較正します。カスタムメイドの6ウェルプレートをサンプルと一緒にステージに置きます。PA の表面に焦点を合わせます。
- イルミネーション パターンを設定し、対象のセルにマークを付けます。ヒドロゲルの表面に再び焦点を合わせます。明視野チャネルのセルの画像を取得します。Cy5チャネル(遠赤色フィルター、650 nm励起、670 nm放射)に切り替え、変形状態のビーズの画像を撮ります。
- レーザーチャンネルにシフトします。レーザーを3分間オンにします。私たちの特定のセットアップでは、これは6,000 mJ / mm2の光量に対応しました。
- Cy5チャンネルに切り替えて、未変形状態のビーズの画像を取得します。
注:マウス胚性線維芽細胞を使用した実験では、15分の露光後に参照/変形していない画像を記録します( 代表結果 セクションを参照)。他の種類のセルでは異なる場合があります。別のセルに対して、手順 4.5 ~ 4.7 を繰り返します。 - UV-A照射後の酸化ストレス上昇を測定するために、市販の試薬(CellRox)を用いる。CellRoxは、還元された状態で非蛍光性であり、かつ、活性酸素種によって酸化されると、最大〜665nmの発光を有する蛍光を発する。
- 提供されたプロトコルに従って、5 μMの試薬を画像化媒体に加え、37°C/5%CO2で30分間インキュベートします。次いで、細胞3xを温かい1x PBSで洗浄し、イメージング媒体を交換する。同様の光露光を用いて、UV-A照明の前後に蛍光イメージングによりCy5信号を記録する。
5. 画像処理、粒子画像の軌跡と牽引力の計算
注: 細胞牽引力は、蛍光ビーズの変位を分析して記録され、粒子画像のvelocimetryに基づく画像解析ツールを使用して計算されます。
- 開いている蛍光ビーズ画像は、フィジーを使用してレーザー(すなわち、変形)前(すなわち、変形)後に。2 つのイメージを 1 つのスタックとしてマージする (イメージ |スタック |スタックするイメージ)。
- StackRegプラグイン(P.テベナズ、スイス連邦工科大学ローザンヌ)を使用して、2つの画像間の横ドリフトを修正します。イメージを 8 ビットに変更する (イメージ |タイプ|8ビット)と1024 x 1024 pixに再スケール(画像|スケール)。参照イメージを使用してイメージ シーケンス (TIFF 形式) として保存します。
- OpenPIV プロジェクトで実装されている PIV フィールドから相互相関テクニック 19 を使用して変位ベクトルフィールドを取得します。
- リラックスした(変形されていない)画像と変形した画像が、サイズwRとwDの検索ウィンドウでピクセル単位で覆われていることを確認します。各検索ウィンドウに対して、次の式を使用して相互相関関数を定義します。
ここで、R(i,j) と D(i,j) は、選択した検索ウィンドウに切り捨てられ、その後にミラーパッドが入った 2 つの画像の強度フィールドを記述します。
その平均値を記述します
。ウィンドウサイズは wR = 32 と wD = 32 に選択され、隣接する検索ウィンドウ間で 70% のオーバーラップが使用されます。 - 各検索ウィンドウで、相互相関関数を最適化する変位ベクトル
を決定し、検索ウィンドウの中心位置に割り当てます。サブピクセル精度は、20のように最大領域の周囲にガウスフィットを使用して得られます。 - あいまいな変位ベクトルを検索して削除します。1.5のしきい値より下の相互相関関数の2つの最も高い局所的な最大値間の比率があいまい 21 と見なされる検索ウィンドウに対応する変位ベクトル。
- 残存しきい値 1.522 の正規化された中央値検定に失敗した変位ベクトルを破棄します。
- (オプション)すべての変位から固定ベクトル
を引いて、残りの横ドリフトを補正します。これは、選択した領域の変位がセルから遠く離れているために行われます。 - 3 次多項式補間を使用して、結果の変位ベクトルフィールドを、入力画像の間隔 4 ピクセルの通常のグリッドに補間します。欠落しているデータポイントは、滑らかな二変量スプラインの外挿を使用して塗りつぶされます。ディスプレイスメントベクトル(ピクセル単位)は、画像のピクセル比(20xエアレンズの場合は0.33 μm/px)によって局所的な変形に関連しています。
- (オプション)後の解析での呼び出し音のアーティファクトを減らすために、イメージをミラーパッドにします。
- 変形フィールドに Tukey ウィンドウ関数を掛け合わせると、0.2-0.3 のパラメータを使用して、ドリフト補正によるエッジ効果を排除します。この実験では、FOVの中心にあるマイクロパターン化された領域が注目される。
- リラックスした(変形されていない)画像と変形した画像が、サイズwRとwDの検索ウィンドウでピクセル単位で覆われていることを確認します。各検索ウィンドウに対して、次の式を使用して相互相関関数を定義します。
- 規則化フーリエ変換トラクションサイトメトリー(FTTC)18を使用してトラクションを再構築します。正規化として、最も簡単な合理的な選択、すなわち、0番目 のオーダーティホノフ(L2)の正規化23、24、25を使用します。最適な正規化パラメータ λは、26 で定義された一般化交差検証(GCV)関数を最小化するために選択されます。
ここでτλは、すべてのフーリエサンプリングモードに対するλの与えられた値に対する再構成されたトラクションフィールドのxおよびy成分を含む積層ベクトルであり、GはFTTCに対して定義されているとおり、対応する変位フィールドに対するトラクションフィールドをマッピングする線形演算子である。合計はベクトルコンポーネント上で実行されています。ui は、すべてのフーリエサンプリングモードの変位フィールドの x および y 成分です。GCVは、不適切な逆問題の分野で広く使用されており、TFMでよく使用されるL曲線基準に代わる良い代替手段です。ランツコスフィルタは、周波数空間が限られており、ディスプレイスメントフィールドアップサンプリングが原因で発生するアーティファクトを削減するために使用されます。トラクション計算は、ヤングのPAの係数(例えば、11.3 kPa)とポアソンの比率(例えば、架橋濃度に応じて0.2と0.5の範囲のPA)に依存する。
その平均値を記述します
。ウィンドウサイズは wR = 32 と wD = 32 に選択され、隣接する検索ウィンドウ間で 70% のオーバーラップが使用されます。
を決定し、検索ウィンドウの中心位置に割り当てます。サブピクセル精度は、20のように最大領域の周囲にガウスフィットを使用して得られます。
を引いて、残りの横ドリフトを補正します。これは、選択した領域の変位がセルから遠く離れているために行われます。
Representative Results
PAヒドロゲルをメタクリレートガラスカバーリップ上に重合し、PAの共有結合に反応基を提示した。このようにして、ヒドロゲルを水溶液に入れた場合、基板からのそれらの剥離が防止された(図1A-D)。ヒドロゲル表面付近の高密度の受託マーカーを得るために、我々は二重層PAヒドロゲルの調製を開発した。一番下の層を、蛍光ビーズを一切含まず、メタクリレートされたカバースリップ上に重合した。続いて、ビーズを含む別の層を最下層(図1E-H)の上に重合し、沈降の必要性を置き換え、これはしばしば単一の焦点面でビーズ分布を達成し、ビーズ密度を高めるために使用される。TFM測定中の細胞形状の制御を達成するために、ガラスカバースリップからプリポリマーPAへのフィブロネクチンパターン化微細構造の直接移動を介した微パターンPAヒドロゲルを製造しました(図1F-F')。最上ヒドロゲル層溶液に1%非従来型架橋剤(酸化HEA)を添加すると、フィブロネクチンのアミン基に共有結合するアルデヒド基を提供する。
厚さ約60μmのPAヒドロゲルと、ヒドロゲル表面に近い上層に閉じ込められた蛍光ビーズを用意しました。このタイプのヒドロゲルは、ガラス基板の影響を防ぐために、反転顕微鏡と十分な厚さ(TFMを行うのに最小厚さ)18 で細胞トラクションを撮影するのに適した基板です。蛍光ビーズの局在化は共焦点顕微鏡法で画像化した(図1I)。ヒドロゲル上でのタンパク質の転写を可視化するために、蛍光標識ECMタンパク質を使用し、蛍光顕微鏡で画像化しました(図1J)。フィブロネクチンの微パターン円を直径100μm(左側)、50μm(右側)で調製し、接着性細胞の明るいフィールド画像のオーバーレイに示すように、細胞または単一細胞のグループの接着を可能にし、受託者ビーズとフィブロネクチンの微小パターンを蛍光標識した。別のサンプルでは、単一細胞の微小パターン化フィブロネクチンへの接着応答を、パキシリンなどの焦点接着タンパク質の局在化を画像化するために間接的免疫蛍光顕微鏡法により検証した(図1K)。
ECMプロテインコーティングとヒドロゲルの剛性は、細胞接着26にとって重要なパラメータです。PAヒドロゲルの機械的特性を特徴付けるために、AFM27によるナノインデンテーション実験を、蛍光顕微鏡と組み合わせたもので行いました。3種類の剛性のヒドロゲル基材を、当社のセットアップで調製し、試験しました(図2 および 表1)。球形のAFM片持ち体は、力距離曲線を記録しながら、パターン化されていないPAヒドロゲルおよびフィブリノーゲンをAlexa488マイクロパターン化された領域に結合させた周期的に接近し、引き込まれた。その後、Hertzモデルの接触点評価と応用により、各サンプルのヤング率(E)を推定することができました。ECMマイクロパターニングはヤング率を変化させることはなかったが、これはパターン化されていないPAヒドロゲルのそれぞれに匹敵するままであった。
基板上の接着細胞が発揮する牽引力を測定するために、UVレーザーモジュール(UV-A 6000 mJ/mm2)近傍を搭載した広視野発蛍光顕微鏡(UV-A 6000 mJ/mm2)で行った基準ベースのTFMの実験セットアップを開発し、細胞牽引力を放出しました(図3A)。レーザー光照射は時間的に制御できるため、単一の細胞または細胞クラスターを高いレーザー線量で選択的に露光することができるだけでなく、さらに重要なことに、トリプシンのような消化酵素を用いたサンプル全体からの細胞除去の破壊的な中間工程は不要になった。このような高いレーザー線量で細胞を照らして、細胞死につながる酸化ストレスの上昇を誘発した(図3B)。細胞死は、ビーズ変位によって示されるように、基質からの牽引の放出をもたらした(図3Aに示す)。UV-A照明と光パターニングモジュールを組み合わせて、PAヒドロゲルのミクロンサイズの領域を選択的に照射しました(図3B-C)。このようにして、マイクロパターン化された細胞クラスター(図3C、F)または単一細胞(図3B)のトラクションを解除することができる。重要なことに、我々の時間スケールでは、ECMパターン化ヒドロゲルの機械的特性は、UV露光によって有意に影響を受けなかった(図2C)。酸化ストレスの増加を図3D,Eに示す。トラクションフォースは、一般化クロス検証によって選択された正規化パラメータを持つ正規化FTTCを使用して再構築されました(図3B、F)。単一セルの力の放出は15分の期間にわたって起こり、LUVI-TFMの結果はトリプシンベースのTFM(図3G-H)と同等である。
図1:TFM用のパターン化フィブロネクチン基質調製物のスキーム (A)下層の溶液は、メタクリル化された表面に配管される。(B)小さなきれいなカバースリップは、慎重に液滴に置かれます。(C)ゲル化時間は45分(D)上部カバースリップが取り外されている。一番下のレイヤーの準備ができました。(E)最上層の溶液をヒドロゲルにピペット処理する。(F) パターン化されたカバースリップは、液滴に慎重に配置されます。(F')ガラス上の接着タンパク質のマイクロパターニングは、UVリソグラフィ付近のマスクレスによって生成され、ガラスからPAヒドロゲルに移されます。接着タンパク質の遊離アミン基は、例えば、フィブロネクチン、PA表面上のアルデヒド基に共有結合する。(G)ゲル化時間は45分(H)上部カバースリップが取り外されている。パターンPAヒドロゲルは準備ができています。(I) 表面近くの受託者ビーズの高密度を示す共焦点xyz顕微鏡写真の3D表現。(J)細胞の明視野画像を重ねたPA表面に蛍光標識フィブロネクチン(マゼンタ)を埋め込んだ蛍光ビーズ(緑色)の顕微鏡写真。(K)円状のフィブロネクチンマイクロパターン(100μm)に付着した単一細胞の間接免疫蛍光顕微鏡イメージング。核(青)、パキシリン(赤)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:AFMによるサンプル力学特性の特性評価 (A) AFMナノインデンテーション実験セットアップ。球状のカンチレバーは、UV処理の前後のECMマイクロパターンと、二重層PA(5%アクリルアミド、0.3%ビスアクリルアミド)領域の非パターン領域をプローブするために使用されます。(B) ECM マイクロパターン(黒)の代表的な力とインデント曲線。ヘルツフィット(赤)は、サンプルのヤング率(E)を計算するために使用されます。(C) UV-A曝露後の非パターン二重層PA領域(ECMなし)、ECMマイクロパターンおよびECMマイクロパターンの機械的測定。バーはS.E..M±平均を示しています(ブラウン・フォーサイスとウェルチANOVAテスト)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.ローカル UV-A 照明 TFM (LUVI-TFM) は、大きな視野内での局所的な牽引力測定を可能にします。 (A) 局部UV-A照明TFMのスキーム。細胞は、未変形(参照)画像を得るために高用量のUV-Aレーザーで処理される。(B) UV-A レーザー照明前の単一セルの明視野画像。中央: UV-A レーザー照明後の単一セルの明視野画像。右:フィブロネクチン被覆PAヒドロゲル(E = 5.74 kPa)に付着した単一のMEFの牽引力を、直径50μmのUV光ビーム(赤色の破線)で照らした。(C)左:マイクロパターン化フィブロネクチン(円、直径100μm)に付着したマウス胚性線維芽細胞(MEF)のクラスターの牽引力の記録。クラスターは直径 200 μm の UV ライトビーム (赤い破線) で照らされました。右:マイクロパターン化フィブロネクチン(円、直径300μm)に付着したマウス胚性線維芽細胞(MEF)のクラスターの牽引力の記録。クラスターは直径 300 μm の UV ライトビーム (赤い破線) で照らされました。スケールバー=200μm(D,E)高いUV-Aレーザー線量が蛍光顕微鏡で検出された後のCy5シグナル強度の増加によって示される細胞における酸化ストレスの増加。酸化ストレスは細胞死につながる。スケールバー=200μm(F)左:マウス胚性線維芽細胞(MEF)のクラスターから微小パターン化フィブロネクチン(円、直径100μm)に付着したストレスヒートマップ。右:マウス胚性線維芽細胞(MEF)のクラスターから微量パターン化フィブロネクチン(円、直径300μm)に付着したストレスヒートマップ。(G)100μmフィブロネクチンマイクロパターンに付着したMEF細胞は、UV-A曝露後に徐々にトラクションを放出する。完全な放出は15分後に達成される(参照画像は、その後、15分後露光を撮影した)。(H) 直径300μmのパターンフィブロネクチンに付着したMEF細胞に対する従来のトリプシンベースTFMとの比較。UV-Aイルミネーション(6,000 mJ/mm2)の後に15分待ちの結果は、従来のトリプシン処理(すなわち、20分間0.05%)とは有意に異なっています。バーはS.E.Mを意味します(両側の学生の tテスト、****P<0.0001、* P <0.05、ns P ≤0.5)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| アクリルアミド (%) | ビスアクリルアミド (%) | 40% ストック溶液 (ml) からのアクリルアミド | 2%ストック溶液(ml)からビスアクリルアミド | 水 (ml) | ヤングの係数 (kPa) |
| 4 | 0.1 | 1 | 0.5 | 8.5 | 5,74 ± 0,53 |
| 5 | 0.15 | 1.25 | 0.75 | 8 | 9,69 ± 0,68 |
| 5 | 0.3 | 1.25 | 1.5 | 7.25 | 11,33 ± 1,06 |
表1:ヒドロゲルストック溶液混合物と得られた弾力性
すべてのデータは、マックスプランク協会(Edmond)のオープンアクセスデータリポジトリに預け、次のアドレスからアクセスすることができます https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf。
Discussion
本プロトコルでは、蛍光ビーズを含むマイクロパターンPAヒドロゲルの調製について説明する。我々のアプローチは、3つのステップに基づいています: 1) 二重層PAヒドロゲルの調製;2)ECMタンパク質のマイクロパターン化とヒドロゲル表面への転写;3)TFMのためのパターン近紫明光の使用。基板への細胞の牽引を分析する実験のセットアップは、蛍光ビーズ26の変位に関連する力を計算するために既知の剛性値を持つ線形弾性材料の使用を必要とします。PAヒドロゲルは準備が容易で、剛性は容易に調整でき、剛性感知およびTFM18,28のために一般的に使用される。しかし、ヒドロゲル全体の再現可能な重合時間と均質な重合を得るためには、試薬の保存条件と時間に注意を払う必要があります。TEMED は直接光から保護する必要があります。酸化HEAを使用すると、ヒドロゲル表面上のマトリックスタンパク質の共有結合が可能となり、完全で安定したタンパク質層の形成を達成するのに有利である可能性があります。酸化されたHEA溶液は、PAヒドロゲルが製造されるたびに新鮮に調製する必要があります。二重層PAヒドロゲルは3つの主な利点を提供する:1)ゲルを非常に薄くする必要なしに、ヒドロゲル表面の近くで受託者ビーズの均質な分布を再現的に得るための代替方法を提供する(すなわち、<20 μm)。TFMを用いて正確な測定を行う上で、ヒドロゲルの厚さの制御が重要です。弾性基材が薄すぎると、線維芽細胞等の強固な接着性細胞が、基礎となる剛性ガラス基板29,30に感知し機械的に応答することがある。厚いヒドロゲルは力の再構成のためのイメージ獲得をより困難にする。さらに、多くの顕微鏡は、超薄顕微鏡スライドを使用しない限り、ヒドロゲルを取り付けるために使用されるガラス基板の追加の厚さを考慮して、それらを収容するのに十分なスペースを持っていません。2)二重層PAヒドロゲルでは、PAヒドロゲルの表面付近の受託者ビーズの均質な分布は遠心分離機を使用せずに達成され、むしろ正確な量のヒドロゲル溶液および蛍光ビーズの単純なインキュベーションで達成される。PIV分析を行う場合、PIV分析では、共焦点顕微鏡を必要とせずに牽引力と信号対雑音比の分解能が高くなるため、高いビーズ密度が大きな利点となります。3) 細胞材料界面に近い薄層にビーズを閉じ込めると、共焦点顕微鏡と同様に、発蛍光顕微鏡による牽引力のイメージングが可能になります。ハイドロゲルを調製する際には、プロトコルの後続のステップに進む前に、底面ガラスにしっかりと付着していることを確認する必要があります。ヒドロゲル表面を損傷することなく表面の上にガラスを取り除くのは難しい場合があるため、ヒドロゲル層の重合に示されたインキュベーション時間に従うことをお勧めします。
弾性特性を測定する最もよく知られている技術は、AFM、ナノインデント、引張試験、およびレオメトリーです。しかし、ナノインデンテーションは、弾性特性の決定に影響を与える可能性のある材料に非常に高い株を誘導する。一方、引張試験とレオメトリーは巨視的な測定技術であり、細胞は微視的な尺度31,32で相互作用する。AFMは生理学的条件の下で減らされた緊張とマイクロスケールで測定を可能にする。AFM測定の信頼性は、実験の詳細が欠落している場合(例えば、インデント力および速度)または不十分なデータが記録された場合に悪影響を受ける可能性がある27。Huthらは、AFMデータからヤングのモジュライを抽出するアルゴリズムを記述し、測定の詳細を定数27に保つことを強調する。このアルゴリズムはヤングのモジュライの正確で信頼性の高い決定を提供し、我々の実験に使用された。さらに、異なる日に作製されたサンプル上の多くの曲線を測定し、非常によく似た結果(ca. 1-2 kPaの平均値の変動)を得ました。これは、ゲルの剛性を確実に予測できることを示しています。
このプロトコルでは、フォトパターニングモジュールを使用してガラス上にマイクロパターン化された領域を作成し、ハイドロゲル表面に転送します。このプロトコルに示されているマイクロパターン化は、DMD (デジタルマイクロミラーデバイス)ベースのマスクレス近紫外リソグラフィー (λ = 375 nm)7 に基づいています。DMD は、チップ上の多数のマイクロミラーで構成されます。単一のピクセルは、単一のマイクロミラーに対応します。コンピュータのピクセル化パターン画像ファイルは、DMDを介して投影され、対物レンズを使用して表面に焦点を当てます。タンパク質のマイクロパターン化の場合、焦点を合わせるレーザー光は、光始子の助けを借りて忌避性ポリマーブラシを切断するために使用されます。その後、露出した領域はECMタンパク質で満たされます。このマスクレスアブレーション法は、フォトマスクの使用に依存しないため、新しいパターンを設計する際に大きな柔軟性を提供します。Inkscape のようなフリーウェアを使用して数分しかかからなくて済むので、パターンのデザインと適用は非常に簡単です。しかし、短時間で生成されるパターンやサンプルの数は大きな欠点であり、この方法は毎回単一の基板をパターン化するためにのみ使用することができる。フォトパターニングモジュールは、数ミリワットを放出する近くのUV固体レーザー光源を使用します。シールドされていないレーザービームは、目や皮膚に危険です。反射光と散乱光と放射線も危険です。取り扱いには、レーザー役員の安全指導を伴う必要があります。フォトパターニングモジュールを使用する際のプロトコルの最も重要なステップは、マイクロパターニングとアブレーションの間にレーザーが表面に適切に焦点を合わせられるようにすることです。パターニング中のUV光の一貫した照明線量(強度を時間で乗算)は、レーザーが表面に焦点を当てる方法に依存します。焦点不良による表面の強度が弱いと、ヒドロゲル表面へのECM転送が失敗し、ヒドロゲルに結合する細胞がなくなることがあります。
TFM実験では、接着細胞および受託マーカーの初期イメージング後、細胞は、それらのリラックスした状態を記録するためにトリプシン処理によってPAヒドロゲルから放出される。このステップを実行する際の欠点は、顕微鏡の段階でサンプルを処理することです。灌流チャンバーなし、皿の蓋を開け、媒体を吸引し、すすがり、ピペット化トリプシン溶液は初心者や経験豊富なユーザーのための課題を表します。実際、これらの手順は 、xyz 軸のドリフトの主要な原因であり、位置とフォーカスが失われます。当社のローカルUV照明プロトコルは、初心者のためのよりアクセスしやすい技術をTFMにします。市販の顕微鏡ベースのマスクレスフォトパターニングモジュールを使用しましたが、原理的にはUV-A照明システムを使用して、最終的には細胞牽引力を記録してはならない基板の領域を保護するためにマスクと組み合わせて使用することができます。低波長可視光(例えば、DAPI発光を励起する紫色光)の有意な用量で細胞を曝露すると、酸化ストレスが増大し、光毒性や細胞死を引き起こす可能性があります。したがって、この技術は、UVレーザーモジュールを使用しない蛍光顕微鏡でも適用することができる。しかし、強度がはるかに弱いので、この場合の酵素処理でTFMを達成することははるかに容易になります。
LUVI-TFMを使用すると、単一セルまたはセルの小グループの局所剥離のために、複数の測定に同じサンプルを使用することが可能です。ただし、隣接するセルからの力を記録しないように、取り外すセルの選択に注意を払う必要があります。したがって、マイクロパターンがない場合の単一細胞測定では、混雑した領域は避けるべきです。単一のマイクロパターン化されたセルでの測定では、単一の構造間の距離がパターン化された領域の直径の少なくとも 2 倍になるようにパターンを設計する必要があります。また、隣接するパターンの細胞を順番に使用するのではなく、基板上の遠くの領域からサンプリングすることもお勧めします。我々の測定は焦点制御特徴および40 x空気NA=0.9レンズを備えた、十分に長く、ある井戸から別の井戸への急速な動きが高い上昇の顕微鏡で行われる。TFMアプリケーション用の細胞のターゲット剥離は、単一の細胞または小さな細胞クラスタ全体(直径300μmまで)の細胞力を測定するのに有効です。我々のセットアップを用いて、単一細胞のUV処理のための細胞の丸めと剥離を観察した(図3A)が、小細胞クラスターでは剥離がほとんど起こらなかった。これは、細胞牽引力の過小評価につながる可能性があります。より大きなセルクラスタの場合、ユーザーは20倍の空気目標を使用してクラスタ全体をイメージし、フォーカス制御機能が必要であるため、酵素剥離をお勧めします。20xエアレンズの焦点深度がはるかに長くなるので、取り扱いはより高い倍率の目的ほど重要ではありません。照明線量は表面のレーザーフォーカスに依存するため、ユーザーは細胞のアブレーションに焦点が正しく設定されていることを確認する必要があります。隣接する未処理細胞との機械的相互作用が可能なため、細胞集団でLUVI-TFMを使用する場合の可能性は認識していますが、この側面は、実際には上皮単層からの標的細胞押出の力学に関する研究に役立つ可能性があります。
結論として、マイクロパターン化細胞の光誘導放出と組み合わせたTFMアプローチにより、細胞接着力を測定するための堅牢で高スループットのプロトコルを提供します。この方法の多様性は、解像度と感度の向上を目的とした顕微鏡およびイメージング設定を使用して、さらに活用される可能性があります。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
私たちは、レベッカ・アルバラド夫人がプロトコルビデオ制作のサポートをしてくれたことに感謝し、スティーブン・カザーレ氏は原稿に対する建設的な批判を受けました。マックスプランク医学研究所の細胞生物物理学科の同僚に、有益な議論に感謝します。マックス・プランク・ゲセルシャフトからE.A.C.-Aへの財政支援。ドイツ・フォルシュングスゲマイインシャフト(DFG SFB1129、プロジェクトンマー 240245660、P15からE.A.C.-A、P4から米国へ;DFG EXC 2082/1-390761711 to.S.)また、大いに認められています。J.Bカール・ツァイス財団の財政支援に感謝します。E.A.C.-A.、C.S.、米国は、ドイツ連邦教育研究省(BMBF)が支援するマックスプランクスクールマター・トゥ・ライフを通じた資金調達を認めています。C.S.は欧州研究評議会(統合グラント・フォトメック、No.101001797)によって支持されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | #440159 | Sigma Aldrich | |
| Acetic acid | #33209 | Honeywell | |
| Acrylamide 40 % | #1610140 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| AFM cantilever | #CP-CONT-BSG-A-G | NanoAndMore | 5 μm spherical tip |
| AFM system | #NanoWizard3 | JPK | Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter |
| Ammonium persulfate | #A3678 | Sigma | |
| Bis-acrylamide 2 % | #1610142 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| Camera sCMOS | #C11440-42U30 | Hamamatsu | |
| Camera sCMOS | #ANDORZYLA4.2 | Oxford Instrument | |
| CellRox | #C10422 | Thermo Fisher | |
| Custom incubator chamber | EMBLEM | ||
| Dental glue | #1300 100 | Picodent | |
| DMEM | #41965 | Thermo Fisher | |
| Epifluorescence microscope | #Eclipse Ti2E | Nikon | |
| Epifluorescence microscope | #Axiovert200 | Zeiss | |
| Ethanol | #9065.3 | Carl Roth | |
| FBS South America | #S181T | Thermo Fisher | |
| Fibrinogen | #F13191 | Invitrogen | Alexa488 conjugate |
| Fibronectin | #F1141 | Sigma | |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8805 | Invitrogen | Carboxylated (365/415) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8848 | Invitrogen | Carboxylated (505/515) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8810 | Invitrogen | Carboxylated (580/605) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8807 | Invitrogen | Carboxylated (660/680) |
| Glass coverslip 15 mm round | #41001115 | Assistent | |
| Glass coverslip 24 mm round | #41001124 | Assistent | |
| Microscope Objective | #MRH08230 | Nikon | 20x air NA 0.45 |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | #CRL-2991 | ATCC | |
| mPEG-SVA | #MPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | |
| N-Hydroxyethyl acrylamide | #697931 | Aldrich | |
| Plasma cleaner | #100-E | TePla | |
| PLPP gel | #PLPPgel | Alveole | |
| Poly-L-lysine | #P4823 | Sigma Aldrich | |
| Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) | #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) | SuSoS | |
| Sodium(meta) periodate | #S1878 | Sigma Aldrich | |
| TEMED | #17919 | Thermo Scientific | |
| UV Patterning module | #PRIMO | Alveole | |
| UVO cleaner | #342-220 | Jelight |
References
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