Isolering af primære patientspecifikke aorta-glatte muskelceller og semikvantemittende realtidskontraktionsmålinger in vitro

Summary

Dette papir beskriver en eksplantationskulturbaseret metode til isolering og dyrkning af primære, patientspecifikke humane aorta glatte muskelceller og dermale fibroblaster. Desuden præsenteres en ny metode til måling af cellekontraktion og efterfølgende analyse, som kan bruges til at studere patientspecifikke forskelle i disse celler.

Abstract

Glatte muskelceller (SMC'er) er den fremherskende celletype i aortamediet. Deres kontraktile maskiner er vigtige for overførsel af kraft i aorta og regulerer vasokonstriktion og vasodilatation. Mutationer i gener, der koder for SMC-kontraktile apparatproteiner, er forbundet med aortasygdomme, såsom thoraxaortaaneurismer. Måling af SMC-sammentrækning in vitro er udfordrende, især på en måde med høj gennemstrømning, hvilket er afgørende for screening af patientmateriale. Aktuelt tilgængelige metoder er ikke egnede til dette formål. Dette papir præsenterer en ny metode baseret på elektrisk celle-substratimpedansføling (ECIS). For det første beskrives en eksplantatorprotokol for at isolere patientspecifikke humane primære SMC'er fra aortabiopsier og patientspecifikke humane primære dermale fibroblaster til undersøgelse af aortaaneurismer. Dernæst gives en detaljeret beskrivelse af en ny sammentrækningsmetode til måling af disse cellers kontraktile respons, herunder den efterfølgende analyse og forslag til sammenligning af forskellige grupper. Denne metode kan bruges til at studere sammentrækningen af klæbende celler i forbindelse med translationelle (kardiovaskulære) undersøgelser og patient- og lægemiddelscreeningsundersøgelser.

Introduction

Glatte muskelceller (SMC'er) er den fremherskende celletype i det aorta mediale lag, det tykkeste lag af aorta. Inden for væggen er de radialt orienterede og er involveret i blandt andet vasokonstriktion og vasodilatation¹. SMC-kontraktilmaskineriet er involveret i transmissionen af kraft i aorta gennem den funktionelle forbindelse med den ekstracellulære matrix². Mutationer i gener, der koder for proteinerne i SMC-kontraktile apparater, såsom glat muskel myosin tung kæde (MYH11) og glat muskel actin (ACTA2), har været relateret til tilfælde af familiære thoracaortaaneurismer, hvilket understreger relevansen af SMC-sammentrækning med hensyn til at opretholde den strukturelle og funktionelle integritet af aorta ^1,2 . Desuden er mutationer i TGFβ-signalvejen også forbundet med aortaaneurismer, og deres virkninger i aortaaneurismepatofysiologi kan også undersøges i hudfibroblaster³.

Måling af høj gennemstrømning af SMC-sammentrækning in vitro er udfordrende. Da SMC-kontraktilitet ikke kan måles in vivo hos mennesker, udgør in vitro-assays på humane celler et gennemførligt alternativ. Desuden er abdominal aortaaneurisme (AAA) udvikling i dyremodeller enten kemisk induceret af for eksempel elastaseperfusion eller forårsaget af en specifik mutation. Derfor er dyredata ikke sammenlignelige med AAA-udvikling hos mennesker, som for det meste har en multifaktoriel årsag, såsom rygning, alder og / eller aterosklerose. In vitro SMC-kontraktilitet er hidtil hovedsageligt blevet målt ved trækkraftmikroskopi ^4,5, kvantificering af Fura-2-fluorescens intracellulære calciumfluxer⁶ og kollagenrynkendeassays⁷. Mens trækkraftmikroskopi giver uvurderlig numerisk indsigt i de kræfter, der genereres af en enkelt celle, er den ikke egnet til screening med høj gennemstrømning på grund af den komplekse matematiske databehandling og analysen af en celle ad gangen, hvilket betyder, at det er meget tidskrævende at måle et repræsentativt antal celler pr. Donor. Fura-2 farvestof- og kollagenrynkende assays tillader overfladisk bestemmelse af sammentrækning og giver ikke et præcist numerisk output, hvilket gør dem mindre egnede til at diskriminere patientspecifikke forskelle. Nedsat SMC-sammentrækning i celler afledt af aorta hos abdominale aortaaneurismepatienter blev demonstreret for første gang ved at optimere en ny metode til måling af SMC-sammentrækning in vitro⁸. Dette blev gjort ved at genbruge den elektriske celle-substrat impedansføling (ECIS) metode. ECIS er et realtids, medium-throughput assay til kvantificering af klæbende celleadfærd og sammentrækning ^9,10,11 såsom SMC vækst og adfærd i sårheling og migration assays 12,13,14. Den nøjagtige metode er beskrevet i protokolafsnittet. På denne optimerede måde kan ECIS også bruges til at studere fibroblastkontraktion på grund af deres lignende størrelse og morfologi.

Formålet med dette papir er at give en trinvis beskrivelse af metoden til måling af SMC-sammentrækning in vitro ved hjælp af ECIS⁸ og sammenligning af sammentrækningen mellem kontrol og patient-SMC'er. For det første forklares isolering og dyrkning af primære SMC'er fra kontrol- og patientaortabiopsier, som kan bruges til sammentrækningsmåling. For det andet beskrives sammentrækningsmålinger og -analyser sammen med verifikationen af SMC-markørekspression. Desuden beskriver dette papir metoden til isolering af patientspecifikke dermale fibroblaster, hvis sammentrækning kan måles ved hjælp af den samme metode. Disse celler kan anvendes til patientspecifikke undersøgelser med fokus på aortaaneurisme eller andre kardiovaskulære patologier¹⁵ eller prognostiske undersøgelser ved hjælp af en transdifferentieringsprotokol, der muliggør sammentrækningsmåling før aneurismekirurgi¹⁶.

Protocol

BEMÆRK: Aortabiopsier blev opnået under reparation af åben aneurisme i Amsterdam University Medical Centers, VU University Medical Center, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam og Dijklander hospital, Hoorn, Holland. Kontrol aortavæv blev opnået fra det stykke af aorta, der var fastgjort til nyrearterien høstet til nyretransplantationer. Kun patienter over 18 år blev inkluderet, og alle patienter gav deres informerede samtykke til at deltage i undersøgelsen. Alt materiale blev indsamlet i overensstemmelse med reglerne i WMA-erklæringen fra Helsinki og institutionelle retningslinjer fra VU Medical Centers medicinske etiske komité. Alle eksperimenter og eksperimentelle protokoller blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og godkendt af VU Medical Centers medicinske etiske udvalg. Du kan finde fuldstændige oplysninger om de anvendte kontrol- og patientcellelinjer i ⁸.

1. Isolering af primære humane SMC'er fra aortabiopsier

BEMÆRK: Udfør følgende trin under en steril vævskultur laminær flowhætte. Brug handsker og brug standard aseptiske teknikker, når du håndterer humant blod og humane vævsprøver. SMC'er dyrkes i 231 Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium suppleret med 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin og Smooth Muscle Growth Supplement kaldet SMC medium.

1. Steriliser to par kirurgiske tang og en skalpel ved at nedsænke dem i 70% ethanol og derefter tørre dem tørre.
2. Pipette 2 ml SMC-medium i en petriskål, hvori vævsdissektionen udføres.
3. Pipette 2,5 ml SMC-medium i to T25-kolber. Kolberne hvirvles rundt, så det lille mediumvolumen dækker hele overfladen.
4. Transport af den høstede humane aortavægsbiopsi fra operationsstuen til laboratoriet på is i et sterilt plastrør med kold, steril vævsoverførselsopløsning (se materialetabellen) eller 0,9 % NaCl.
5. Åbn røret med vævet inde i vævskulturhætten. Tag biopsien ud af røret ved hjælp af den steriliserede tang og læg den i petriskålen (figur 1A).
6. Undersøg biopsien visuelt for at identificere de tre aortalag, tunica intima (indre), medier (midten) og adventitia (ydre lag). Se efter tilstedeværelsen af aterosklerotiske plaques på intimasiden og slimet bindevæv på adventitialsiden (figur 1B) for at skelne lagene.
7. Hvis du vil isolere SMC'er fra medierne, skal du fjerne de to andre lag. Placer vævet med intima plaque side op først (figur 1B). Fjern den faste plak ved at trække den væk fra vævet med tang, mens du skubber vævet ned med det andet par tang. Fjern efterfølgende lag af plak, indtil det lyserøde, ensartede mediale lag er synligt.
8. Vend vævet (figur 1C). Gentag den samme procedure, som i trin 1.7, ved at trække det eventyrlige lag af (figur 1D). Sørg for at fjerne alle synlige dele i så mange forsøg som nødvendigt, da dette lag ikke let løsner sig fra medierne.
   BEMÆRK: Det er vigtigt, at de indelige og eventyrlige lag fjernes korrekt for at opnå en så ren SMC-population som muligt.
9. Når det mediale lag er isoleret, skæres vævet i terninger på ca. 1 mm x 1 mm x 1 mm. Tryk mediet ned med tang og skær vævet i en retning ved hjælp af skalpellen. Skær ikke frem og tilbage; lav rene, ensrettede snit for at minimere skader. Prøv at lave så mange terninger som muligt i betragtning af biopsiens størrelse (figur 1E).
10. Vævsstykkerne anbringes i den øverste fjerdedel af T25-kolben ved hjælp af tangen. Kolbe anbring 10-20 terninger pr. kolbe, hvis mængden af materiale tillader det (figur 1F).
    BEMÆRK: Brug glatte tang for at minimere vævets vedhæftning til tangens ribben og let løsne vævet i kolben.
11. Udrubbere vævsterningerne i T25-kolberne i ca. 10 dage ved 5 % CO₂ ved 37 °C i en inkubator.
    BEMÆRK: Første celleudvækst forventes omkring det tidspunkt. De celler, der oprindeligt migrerer, kan se mindre ud end normale SMC'er.
12. Når cellevæksten er observeret, tilsættes 2,5 ml medium til kolben, og sørg for ikke at pipette den på vævsstykkerne for at forhindre dem i at løsne sig.
13. Efter ca. 5 dage mere, når klynger af celler observeres omkring vævsstykkerne, ændres kulturmediet. Hvis vævsstykker løsnes, skal du fjerne dem, da de ikke vil sætte sig fast igen.
14. Når cellerne er 80-90% sammenflydende, overføres de til en T75-kolbe og fortsætter med at dyrke i dette format.
    BEMÆRK: Et splitforhold på 1:2 eller 1:3 anbefales. Frys en sikkerhedskopi af cellerne ved en tidlig passage. Cellerne opretholder generelt deres egenskaber indtil passage 10; senere passager bør ikke bruges til eksperimenter.

2. Isolering af primære dermale fibroblaster fra hudbiopsier

BEMÆRK: Udfør følgende trin under en steril vævskultur laminær flowhætte. Brug handsker og brug standard aseptiske teknikker, når du håndterer humant blod og humane vævsprøver. Fibroblaster dyrkes i basalt medium suppleret med 10% føtalt kvægserum, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin, kaldet fibroblastmedium.

1. Steriliser to par kirurgiske tang og en skalpel ved at dyppe dem i 70 % ethanol og derefter tørre dem tørre.
2. Pipette 2 ml fibroblastmedium i en petriskål, hvor vævsdissektionen udføres.
3. Pipette 2,5 ml fibroblastmedium i to T25-kolber. Kolberne hvirvles rundt, så det lille mediumvolumen dækker hele overfladen.
4. Transporter den høstede hudbiopsi fra operationsstuen til laboratoriet på is i kold, steril vævsoverførselsopløsning (se materialetabellen) eller 0,9 % NaCl i et sterilt plastrør.
5. Åbn røret med vævet inde i vævskulturhætten. Tag biopsien ud af røret ved hjælp af den steriliserede tang og læg den i petriskålen (figur 2A).
6. Undersøg visuelt biopsien for at identificere de tre hudlag, epidermis, dermis og subkutant fedt. Kig efter en genkendelig hudoverflade, nogle gange med synligt hår, for at identificere epidermis. På den modsatte side skal du kigge efter det subkutane fedt, som ofte er gult og slimet. Identificer laget mellem epidermis og det subkutane fedt som dermis-kilden til levedygtige fibroblaster (figur 2B).
7. For at isolere fibroblaster fra dermis skal du fjerne de to andre lag og placere vævet på sin side, så alle tre lag er synlige.
   BEMÆRK: I modsætning til aortavævet kan hudlagene ikke trækkes fra hinanden; derfor skal de skæres. Vævet er også mere gummiagtigt, hvilket gør det vanskeligere at skære. Brug en skarp skalpel.
8. Hold vævet nede med tang. Skær parallelt med grænsen mellem epidermis og dermis. Skær hele epidermis væk. Prøv at skære i en ren linje og bevæg dig ikke frem og tilbage for at undgå vævsskade.
9. Vend vævet. Gentag den samme procedure som i trin 2.8; denne gang skæres inden for dermis parallelt med grænsen med det subkutane fedt.
10. Når dermis er isoleret, skæres vævet i terninger ca. 1 x 1 x 1 mm³. Tryk vævet ned med tang og skær vævet i en retning ved hjælp af skalpellen. Skær ikke frem og tilbage; lav rene, ensrettede snit for at minimere skader. Prøv at lave så mange terninger som muligt i betragtning af biopsiens størrelse (figur 2C).
11. Vævsstykkerne anbringes i den øverste fjerdedel af T25-kolben ved hjælp af tangen. Kolbe anbring 10-20 terninger pr. kolbe, hvis mængden af materiale tillader det (figur 2D).
    BEMÆRK: Brug glatte tang for at minimere vævets vedhæftning til tangens ribben og let løsne vævet i kolben.
12. Udrubbere vævsterningerne i T25-kolberne i ca. 10 dage ved 5 % CO₂ ved 37 °C i en inkubator.
    BEMÆRK: Første celleudvækst forventes omkring da. De celler, der oprindeligt migrerer, kan se mindre ud end normale fibroblaster.
13. Når cellevæksten er observeret, tilsættes 2,5 ml medium til kolben, og sørg for ikke at pipette den på vævsstykkerne for at forhindre dem i at løsne sig.
14. Efter ca. 5 dage mere, når klynger af celler kan observeres omkring vævsstykkerne, ændres kulturmediet. Hvis vævsstykker løsnes, skal du fjerne dem, da de ikke vil sætte sig fast igen.
15. Når cellerne er 80-90% sammenflydende, overføres de til en T75-kolbe og fortsætter med at dyrke i dette format.
    BEMÆRK: Et splitforhold på 1:2 eller 1:3 anbefales. Frys en sikkerhedskopi af cellerne ved en tidlig passage. Cellerne opretholder generelt deres egenskaber indtil passage 10; senere passager bør ikke bruges til eksperimenter.

3. Måling af sammentrækning (f.eks. SMC'er)

1. Forbered et 96w10e ECIS-array (se figur 3A for et repræsentativt billede af arrayet med forstørrede elektroder og celler podet på elektroderne).
   BEMÆRK: Udfør følgende trin under en steril vævskultur laminær flowhætte.
   1. Belæg et sterilt 96w10e array med 200 μL 10 mM L-cystein pr. Brønd i 30 minutter ved stuetemperatur.
   2. Vask pladen to gange med sterilt vand. Lad pladen tørre natten over i vævskulturhætten med låget let åbent.
      BEMÆRK: Belægning af pladen med L-cystein er kun nødvendig, når du bruger pladen for første gang.
   3. Næste dag skal du UV-sterilisere plade og låg i 30 min. Vend låget opad, så indersiden steriliseres. Når pladen er steriliseret, må du ikke åbne pladen uden for flowhætten.
2. Såning af celler på ECIS-arrayet
   1. Forvarm 1% steril gelatineopløsning i vandbadet i 30 min.
      BEMÆRK: Opløsningen opbevares i køleskabet og kan størkne, hvilket gør det vanskeligt at pipette.
   2. Derefter overtrækkes brøndene med 100 μL af 1 % gelatineopløsning pr. brønd, og pladen inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time.
   3. Aspirer gelatinen fra brøndene.
   4. Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller og frø SMC'erne i tre eksemplarer med en såningstæthed på 30.000 celler / brønd i 200 μL SMC-medium.
   5. Anbring pladen sammen med SMC'erne i ECIS 96-brøndholderen i cellekulturinkubatoren. Dobbeltklik på ECIS Applied Biophysics-softwaren for at åbne programmet, og tryk på knappen Opsætning .
   6. Kontroller, om alle elektroderne har kontakt med holderen (grøn; rød, hvis der ikke er forbindelse) i venstre nederste panel mærket Brøndkonfiguration. Hvis elektroderne ikke er korrekt tilsluttet, skal du justere pladen i holderen, inden målingen påbegyndes.
   7. Vælg pladetypen (96-brønds matrix) i det samme panel ved at klikke på Matrixtype.
   8. I højre øverste panel Opsætning af dataindsamling skal du klikke på enkeltfrekvens og ændre impedansværdien til 4000 Hz og intervallet til 8 s.
   9. Klik på Start-knappen for at starte målinger. Vent på, at et nyt panel åbnes, hvor ECIS-filen kan gemmes.
   10. Lad cellerne fastgøre og etablere et monolag i 48 timer.
       BEMÆRK: Fastgørelsen og spredningen af celler på elektroderne genererer en basismodstandsværdi (figur 3B).
3. Stimulering af celler for at fremkalde sammentrækning
   1. Inducer SMC-sammentrækning ved at stimulere cellerne med 10 μg/ml calciumionofor, ionomycin.
      BEMÆRK: Ionomycin vil fremkalde tilstrømningen af ekstracellulær Ca²⁺, der aktiverer den kontraktile kaskade; Se figur 4A for repræsentative billeder af ikke-stimulerede og stimulerede kontraherede celler.
   2. 1 mg ionomycinpulver fortyndes i 100 μL dimethylsulfoxid til en stamopløsning på 10 mg/ml, og der opbevares 10 μL alikvoter ved -20 °C. Før brug fortyndes ionomycinopløsningen 1:10 i SMC-medium for at forberede den arbejdsløsning, der skal tilsættes cellerne.
   3. Udfør cellestimuleringen, mens arrayet stadig er i arrayholderen inde i cellekulturinkubatoren, og elektroderne er fastgjort til systemet.
      1. For at stimulere cellerne skal du fjerne låget og placere det på en steril overflade inde i inkubatoren. Forbered to pipetter, indstillet til 2 μL og 150 μL.
      2. Før du starter stimuleringen, skal du trykke på Mark i softwaren og placere en kommentar.
         BEMÆRK: Dette vil gøre det lettere at finde den nøjagtige timing af stimuleringen, når dataene analyseres.
      3. Pipette 2 μL af ionomycin-arbejdsløsningen i hver brønd så hurtigt som muligt. Når alle cellerne er blevet stimuleret, blandes mediet i brøndene ved hjælp af den anden pipette.
         BEMÆRK: På grund af de hurtige virkninger er det ikke nødvendigt at ændre tip mellem forskellige cellelinjer og betingelser. Arbejd hurtigt, mens du stimulerer og blander, fordi ionomycin har en akut effekt. Når du stimulerer en fuld plade, stimuleres maksimalt 3 søjler på én gang. Efter hver stimulering skal du vente mindst 30 minutter til den næste stimulering for at lade cellerne komme sig efter temperaturen og CO_{2 -} ændringen forårsaget af åbningen af inkubatordøren.
      4. Umiddelbart efter at stimuleringen er færdig, skal du trykke på Mark igen for at tilføje en kommentar om, at stimuleringen er udført.
   4. Afslutning af stimuleringseksperimentet
      1. Optag impedansværdierne i ca. 5 minutter efter ionomycinstimuleringen. Afslut optagelsen ved at trykke på Udfør.
      2. Genbrug ECIS-arrays op til tre gange: vask brøndene to gange med sterilt vand, og inkuber pladen ved 37 °C i 2-3 timer med trypsin eller et lignende reagens. Gentag trin 3.1.2 og 3.1.3.
4. Eksport af dataene
   1. Hvis du vil eksportere dataene, skal du klikke på | Eksportér | data Til Excel (valgt). Vælg en mappe for at gemme filen.
   2. Klik på Adskil , når programmet beder om at kombinere eller adskille ark.
5. Analyse af det kontraktile output
   1. For at beregne det kontraktile respons skal du bruge følgende ligning (1), hvor C angiver sammentrækning (udtrykt i % af ændringen i forhold til baseline), præstimulering (PrS) angiver modstandsværdien (udtrykt i Ω) lige før ionomycinstimulering og poststimulering (PoS) angiver modstanden (udtrykt i Ω) 2 minutter efter afslutningen af stimuleringen.
      (1)
      BEMÆRK: Som vist i ligning (1) trækkes impedansværdien af en brønd fyldt med dyrkningsmedium uden tilknyttede celler (værdi på 290 Ω) fra alle resultaterne i den endelige beregning. Det anbefales at måle kontraktile responser i tre eksemplarer i hvert forsøg og udføre tre uafhængige eksperimenter med den samme cellelinje for at tage højde for enhver inter- og intraeksperimentel variation.
   2. Når de tre uafhængige eksperimenter er udført, grupperes dataene sammen ved at beregne gennemsnittet af de tre målinger, herunder standardafvigelsen (SD).
6. Sammenligning af forskellige grupper
   1. For at definere rækkevidden af normal sammentrækning og undersøge efterfølgende specifikke forskningsspørgsmål skal du bruge kontrolgruppen til at definere "normal sammentrækning" og sammenligne den med det kontraktile respons hos patienter eller behandlingsgrupper.
   2. Beregn middelværdien og SD for hele kontrolgruppen, dvs. slutværdierne for alle cellelinjer, som beskrevet i trin 3.5.2.
   3. Brug intervallet for middelværdien ± 2SD til at identificere celler i den anden gruppe, der falder uden for dette område, hvilket indikerer, at de har et ændret kontraktilt respons.
      BEMÆRK: Mekanismen bag det ændrede kontraktile respons er underlagt specifikke forskningsspørgsmål og er celle- og tilstandsafhængig og vil ikke blive diskuteret i denne protokol.

4. Påvisning af tilstedeværelsen af SMC-specifikke markører

1. RNA-isolering
   1. Frø de samme patientspecifikke cellelinjer, der anvendes til sammentrækningsmålingerne i 6-brøndsplader, en brønd pr. Cellelinje. Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller og frø cellerne med en såningstæthed på 200.000 celler / brønd i SMC-medium og lad dem fastgøre natten over.
   2. Vask cellerne en gang med steril PBS.
   3. Lys cellerne og isoler cellerne i henhold til producentens anvisninger.
2. cDNA-syntese
   1. Udfør cDNA-syntese i 20 μL af en omvendt transkriptionsreaktionsblanding. Fortynd koncentrationerne af totalt isoleret RNA i henhold til producentens anvisninger.
3. qPCR
   1. Mål genekspressionen af SMC-markørgener, f.eks. ACTA2, CNN1, SMTN og TAGLN for at bekræfte, at de isolerede celler faktisk er SMC'er og detektere SMC-markører. Kontroller for korrelation mellem resultaterne og den kontraktile udgang.
   2. Brug mindst to husholdningsgener til at normalisere dataene, f.eks. YWHAZ og TBP.
      BEMÆRK: QPCR-kørslen og analysen kan udføres ved hjælp af forskellige PCR-maskiner og kompatibel software, afhængigt af hvad der er tilgængeligt og optimeret i laboratoriet. Se supplerende tabel S1 for primersekvenser.

Representative Results

For at teste reproducerbarheden af denne metode blev metoden først valideret udelukkende ved hjælp af SMC'er til kontrol. For at bestemme reproducerbarheden af intereksperimental måling blev to uafhængige målinger af alle inkluderede kontrol- og patientcellelinjer afbildet som et Bland-Altman-plot (figur 3B). Plottet viste, at denne metode ikke viser variabilitet uden for konfidensintervallet, bortset fra en afvigende cellelinje. Desuden viste disse resultater, at to brønde, der er podet inden for det samme eksperiment og stimuleret samtidigt, viser praktisk talt den samme kontraktile responskurve (figur 4C). For at validere, om det viste respons er sammentrækning og ikke osmotisk stress på grund af ionomycinstimulering, blev mediet udskiftet efter stimulering, og cellernes opførsel blev registreret. Dette viser, at de stimulerede celler begyndte at sprede sig over elektroden igen (figur 4D).

Som den første anvendelse af denne nye metode er det kontraktile respons i SMC'er afledt af raske, ikke-udvidede aortas (n = 6) og abdominal aortaaneurisme (AAA) patienter (n = 21; Figur 5A) blev målt, som vist tidligere⁸. Kontrolgruppens medianrespons var 61 % (46-77 %) sammenlignet med medianresponsen, 52 % (15-75 %) af patientgruppen. Værdierne var ikke signifikant forskellige, og der blev bemærket en højere variabilitet i patientgruppen. På grund af metodens nyhed blev kontrolgruppen brugt til at bestemme "normal" sammentrækning. Figur 5B viser middel- og ± 2SD-området, og hvordan dette interval bruges til at identificere fire patienter, der har lavere sammentrækningsværdier end de "normale" værdier. Bestemmelse af årsagen til nedsat sammentrækning er målet med en separat mekanistisk undersøgelse. En vestlig botanalyse blev udført for at afgøre, om SMC, der blev brugt til eksperimentet, udtrykker SMC-kontraktile markører. Western blot-analysen (figur 6A) og den efterfølgende kvantificering (figur 6B) bekræfter, at cellerne udtrykker SMC-markører. Markørudtrykket i hele grupperne var variabelt og korrelerede ikke med det kontraktile output. For at bestemme SMC's proliferative kapacitet blev qPCR for Ki67 udført (figur 6C). Ki67-ekspression kunne påvises i alle celler, men korrelerede ikke med det kontraktile output.

Figur 1: SMC-isolering fra aorta AAA-væv. A) Materialer, der er nødvendige for SMC-isolering fra aortavæv: aortavæv i en petriskål, SMC-medium, to T25-kolber fyldt med SMC-medium, skalpel og to par kirurgiske tang. (B) Intim side af aortavæggen, der viser aterosklerotiske plaques. (C) Adventitial lag af aortavæggen. (D) Adskillelse af tunika media og tunica adventitia ved at trække med tangen. (E) Efter at tunikamediet er isoleret, skæres vævet i små stykker ved hjælp af tang og skalpellen. F) Vævsstykker anbragt i T25-kolben. Forkortelser: AAA = abdominal aortaaneurisme ; SMC = glat muskelcelle. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Fibroblastisolering fra dermalt væv. (A) Materialer, der er nødvendige for fibroblastisolering fra dermalt væv: dermalt væv i en petriskål, fibroblastmedium, to T25-kolber fyldt med fibroblastmedium, skalpel og to par kirurgiske tang. (B) Hudbiopsi, der viser subkutant fedt på oversiden. (C) Når dermis er isoleret, skæres vævet i små stykker ved hjælp af tang og skalpellen. D) Vævsstykker anbragt i T25-kolben. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: ECIS-pladeopsætning og grafisk gengivelse af Aorta-SMC-sammentrækning. (A) Venstre; en ECIS-plade med 96 brønde. Midten; forstørrelse af en brønd på ECIS-pladen, der viser de ti elektroder i bunden af brønden. Ret; lysmikroskopbillede af de SMC'er, der er podet på ECIS-pladen forstørrelse 10x. (B) Modstandskurver målt ved ECIS efter såning af kontrol-SMC'er i tre eksemplarer. Tyk blå linje repræsenterer gennemsnittet af tredoblingen, og prikkede linjer repræsenterer triplikaternes SD. I de første 4-5 timer efter såning spredes SMC'er ud over hele overfladen, og høj modstand (~ 1000 Ω) måles. Når et stabilt SMC-monolag er dannet, reduceres modstanden over tid til omkring 500 Ω. Dette tal er ændret fra ⁸. Forkortelser: ECIS = elektrisk celle-substrat impedansføling; SMC = glat muskelcelle; SD = standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Måling af SMC-sammentrækning ved hjælp af ECIS. (A) Venstre; SMC-monolag af kontrol-SMC'er før stimulering til sammentrækning. Ret; kontrollere SMC'er efter stimulering til sammentrækning. Forstørrelse 10x. (B) Forskelsplot, der viser reproducerbarhed mellem oplevelser mellem to separate sammentrækningsmålinger. Prikkede linjer repræsenterer 95% konfidensintervallet, og den tykke mediale linje repræsenterer gennemsnittet af to intereksperimentale målinger. Hvert datapunkt repræsenterer afvigelsen fra gennemsnittet af to uafhængige målinger af hele datasættet af kontroller og patienter (lilla ●; n = 27). C) Intraeksperimental reproducerbarhed af ECIS-sammentrækningsmålinger. Modstandskurver genereret af kontrol SMC podet i to brønde. Lodret prikket linje markerer stimuleringen. (D) Cellegendannelse efter stimulering af sammentrækning. Tyk blå linje repræsenterer modstandsværdien af en ustimuleret kontrol-SMC. Prikket blå linje repræsenterer modstandsværdien af den samme kontrol-SMC-linje efter stimulering markeret med den lodrette prikkede sorte linje. Ca. 1 time efter stimulering (tyk lodret prikket sort linje) blev mediet under begge forhold opdateret for at fjerne stimulansen, og genopretningen af cellerne blev sporet i yderligere 3,5 timer. Modstandsværdier blev normaliseret til værdierne prestimulation for at overvåge cellernes opførsel efter stimulering. Dette tal er ændret fra ⁸. Forkortelser: ECIS = elektrisk celle-substrat impedansføling; SMC = glat muskelcelle. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: SMC-sammentrækning i kontrol og AAA-patienters SMC'er ved ionomycinstimulering. (A) Gennemsnitlig kontraktil respons af kontrol (blå ●; n = 6) og AAA-patient (rød ●; n = 21) SMC'er ved ionomycinstimulering afledt af flere eksperimenter. (B) Gennemsnitlig kontraktil respons af kontrol (blå ●; n = 6), normal kontrahering (rød ●; n = 15) og lav kontrahering (rød ●; n = 6) AAA-patienters SMC'er afledt af flere eksperimenter. Sammentrækning udtrykkes i procentdele af fald sammenlignet med baselineværdi før stimulering. Vandret sort linje repræsenterer den gennemsnitlige kontraktile reaktion fra kontrol-SMC'er. Prikkede vandrette linjer markerer to SD'er over og under gennemsnittet af kontrolgruppen. Den lave kontraherende gruppe defineres som sammentrækning lavere end to SD'er under gennemsnittet af kontrolgruppen. Boxplot vises som median med rækkevidde. Dette tal er ændret fra ⁸. Forkortelser: AAA = abdominal aortaaneurisme; ECIS = elektrisk celle-substratimpedansføling; SMC = glat muskelcelle; SD = standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: SMC-markørudtryk. SMC-kontraktile og proliferative markører blev analyseret i SMC for kontrol (Δ; n = 6), normal kontrahering (●; n = 15) og lav kontrahering (○; n = 6). (A) Western blot-analyse af SMC, der blev anvendt til sammentrækningsforsøgene. aSMA, calponin og SM22 blev kvantificeret, og Tubulin blev brugt som belastningskontrol. (B) Kvantificering af western blot afbildet i (A). C) qPCR-analyse af Ki67-spredningsmarkøren. Dette tal er ændret fra ⁸. Forkortelser: SMC = glat muskelcelle; aSMA = alfa Smooth Muscle Actin; qPCR = kvantitativ PCR. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel S1: Grundsekvenser. Frem og tilbage qPCR-primersekvenser af analyserede husholdnings- og SMC-markørgener. Denne tabel er ændret fra ⁸. Forkortelser: SMC = glat muskelcelle; qPCR = kvantitativ PCR. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Dette papir præsenterer en metode til måling af SMC-sammentrækning in vitro, baseret på ændringerne i impedans og overfladebesættelse. For det første beskrives isolering, dyrkning og udvidelse af patientspecifikke primære humane SMC'er og hudfibroblaster, efterfulgt af hvordan man bruger dem til sammentrækningsmålinger.

En begrænsning af undersøgelsen er relateret til opnåelse af cellerne gennem en eksplantprotokol. De celler, der formerer sig fra biopsien, kan have andre egenskaber end det oprindelige væv in vivo. Derudover er de explant-protokoller, der præsenteres her, ikke innovative, men er inkluderet for at præsentere en komplet arbejdsgang fra i dette tilfælde patientspecifikt aortaaneurismemateriale til sammentrækningsmålinger. Dyrkning af cellerne in vitro kan også påvirke nogle af deres egenskaber på grund af manglen på systemiske faktorer og forskellig substratstivhed. Dette kan forklare variationen i SMC-markørudtryk. På grund af fraværet af pålidelige fibroblastmarkører skelnes fibroblaster normalt ud fra fraværet af markører sammenlignet med andre celler. Vi har således ikke karakteriseret fibroblasterne isoleret med denne protokol. En anden begrænsning er, at måling af sammentrækning som en faktor på overfladen forbliver noget indirekte. De mulige konsekvenser er, at outputtet kommer fra gennemsnittet af responsen fra hele brønden, der indeholder tusindvis af celler. Det kan således ikke bestemmes, om alle celler kontraherer mindre, eller om der er celler, der sænker gennemsnittet.

SMC-kontraktilitet blev tidligere undersøgt ved hjælp af forskellige teknikker. Sammenlignet med trækkraftmikroskopi⁴ har ECIS flere fordele, primært højere gennemstrømning og tidseffektivitet. Som anført i begrænsningerne er afvejningerne, at sammentrækningsmålingerne opnås indirekte, hvilket gør ECIS mere egnet til screening af et større antal cellelinjer og grupper og måling af trækkraft til mere dybtgående enkeltcellemekanistiske undersøgelser. Calciumgradienter⁶ blev tidligere anvendt som indikatorer for sammentrækning; ECIS giver en mere pålidelig sammentrækningsmåling, da den måler cellens bevægelse. Kvantificering af billeder af kollagenrynker forårsaget af sammentrækningen af cellerne podet inde i gel⁵ giver et gennemsnit af hele populationen af frøede celler, svarende til ECIS. De målinger, der opnås gennem ECIS, er imidlertid langt mere præcise og giver realtidsovervågning under hele observationsforløbet, hvilket gør dem betydeligt mere informative.

Afslutningsvis beskriver dette papir en ny ansøgning om ECIS-systemet, som kan bruges til at måle sammentrækningen af klæbende celler, såsom SMC'er og fibroblaster. Denne metode kan bruges til at studere flere cellelinjer rettidigt og effektivt, hvilket gør den velegnet til patient- eller lægemiddelscreening. I tråd med forskning i aortaaneurismer kan denne metode også bruges til at screene SMC'er hos patienter med andre hjerte-kar-sygdomme, såsom dissektioner og åreforkalkning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Array	Applied Biophysics	96W10idf PET	Array used to measure contraction in the ECIS setup
Custodiol	Dr. Franz Höhler Chemie GmbH	RVG 12801	Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301	Solution used to dilute ionomycin
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140079	Addition to cell culture medium
Ham's F-10 Nutrient Mix	Gibco	11550043	Medium used to culture skin fibroblasts
Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'')	Gibco	M231500	Medium used to culture smooth muscle cells
Invitrogen countess II	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	Compound used for contraction stimulation
NaCl 0.9%	Fresenius Kabi	B230561	Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotics used for cell culture medium
Phospathe buffered saline	Gibco	10010023	Used to wash cells
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055	Kit used for RNA isolation
Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)	Gibco	S00725	Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	11754250	Kit used for cDNA synthesis
SYBR Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4309155	Reagent for qPCR
Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054	Used to trypsinize cells
ZTheta	Applied Biophysics	ZTheta	ECIS instrument used for contraction measurements