Summary
Denne artikkelen presenterer en metode for romlig analyse av mobil, enkeltmolekyl Förster resonans energioverføring (smFRET)-baserte sonder ved hjelp av widefield fluorescensmikroskopi. Det nyutviklede programvareverktøysettet gjør det mulig å bestemme smFRET-tidsspor for bevegelige sonder, inkludert riktig FRET-effektivitet og molekylære posisjoner, som tidsfunksjoner.
Abstract
Single-molekyl Förster resonans energioverføring (smFRET) er en allsidig teknikk som rapporterer om avstander i sub-nanometeret til nanometerområdet. Det har blitt brukt i et bredt spekter av biofysiske og molekylære biologiske eksperimenter, inkludert måling av molekylære krefter, karakterisering av konformasjonsdynamikk av biomolekyler, observasjon av intracellulær kolokalisering av proteiner og bestemmelse av reseptor-ligand interaksjonstider. I en widefield mikroskopikonfigurasjon utføres eksperimenter vanligvis ved hjelp av overflate-immobiliserte sonder. Her presenteres en metode som kombinerer sporing av enkeltmolekyler med vekslende eksitasjonseksitasjon (ALEX) smFRET-eksperimenter, som tillater oppkjøp av smFRET-tidsspor av overflatebundne, men mobile sonder i plasmamembraner eller glassstøttede lipid-bilayers. For analyse av registrerte data ble det utviklet en automatisert programvaresamling med åpen kildekode som støtter (i) lokalisering av fluorescerende signaler, (ii) enkeltpartikkelsporing, (iii) bestemmelse av FRET-relaterte mengder, inkludert korreksjonsfaktorer, (iv) streng verifisering av smFRET-spor og (v) intuitiv presentasjon av resultatene. De genererte dataene kan enkelt brukes som innspill til videre utforskning via spesialisert programvare, for eksempel for vurdering av sondenes diffusjonsadferd eller undersøkelse av FRET-overganger.
Introduction
Förster resonans energioverføring (FRET) har vært en stor driver i molekylær biologisk og biofysisk forskning, da det tillater undersøkelse av prosesser ved sub-nanometeroppløsning. Ettersom effektiviteten av energioverføring mellom donor og akseptorfluoreforer sterkt avhenger av interfargeavstanden i sub-nanometeret til nanometerområdet, har det effektivt blitt brukt som en spektroskopisk hersker for å utforske statisk og dynamisk konformasjon av biomolekyler1,2,3,4. I tillegg har FRET-fenomenet blitt mye brukt til colokaliseringsstudier av membranrelaterte og intracellulære proteiner på et bulknivå5,6. I løpet av de siste to tiårene ble metoden tilpasset overvåking av smFRET-hendelser7, noe som bidro til å øke tidsmessig og romlig oppløsning betydelig og løste selv sjeldne subpopulasjoner i heterogene prøver. Utstyrt med disse teknikkene ble det oppnådd unik innsikt i dynamikken i molekylære maskiner som transkripsjonsbehandlingshastigheten til RNA polymerase II8, replikeringshastigheten til DNA-polymeraser9,10, nukleossomtranslokasjonshastighet11, transkripsjonsspleise og stalling rate av monterte skjøteosomer12, aktiviteten til ribosomale underbefolkninger13, og ganghastigheten til kinesinmotorer14 , for å nevne noen. Reseptor-ligand interaksjon varigheter15 og molekylære krefter16 har blitt kvantifisert.
Intensitetsbaserte smFRET-studier er vanligvis avhengige av sensibilisert utslipp for å måle FRET-effektivitet: En strålesplitter i utslippsbanen skiller lys som stammer fra donor- og akseptorfluoforer ved donoreksitasjon, noe som muliggjør kvantifisering av individuelle fluorescensintensiteter. Effektiviteten kan deretter beregnes som brøkdelen av fotoner som slippes ut av akseptoren med hensyn til det totale fotontallet17. I tillegg tillater akseptoreksitasjon etter donoreksitasjon (ALEX) måling av stoichiometrien til FRET-hendelsene, noe som bidrar til diskriminering mellom ekte lave FRET-signaler fra signaler som oppstår, for eksempel fra sonder med fotobleached acceptor fluorophore18.
Ettmolekyls FRET-eksperimenter utføres vanligvis på en av to måter. For det første lyser en liten region i prøvevolumet ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Enkelt sondemolekyler i løsning er begeistret når de tilfeldigvis diffuserer innenfor brennvidden. Med denne teknikken kan raske fotontellingsdetektorer brukes, noe som muliggjør tidsoppløsning under mikrosekund. For det andre er sonder spesielt immobilisert på overflater og overvåket via widefield mikroskopi, ofte ved hjelp av total intern refleksjon (TIR) konfigurasjon for å minimere bakgrunnsfluorescens. Sonde immobilisering gir mye lengre opptakstider enn å bruke den første tilnærmingen. I tillegg tillater det større synsfeltet overvåking av flere sonder parallelt. Behovet for et kamera gjør denne metoden treg sammenlignet med den som er beskrevet ovenfor. Tidsoppløsningen er begrenset til millisekunder til andre område.
Hvis det kreves lange tidsspor, for eksempel for å studere dynamiske prosesser på en millisekunder til andre tidsskala, er den første metoden ikke anvendelig, da fluorescensutbruddene vanligvis er for korte. Den andre tilnærmingen mislykkes når immobilisering ikke er mulig, for eksempel i live-celle eksperimenter med sonder som sprer seg i cellemembranen. Videre har det blitt observert at biologiske modellsystemer kan variere responsen dramatisk avhengig av mobiliteten til den kontaktede overflaten16.
Mens kombinerte smFRET- og enkeltpartikkelsporingseksperimenter som registrerer mobile FRET-sonder har blitt utført i løpet av de siste 19, er det ingen offentlig tilgjengelig programvare for evaluering av dataene. Dette førte til utviklingen av en ny analyseplattform, som muliggjør bestemmelse av flere egenskaper til mobile fluorescerende sonder, inkludert smFRET effektivitet og stoichiometri, posisjoner med underpikselnøyaktighet og fluorescensintensiteter som tidsfunksjoner. Metoder for filtrering av de resulterende sporene ved å undersøke trinnvis blekingsadferd, nærmeste naboavstander, utslippsintensiteter og andre egenskaper ble etablert for utelukkende å velge riktig syntetiserte og funksjonelle enkeltsondemolekyler. Programvaren støtter også eksperimentelle og analytiske teknikker som nylig ble avtalt i en multilaboratorisk studie for å produsere pålitelige, kvantitative smFRET-data17. Spesielt overholder implementeringen de validerte prosedyrene for beregning av FRET-effektivitet og stoichiometri. Fluorescensintensiteter ved donoreksitasjon i donorutslippskanalen IDD og akseptorutslippskanalen IDA brukes til beregning av den tilsynelatende FRET-effektiviteten Eapp ved hjelp av Eq (1).
(1)
Ved hjelp av fluorescensintensiteten i akseptorutslippskanalen ved akseptoreksitasjon IAA beregnes den tilsynelatende stoichiometrien ved hjelp av Eq (2).
(2)
FRET effektivitet E og stoichiometri S kan avledes fra Eapp og Sapp ved å vurdere fire korreksjonsfaktorer.
α beskriver lekkasjen av donorfluorescens inn i akseptorutslippskanalen og kan bestemmes ved hjelp av en prøve som bare inneholder donorfluoriforer eller ved å analysere deler av baner der akseptoren har blitt bleket. δ korrigerer for direkte eksitasjon av akseptoren av donoreksitasjonslyskilden og kan måles ved hjelp av en prøve med bare akseptorfluoforer eller ved å analysere deler av baner der donoren har blitt bleket.
.
γ skalerer IDD for å rette opp avvikende deteksjonseffektivitet i donor- og akseptorutslippskanaler og forskjellige kvanteeffektiviteter hos fluoroforene. Faktoren kan beregnes ved å analysere økningen i donorintensitet ved akseptorbleking i baner med høy FRET-effektivitet20 eller ved å studere et utvalg med flere diskrete FRET-tilstander.
β skalerer IAA for å korrigere for ulik effektivitet av donor- og akseptoreksitasjon. Hvis γ ble bestemt via akseptorblekingsanalyse, kunne β beregnes ut fra et utvalg av kjent donor-til-akseptor ratio21. Ellers gir FRET-utvalget med flere tilstander også β.
Sammen tillater rettelsene beregningen av den korrigerte FRET-effektiviteten ved hjelp av Eq (3).
(3)
og riktig stoichiometri ved hjelp av Eq (4).
(4)
Ideelt sett gir korrigert stoichiometri for et 1: 1 donor-til-akseptorforhold S = 0,5. I praksis gir et redusert signal-til-støy-forhold en spredning av de målte verdiene til S, noe som hemmer diskrimineringen fra donorsignaler (S = 1) og akseptor-bare signaler (S = 0). De resulterende tidssporene kan brukes som inngang for en mer detaljert analyse av enkeltmolekylets baner for å skaffe informasjon som romlige kraftprofiler16, mobiliteten til enkeltmolekylhendelsene22, eller overgangskinetikk mellom forskjellige tilstander1.
Følgende protokoll beskriver eksperimentelle parametere og prosedyrer for smFRET-sporingseksperimenter, samt arbeidsprinsippet bak dataanalyse ved hjelp av den nyutviklede programvarepakken. For innsamling av eksperimentelle data anbefales det å bruke et mikroskopioppsett som oppfyller følgende krav: i) evne til å oppdage utslipp av enkeltfargemolekyler; ii) widefield belysning: spesielt for live-celle eksperimenter, total intern refleksjon (TIR23,24,25) konfigurasjon anbefales; iii) romlig separasjon av utslippslys i henhold til bølgelengde slik at donor og akseptorfluorescens projiseres på forskjellige regioner i samme kamerabrikke25 eller forskjellige kameraer; iv) modulering av lyskilder for donor- og akseptoreksitasjon med millisekundpresisjon, for eksempel ved bruk av direkte modulatable lasere eller modulering via acoustooptiske modulatorer. Dette tillater stroboskopisk belysning for å minimere fotobleaching av fluoroforer samt vekslende eksitasjon for å bestemme stoichiometries; v) utgang av en fil per innspilt bildesekvens i et format som kan leses av PIMS Python-pakken26. Spesielt støttes TIFF-filer med flere sider.
Protocol
1. Forutsetninger for programvare
- Installer miniconda Python-distribusjonen27 (minimumskrav til Python-versjon: 3.7).
- Åpne en Anaconda-ledetekst i Start-menyen i Windows, eller åpne en terminal og utfør conda-aktivering hvis du bruker Linux eller macOS.
- Aktiver det fellesskapsvedlikeholdte conda-forge-pakkerepositoriet28 ved å utføre følgende kommandoer:
conda config --legge til kanaler conda-forge
conda config --set channel_priority streng
conda-oppdatering - alt - Installer de nødvendige Python-pakkene ved å utføre:
conda installere opencv trackpy lmfit ipympl scikit-lære pyqt sdt-python jupyterlab - Bli kjent med JupyterLab, brukergrensesnittet til analyseprogramvaren (se programvaredokumentasjonen29).
- Installer git versjonskontrollsystemet, som vil bli brukt senere for å laste ned og oppdatere analyseprogramvaren. Hvis du bruker Linux, kan du bruke distribusjonens pakkeadministrasjonsprogramvare til å laste ned og oppdatere. Ellers utfører du:
conda installere git - Du kan eventuelt installere sidevognen Python-pakken for å vise datasett etter filtreringstrinn under analysen:
conda installere sidevogn
2. Måling av prøver
Figur 1: Bildeanskaffelse. (A) Eksitasjonssekvens. Etter å ha spilt inn et valgfritt bilde av en fargebelastet celle ved hjelp av 405 nm laser, er donor og akseptor begeistret vekselvis og gjentatte ganger for belysningstid till ved hjelp av henholdsvis 532 nm og 640 nm lasere. Tiden mellom donor og akseptoreksitasjon må være lang nok til å tillate bildeavlesning av kameraet. Forsinkelsestiden tdelay kan brukes til å justere anskaffelsesrammen og derfor observasjonstidsrommet før fotobleaching. Dette panelet er modifisert fra 16. (B) Fiducial markører brukes til beregning av koordinattransformasjonene mellom de to utslippskanalene. Matchende fiducials er indikert etter farge. Flere forskjøvet bilder bør tas opp for å sikre at hele synsfeltet er dekket. (C) Laserprofiler for flatfeltkorrigering registreres ved hjelp av en tett merket prøve. Akseptorprofilen registreres og fotobleached, etterfulgt av oppkjøp av giverprofilen. Flere bilder bør tas i forskjellige utvalgsområder, i gjennomsnitt og utjevnes for å redusere påvirkningen av prøvefeil (f.eks. det lyse punktet i midten av bildet). (D) Flatfield korreksjonskart p(x,y) beregnet fra 20 laserprofil registrert som beskrevet i C. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverføring; ImDD = donorutslippsbilde ved donoreksitasjon; ImDA = akseptor utslipp bilde ved donor eksitasjon; ImAA = akseptor utslipp bilde ved donor eksitasjon. Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Når du bruker et elektron-multipliserende ladekoblingskamera (EMCCD), gjør det mulig for EM-forsterkningen å observere enkeltmolekylsignaler ved høye signal-til-støy-forhold (se produsentens instruksjoner).
- eksitasjonssekvens (se figur 1A for mer informasjon).
- Du kan eventuelt registrere et bilde for segmentering for å begrense dataanalysen til bestemte områder i synsfeltet. For eksempel begeistre Fura-2-lastede celler ved hjelp av en 405 nm laser og fange utslippet rundt 510 nm for å evaluere bare sonder plassert i grensesnitt mellom celler og støttede lipidbilayere (SLD). Vent derfor på at tiden tr tillater kameraavlesning.
MERK: På EMCCD-kameraer avhenger tr av antall linjer i det valgte interesseområdet (ROI). Derfor kan det være fordelaktig å velge en liten avkastning fordi det reduserer forsinkelsen mellom rammer og størrelsen på innspilte data. I tillegg gir aktivering av rammeoverføringsmodus mulighet for ytterligere reduksjon av tr. - Alternativt begeistre donor og akseptor fluorophores gjentatte ganger.
- Begeistre donoren for en belysningstid till (5-10 ms er vanligvis kort nok til å unngå bevegelsesuskarphet) samtidig som kameraet utløses.
- Vent til tiden tr tillater kameraavlesning.
- Fremtringe akseptoren for mens du utløser kameraet.
- Vent på et tidsinnlegg.
MERK: Dette må være lengre enn tr for å aktivere avlesning av kameraet, men kan ellers velges vilkårlig. Det skal balansere kravene til tidsoppløsning og sporlengde. - Gjenta trinn 2.2.2.1-2.2.2.4. Velg antall repetisjoner som skal være store nok til å sikre fotobleaching av minst en fluorofor per sonde innen synsfeltet, noe som tillater trinnvis fotobleaching analyse for diskriminering av enkeltmolekylssignaler fra aggregater.
MERK: Å velge passende till- og eksitasjonslaserintensiteter krever vanligvis litt eksperimentering: Jo lengre belysningstidene og jo høyere laserintensitetene er, jo bedre er signal-til-støy-forholdet i de resulterende bildene, men jo kortere er de resulterende tidssporene.
- Du kan eventuelt registrere et bilde for segmentering for å begrense dataanalysen til bestemte områder i synsfeltet. For eksempel begeistre Fura-2-lastede celler ved hjelp av en 405 nm laser og fange utslippet rundt 510 nm for å evaluere bare sonder plassert i grensesnitt mellom celler og støttede lipidbilayere (SLD). Vent derfor på at tiden tr tillater kameraavlesning.
- Ta opp et tilstrekkelig antall filmer for hvert eksempel.
3. Ytterligere målinger for bestemmelse av korreksjonsfaktorer
- Registrer en rekke tilfeldig plasserte fiducial markører som er synlige i begge utslippskanalene for bilderegistrering (dvs. finne transformasjonen som kartlegger koordinater av donorutslippskanalen til akseptorutslippskanalen og omvendt). Se figur 1B.
MERK: Bilderegistrering utføres av programvaren; se trinn 6.1.4. - Mål intensitetsprofilen for både donor- og akseptoreksitasjonslyskilder for flatfeltkorrigering (dvs. korrigering for inhomogen eksitasjon på tvers av synsfeltet). For dette formål, forbered en prøve med høy tetthet av FRET-sonder og først skaffe et bilde ved akseptoreksitasjon, etterfulgt av fotobleaching av akseptoren og påfølgende opptak av et bilde ved donoreksitasjon. For økt stabilitet gjentas flere ganger i forskjellige utvalgsområder. Se figur 1C,D. Alternativt kan du registrere en prøve dekorert med bare donormolekylet og en annen prøve dekorert med bare akseptorfluoreorene.
MERK: Flatfield korreksjon utføres av analyseprogramvaren; se trinn 8.1.2. - Registrer en enkeltmolekylprøve (som i avsnitt 2) av en sonde uten en akseptorfluofor for å bestemme donorutslipp som lekker ut i akseptorkanalen.
MERK: Donorlekkasje kan også beregnes fra de faktiske sondenes tidsspor etter at akseptorbleking er utført. Hvis et tilstrekkelig antall slike hendelser registreres, er det ikke nødvendig med ytterligere måling. Begge alternativene støttes av analyseprogramvaren; se Utfyllende informasjon pkt. 3.15. - Innhente opptak av en sonde uten donorfluofor for kvantifisering av direkte akseptoreksitasjon av donoreksitasjonslyskilden.
MERK: Direkte akseptoreksitasjon kan også avledes fra de faktiske sondenes tidsspor etter donorbleking. Hvis et tilstrekkelig antall slike hendelser registreres, er det ikke nødvendig med ytterligere måling. Begge alternativene støttes av analyseprogramvaren; se Utfyllende informasjon pkt. 3.15. - Registrer en enkeltmolekylprøve med to distinkte FRET-effektiviteter for å korrigere for forskjellig deteksjonseffektivitet av donor- og akseptorutslippskanalene og forskjellige kvanteutbytter av fargestoffene.
MERK: Slike prøver kan for eksempel være Holliday-veikryss1, som svinger mellom to konformasjoner, eller DNA-stenger som har FRET-par festet på forskjellige, veldefinerte avstander. Hvis sonder har høy og tilstrekkelig konstant FRET-effektivitet, kan korreksjonen også beregnes fra akseptorblekingshendelser av sonders tidsspor, i så fall er det ikke nødvendig med ytterligere målinger. Begge alternativene støttes av analyseprogramvaren; se Utfyllende informasjon pkt. 3.15.
4. Lokaliseringsalgoritmer for enkeltmolekyler
MERK: Flere analysetrinn krever lokalisering av enkeltmolekyler. Velg mellom en gaussisk tilpasningsalgoritme30 og massesenterberegning31, avhengig av signaltetthet, bakgrunn og signal-til-støy-forhold.
- For å utføre gaussisk tilpasning, velg 3D-DAOSTORM30-algoritmen via de respektive brukergrensesnittene.
MERK: 3D-DAOSTORM er designet for å skille jevne signaler med overlappende punktspredningsfunksjoner. Selv om dette generelt er en fordel, kommer det med en advarsel: enkle, lyse signaler identifiseres av og til som to tilstøtende, noe som kan forvirre sporingsalgoritmen og resultere i deteksjon av to korte baner i stedet for en enkelt lang.
Angi følgende parametere (se dokumentasjonen for sdt-python-biblioteket32, som gir algoritmens implementering).- radius: Angi den opprinnelige σ verdien av den gaussiske tilpasningsfunksjonen i piksler, avhengig av den effektive pikselstørrelsen.
-
terskelverdi: Angi en minimumsamplitude (dvs. den lyseste pikselverdien, korrigert for den estimerte lokale bakgrunnen) for at en lokal intensitet maksimalt skal passe.
MERK: Terskelen er uten tvil den viktigste parameteren. Hvis den settes for lavt, kan støy betraktes som et fluorescenssignal, og lyse signaler kan være utstyrt med to gaussianere. Hvis de er stilt inn for høyt, får ikke svake signaler plass. -
modell: Sett til 2d for å passe sirkulære gaussianere.
MERK: De andre modellene gjelder ikke for smFRET-dataene. -
finn filter: Påfør et filter før du finner lokal maxima for å redusere støy, noe som er nyttig i situasjoner med lavt signal-til-støy-forhold. Dette kan være i) identitet: ikke noe filter; ii) Crocker-Grier: bandpassfilter fra Crocker-Grier algoritme31,33; eller iii) Gaussian: en gaussisk uskarphet med σ angitt av sigmaparameteren.
MERK: For Crocker-Grier skal parameteren feat. size være omtrent radiusen til en punktspredningsfunksjon i piksler.
MERK: Montering utføres ved hjelp av ufiltrerte rådata. -
min. avstand: Monter to prospektive signaler atskilt med færre enn min. avstandspiksler med en enkelt gaussisk.
MERK: Dette kan hjelpe i det nevnte scenariet der et sterkt signal feilaktig oppdages som to tilstøtende signaler. - størrelsesområde: Velg minimum og maksimum σ av anfallene for å fjerne deteksjoner fra falske signaler på grunn av støy.
- Velg Crocker-Grier-algoritmen via de respektive brukergrensesnittene for å utføre masseberegning (en raffinert algoritme31 basert på Crockers og Griers idé33).
MERK: Denne algoritmen er veldig robust selv i lave signal-til-støy-scenarier og i håndtering av signaler med en rekke intensiteter, men kan ikke passe molekyler med overlappende punktspredningsfunksjoner nøyaktig.- radius: Angi radiusen (i piksler) på en disk som er stor nok til å inneholde funksjonen for hele punktoppslag.
-
signaltreske.: Angi minimum amplitude (lyseste piksel over beregnet bakgrunn) for en lokal intensitet maksimum som skal analyseres.
MERK: Hvis den settes for lavt, kan støy betraktes som et fluorescenssignal. Hvis de er stilt inn for høyt, får ikke svake signaler plass. -
mass thresh.: Angi den minste totale intensiteten (summen av bakgrunnskorrigerte bildepunktverdier) for et signal som skal analyseres.
MERK: Samme hensyn som ovenfor gjelder.
5. Initialisering av programvare
- Last ned analyseskript. I en Anaconda-ledetekst navigerer du til en mappe for å lagre analysen (ved hjelp av cd-kommandoen ) og utfører
git klone https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git målmappe- Erstatt målmappen med et beskrivende navn, for eksempel 2021-06-14_Force-FRET-eksperiment.
MERK: Analyseprogramvaren vil havne i denne mappen; kontroller at denne mappen ikke finnes på forhånd. Det anbefales å laste ned en kopi av analyseskriptene for hvert eksperiment. På denne måten er det mulig å gå tilbake til analysen senere, tilbakekalle parametrene som brukes, og gjøre endringer.
- Erstatt målmappen med et beskrivende navn, for eksempel 2021-06-14_Force-FRET-eksperiment.
- Kopier Jupyter-notatblokker (01. Sporing.ipynb, 02. Analyse.ipynb, 03. Plots.ipynb) i den nyopprettede mappen (heretter kalt rotmappen). Hvis dette er første gang du bruker programvaren, henter du dem fra notatblokkundermappen i rotmappen.
MERK: Hvis lignende datasett allerede er analysert, kan kopiering av notatblokkene fra et tidligere eksperiment være et praktisk alternativ, da parametere kanskje bare har endret seg litt. - Start JupyterLab-serveren ved å utføre følgende kommando i Anaconda-ledeteksten for å åpne et nettleservindu som viser JupyterLab.
jupyter lab
MERK: Nettleseren er bare grensesnittet, mens prosessen som kjører i Anaconda-ledeteksten gjør det faktiske arbeidet. Som en konsekvens av dette har lukking av nettleservinduet bare minimal effekt. Økten kan gjenopprettes ved å få tilgang til http://localhost:8888. Hvis du avbryter JupyterLab-prosessen i ledeteksten eller lukker ledeteksten, avsluttes imidlertid analysen, noe som fører til tap av arbeid som ikke er lagret. - I nettleservinduet JupyterLab bruker du den venstre ruten til å navigere til rotmappen. Dobbeltklikk på 01. Tracking.ipynb for å starte den første bærbare datamaskinen. Etter lansering, se etter en ny fane som skal vises, som viser bokser, såkalte celler, av Python-kode.
MERK: Alle Jupyter bærbare PC-er har kommentarer som beskriver funksjonaliteten til hver kodecelle. I tillegg kan dokumentasjon for hvert metodekall vises ved å plassere tekstmarkøren rett før åpningen ( og trykke SKIFT+TAB. - Se figur 2 for en oversikt over dataanalyseprosessen.
Figur 2: Oversikt over en typisk analyserørledning. Vær oppmerksom på at filtreringstrinn er gjenstand for tilpasning i henhold til eksperimentell design. Denne figuren er endret fra 16. Forkortelse: FRET = Förster resonans energioverføring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
MERK: Eksempeldata for å prøve ut programvaren kan lastes ned fra https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files
6. Lokalisering, sporing og fluorescensintensitetsanalyse av enkeltmolekyler (01. Sporing.ipynb).
- Bruk 01. Sporing.ipynb Jupyter bærbar PC for pålitelig analyse av fluorescensintensitetsverdier for enkeltmolekylsignaler, som er skreddersydd for presis kvantifisering, spesielt av svake signaler som ofte forekommer i FRET-målinger (f.eks. på grunn av lave donorsignaler ved høye FRET-hendelser og omvendt).
MERK: For dette formål implementeres direkte integrasjon av pikselintensitetene i rådataene med korreksjon for lokal bakgrunn. Hvis du vil se skjermbilder av hvert analysetrinn og beskrivelse av funksjonskallparametere, kan du se Tilleggsinformasjon.- Angi belysningssekvensen for å tillate valg av donor- og akseptoreksitasjonsrammer, samt rammer for bildesegmentering fra innspilte bildesekvenser.
MERK: Ettersom programvaren tillater behandling av data som er registrert med vilkårlige belysningsprotokoller, er det nødvendig å indikere hvilken ramme i en bildesekvens som ble anskaffet mens spennende hvilken type fluorofor; se Tilleggsinformasjon, avsnitt 1.2, trinn 3. Rammenumrene for den opprinnelige bildesekvensen beholdes. - Beskriv og last inn datasett. Analyser flere datasett samtidig, forutsatt at de ble registrert ved hjelp av de samme belysningsinnstillingene. Tilordne en identifikator og et mønster som samsvarer med de respektive bildesekvensfilnavnene, til hvert datasett. I tillegg kan du definere bestemte datasett for spesielle formål, for eksempel opptak av fiducial markører for bilderegistrering, eksitasjonslysprofiler for flatfeltkorrigering, og eventuelt bare donor- og akseptoreksempler for å bestemme korreksjonsfaktorer.
- Velg utslippskanaler i RAW-bilder hvis begge kanalene ble tatt opp med ett enkelt kamera. For dette, bruk riktig grafisk widget for å velge de aktuelle områdene for donor- og akseptorutslipp.
- Lokaliser fiducial markører i begge utslippskanaler og utfør bilderegistrering. Bruk det medfølgende brukergrensesnittet til å finne de riktige parameterne for lokaliseringsalgoritmen for både giver- og akseptorutslippskanalene. Se avsnitt 4 hvis du vil ha informasjon om støttede lokaliseringsalgoritmer.
MERK: Tilfeldig fordelte fiducial markører kan identifiseres på tvers av utslippskanaler ved romlig fordeling av sine nærmeste naboer (figur 1B). En tilpasset implementering av algoritmen foreslått for selektiv planbelysningsmikroskopi34 i sdt-python-biblioteket samsvarer automatisk med posisjonen til hver markør i donorutslippskanalen med posisjonen i akseptorutslippskanalen. En transformasjon T som kartlegger donorutslippskanalens koordinater til akseptorutslippskanalens koordinater finnes via en lineær minste kvadraters passform av en affintransformasjon til markørenes posisjoner35. RANSAC brukes til å ta høyde for outliers, for eksempel feil samsvarende posisjoner fra forrige trinn. - Lokaliser FRET-sonder uavhengig av donor- og akseptoreksitasjon i alle rammer, og flett resultatene i én tabell som inneholder det opprinnelige rammenummeret, todimensjonale koordinater og en identifikator som refererer til kildebildefilen.
MERK: For dette formål gir programvaren brukergrensesnitt for å finne passende alternativer for lokaliseringsalgoritmen.- Lokaliser FRET-sonder ved donoreksitasjon i summen av bildene hentet fra donorutslipp ImDD og akseptorutslipp ImDA, som knapt avhenger av FRET-effektiviteten. Hvis du vil ha informasjon om alternativene for lokaliseringsalgoritmen, kan du se avsnitt 4.
MERK: Hvert sumbilde beregnes ved å transformere ImDD ved hjelp av transformasjonen T tidligere hentet fra bilderegistrering og lagt pikselvis til ImDA. - Lokaliser sonder ved akseptoreksitasjon i akseptorutslippskanalen ImAA (se avsnitt 4 for detaljer om lokaliseringsalgoritmene).
- Lokaliser FRET-sonder ved donoreksitasjon i summen av bildene hentet fra donorutslipp ImDD og akseptorutslipp ImDA, som knapt avhenger av FRET-effektiviteten. Hvis du vil ha informasjon om alternativene for lokaliseringsalgoritmen, kan du se avsnitt 4.
- Utfør måling av sporings- og fluorescensintensitet.
- Angi belysningssekvensen for å tillate valg av donor- og akseptoreksitasjonsrammer, samt rammer for bildesegmentering fra innspilte bildesekvenser.
Figur 3: Måling av enkeltmolekylintensitet. (A) For en fluorofor som ligger ved den oransje pikselen, bestemmes den ukorrigerte intensiteten Iuncorr ved å summere alle pikslenes intensiteter i en disk (gule og oransje piksler) som er store nok til å dekke alle bildepunkter som påvirkes av signalet: 
. Den lokale bakgrunnen beregnes som gjennomsnittet av bildepunktene i en ring (blå bildepunkter) rundt disken: 
, der nring er antall bildepunkter i ringen. Fluorescensintensiteten I er resultatet av å trekke bakgrunnen fra den ukorrigerte intensiteten, I = Iuncorr - b × ndisk, der ndisk er antall piksler på disken. Sirkelradiusen angis via feat_radius parameteren for sporingsmetoden. Bredden på ringen er gitt av parameteren bg_frame. Hvis punktoppslagsfunksjonen til ett signal overlapper med bakgrunnsringen til et annet (nederste panel), utelates de berørte bildepunktene (rødt) fra lokal bakgrunnsanalyse. Hvis topunkts spredningsfunksjoner overlapper, kan ikke fluorescensintensiteter beregnes pålitelig og kastes derfor. (B, C) Simuleringer viser at bruk av en gaussisk uskarphet med et standardavvik på 1 piksel forbedrer signal-til-støy-forholdet opp til en faktor på nær 2 ved lave fluorescensintensiteter (B) og introduserer knapt noen feil (liten underestimering på mindre enn 1%, (C))16. Videre er den relative feilen (dvs. (Imeas - Itruth)/Itruth, hvor Itruth er grunnsannheten og Imeas er resultatet av analysen) konstant over hele intensitetsområdet og avbryter derfor for forholdsmetriske mengder som FRET-effektivitet og stoichiometries. Alle tomter er basert på tidligere publisert arbeid16. Forkortelser: SNR = signal-til-støy-forhold; FRET = Förster resonans energioverføring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Velg passende alternativer for trackpy36algorithm som brukes til å koble FRET-sondelokaliseringer til baner. Angi spesielt maksimal søkeavstand fra ett bilde til det neste og antall påfølgende rammer som et signal kan gå uoppdaget for, noe som kan oppstå på grunn av bleking eller tapte lokaliseringer.
MERK: Disse hullene fylles via interpolering mellom foregående og påfølgende posisjoner. Disse interpolerte posisjonene er merket og brukes først senere for å lese ut intensitetsverdier, men ikke for diffusjonsanalyse. Spor analyseres i koordinatsystemet til akseptorutslippskanalen. For fluorescensintensitetsanalyse (trinn 6.1.6.2) transformeres sporene i tillegg til koordinatsystemet til donorutslippskanalen ved hjelp av den omvendte transformasjonen T-1 oppnådd via bilderegistrering (se trinn 6.1.4). - Velg alternativer for beregningsalgoritmen for fluorescensintensitet (se figur 3A for mer informasjon). Angi i) radiusen til en disk som, når den er sentrert på signalets posisjon, inneholder alle bildepunkter som påvirkes av dette signalet, og ii) bredden på en ring rundt hver disk som brukes til å bestemme den lokale bakgrunnen.
MERK: For å redusere støy i oppnådde intensitetsmålinger, brukes en gaussisk uskarphet med et standardavvik på 1 piksel på bildene (figur 3B,C).
- Bruk analyseprogramvarefunksjonaliteten til å behandle hjelpebildedata fra bildesekvenser.
- Trekk ut flere bilder som er tatt for å lette segmenteringen (se trinn 2.2.1, merket med s i eksitasjonssekvensen (se Tilleggsinformasjon, avsnitt 1.2, trinn 3).
- Bestemme eksitasjonslysprofiler for givere og akseptorer på tvers av synsfeltet fra bilder som er tatt opp i et tett merket utvalg (se trinn 3.2).
MERK: Gjennomsnittet for piksel for piksel beregnes fra bildene for å beregne lysprofilene. Kameraets grunnlinje trekkes fra. Bilder er uskarpe ved hjelp av et gaussisk filter for å redusere effekter på grunn av prøve urenheter. Til slutt deles de resulterende bildene pikselvis på maksimumsverdien for å få profil-p(x,y)-tilordningskoordinatene til intervallet [0,1].
7. Visualisering av FRET-baner (valgfritt)
- Bruk inspektørapplikasjonen til å vise enkeltmolekylspor i rå bildedata og de tilsvarende fluorescensintensitetene og tilsynelatende FRET-effektiviteten og stoichiometries.
MERK: Dette er et verdifullt verktøy for å vurdere gyldigheten av valgte parametere og manuelt godta eller avvise individuelle tidsspor. Se Tilleggsinformasjon for skjermbilde og detaljert bruksinformasjon.
8. Analyse og filtrering av enkeltmolekyldata (02. Analyse.ipynb)
- Bruk 02. Analyse.ipynb Jupyter bærbar PC for analyse og filtrering av enkeltmolekyldata innhentet via 01. Sporing.ipynb notisbok. Se trinnene nedenfor for en typisk analysepipeline.
MERK: Ulike vitenskapelige spørsmål og eksperimentelle design kan kreve justeringer av innstillingene. Bruken av Jupyter bærbare PC-er gjør det enkelt å tilpasse seg ved å utelate, omorganisere og endre analysetrinn. Hvis du vil ha skjermbilder av hvert analysetrinn og beskrivelse av funksjonskallparametere, kan du se Tilleggsinformasjon.- Utfør innledende filtreringstrinn.
- Kast signaler med overlappende punktspredningsfunksjoner, da det er vanskelig å bestemme fluorescensintensitetene på en pålitelig måte.
- Ved inhomogen belysning, godta bare signaler som ligger i godt opplyste områder innen synsfeltet for å sikre et godt signal-til-støy-forhold.
- Hvis du studerer intramolekylær FRET, begrense analysen til de banene som er tilstede fra begynnelsen av bildesekvensen for å sikre at alle blekingstrinn registreres og kan evalueres riktig senere under den trinnvise fotobleachinganalysen.
MERK: Når du utfører eksperimenter med intermolekylære FRET-sonder, der donor og akseptorfluoremer ikke er en del av et forhåndsformet kompleks, kan det ikke være mulig å begrense analysen til først tilstedeværende baner.
- Utfør flatfeltkorrigering, som bruker eksitasjonslyskildeprofilene oppnådd i trinn 6.1.7.2 for å reversere de posisjonsavhengige fluorescensintensitetsvariasjonene forårsaket av inhomogen belysning.
MERK: Fluorescensintensiteten I(x,y) til en sonde i posisjonen (x,y) korrigeres via
; se figur 1C,D. - Beregn den tilsynelatende FRET-effektiviteten Eapp (dvs. brøkdelen av energi som overføres fra donorfluoforen til akseptorfluoforen) og den tilsynelatende stoichiometrien Sapp (dvs. antall donorfluoreforer delt på det totale antallet fluoroforer innenfor et diffraksjonsbegrenset sted).
MERK: Ved å plotte E vs. S for hvert datapunkt, er det mulig å skille endringer i målt FRET-effektivitet på grunn av endring i donor-akseptoravstand fra endringer på grunn av endringer i stoichiometri18. Dette gjør det mulig å skille mellom E = 0 på grunn av fargeseparasjon fra E = 0 på grunn av fravær av en aktiv akseptor. E-S-tomter brukes gjennom hele analysen som et verktøy for kvalitetsvurdering; se figur 4 som et eksempel. - Utføre trinnvis analyse av fotobleaching for diskriminering mellom enmolekylære sonder og aggregater. Velg å godta ett av følgende alternativer.
MERK: Til dette formål bruker analyseprogramvaren en tilpasset implementering32 av changepoint-deteksjonsalgoritmen PELT37 separat til fluorescensintensiteten ved donoreksitasjon (IDD + IDA) og akseptoreksitasjon (IAA).- Velg alternativ 1, der akseptorfluofor blekemidler i et enkelt trinn mens donoren ikke viser delvis bleking (dvs. det er ikke noe blekingstrinn til ikke-null intensitet).
MERK: Dette alternativet avviser videre baner der donoren bleker før akseptoren i et enkelt trinn. Alternativ 1 er det foretrukne valget i tilfelle høye akseptorfotobleaching priser. - Velg alternativ 2, der donor blekes i ett enkelt trinn mens det ikke er noen delvis akseptorbleking.
MERK: Dette alternativet avviser videre baner der donoren bleker etter akseptoren i et enkelt trinn. Alternativ 2 er det foretrukne valget i tilfelle høye donorfotobleaching priser. - Velg alternativ 3, hvor enten fluorofor blekemidler i et enkelt trinn mens den andre ikke delvis blekes.
MERK: Alternativ 3 gir høyere fleksibilitet enn alternativ 1 og 2 og vil være den foreslåtte preferansen for dataanalyse. - Velg alternativ 4, der donor og akseptor fluoroforer viser enkeltsteg fotobleking eller ingen fotobleaching i det hele tatt.
MERK: Alternativ 4 foretrekkes ved lave fotobleaching-priser.
- Velg alternativ 1, der akseptorfluofor blekemidler i et enkelt trinn mens donoren ikke viser delvis bleking (dvs. det er ikke noe blekingstrinn til ikke-null intensitet).
- Beregn korreksjonsfaktorene for donorutslippslekkasje i akseptorkanalen α, direkte akseptoreksitasjon δ, deteksjonseffektivitet γ og eksitasjonseffektivitet β 17.
- Bruk korreksjonsfaktorene til å beregne FRET-effektivitet E fra den tilsynelatende effektiviteten Eapp og stoichiometri S fra den tilsynelatende stoichiometri Sapp.
- Utfør ytterligere filtreringstrinn. Velg bare datapunkter fra før den første blekingshendelsen i hver bane. I tillegg godtar du bare baner med minst 75% av datapunktene som tilfredsstiller 0,35 < S < 0,6 for å begrense analysen til enkeltmolekylsonder (tallene er justerbare).
MERK: Øvre og nedre grense for bør velges i henhold til spredningen av interessepopulasjonen kontra populasjonene som skal utelukkes fra analysen (f.eks. donor- og akseptorpopulasjoner). Basert på erfaring viste 0,35 < S < 0,6 seg å være et godt valg for mange eksperimentelle situasjoner. - Utfør bildesegmentering via globale eller adaptive terskelmetoder35 på de aktuelle hjelpebildene (se trinn 2.2.1 og 6.1.7) for å begrense analysen til forskjellige regioner innen synsfeltet.
MERK: Dette tillater for eksempel eksklusiv evaluering av sonder plassert i et celle-SLB-grensesnitt eller på en mønstret struktur.
- Utfør innledende filtreringstrinn.
; se figur 1C,D.9. Plotting av resultater og videre analyse (03. Tomt.ipynb)
MERK: Se Tilleggsinformasjon for skjermbilder av Jupyter bærbar PC og beskrivelse av funksjonskallparametere.
- Opprett E-S-plott for å bekrefte at signaler om feil stoichiometri er riktig identifisert og fjernet.
- Plott histogrammer av FRET-effektivitet for å gi en veletablert oversikt over FRET-effektivitetsfordelingene. Grupper histogrammer for praktisk sammenligning av resultater fra forskjellige eksperimenter.
- Evaluer dataene ytterligere (f.eks. diffusjonsanalyse, konvertering av FRET-effektivitet til krefter i eksperimenter ved hjelp av molekylære kraftsensorer eller overgangsanalyse) i den bærbare PCen som drar nytte av vitenskapelige Python-biblioteker.
MERK: Data kan også eksporteres i mange filformater som inndata til annen analyseprogramvare.
Representative Results
En rekke lav- og høynivåinformasjon kan hentes ut fra smFRET-spor avhengig av eksperimentets vitenskapelige spørsmål. Her presenteres eksempler på analyserørledninger med analoge og digitale sonder: en peptidbasert molekylær kraftsensor16 og en DNA-sonde med stokastisk veksling av henholdsvis konformasjonen38. Se figur 5 for utformingen og arbeidsprinsippet for disse sondene.
Etter at lokaliserings- og sporingsalgoritmene er utført som beskrevet i protokollen, tilbyr pakken flere datavisualiseringsverktøy for å optimalisere de første parametrene og påfølgende filtertrinn: (i) visualisering av individuelle smFRET-hendelser, (ii) valgfri bildesegmentering for å analysere data i visse interesseområder, (iii) overvåking av filtertrinn via FRET-effektivitet vs. stoichiometri (E-S) plott. Visualiseringen av enkeltmolekyldataene presenteres i figur 6.
Til slutt representeres de filtrerte FRET-hendelsene av et E-S-plott og et FRET-effektivitets histogram (figur 4). E-S-plottet er et nyttig verktøy for å optimalisere de nevnte filtreringstrinnene og undersøke det endelige resultatet. Delvis blekede eller ufullstendig merkede FRET-sensorer kan utelukkes av deres stoichiometriverdi. Mobilitetsparametere kan undersøkes ved å plotte inn en individuell bane i en x-y-tomt (figur 6) eller en gjennomsnittlig firkantet forskyvningsplott (MSD) (figur 4). Den første metoden er spesielt nyttig for å diskriminere mobil fra immobiliserte hendelser, mens sistnevnte brukes til å beregne diffusjonskoeffisienten.
Figur 4: Eksemplarisk utgang. (A) FRET-effektiviteten er plottet versus stoichiometri (E-S-plott) for en populasjon av den molekylære kraftsensoren (venstre panel) som dekorerer en glassstøttet lipid-bilayer og anstrengt av en T-celle. Bare én befolkningssky er synlig. Det respektive histogrammet av FRET-effektivitet eksemplifiserer forskjellen mellom en kraftsensorpopulasjon i nærvær og fravær av celler (midtpanel). Ingen overgang til lavere FRET-effektivitet i sensorpopulasjonen i nærvær av T-celler kan observeres, noe som indikerer liten eller ingen kraftavhengig strekking av sensormodulen. MSD-plottet for disse eksperimentelle forholdene bekrefter at kraftsensorpopulasjonen under en T-celle beveger seg betydelig langsommere enn deres ubundne kolleger (høyre panel). (B) Den samme analysen ble utført med Holliday-kryss-DNA-sensor som pyntet en glassstøttet væske lipid-bilayer. E-S-plottet viser tydelig to populasjoner, som også er tydelige i FRET-effektivitetshistogrammet. MSD-plottet indikerer tilstedeværelsen av en sensorpopulasjon som beveger seg raskt. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverføring; MSD = gjennomsnittlig firkantet forskyvning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Design- og arbeidsprinsipp for intramolekylære FRET-sonder. (A) Analog peptidsensor for kvantifisering av mekaniske molekylære krefter. Donor og akseptor fluoroforer er kovalent festet til hver ende av peptid ryggraden. Sensormodulen er stedsspesifikk festet til en bestemt ligand, som igjen binder en celle-resident overflatereseptor av interesse (her et antistofffragment som spesifikt gjenkjenner betakjeden til T-cellereseptoren). Ved reseptor-ligandbinding utøves kraft, og sensormodulen forlenges og til slutt rekyleres etter bindingsspalting. Dette panelet er modifisert fra 16. (B) Digital DNA-sensor for kvantifisering av FRET-overganger. FRET-sensoren består av fire DNA-tråder som danner et Holliday-veikryss. Donoren og akseptorfluoreore er kovalent festet til to tråder. Holliday-veikryss bytter ofte konformasjon avhengig av de omkringliggende bufferforholdene. Den stokastiske vekslingen av disse konformasjonene kan overvåkes ved å kvantifisere FRET-effektiviteten til individuelle sonder. Forkortelser: TCR = T celle reseptor; FRET = Förster resonans energioverføring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Eksempler på lokalisering og sporing av FRET-sonder. (A) FRET-effektiviteten og stoichiometrien til individuelle hendelser beregnes ved å kvantifisere intensiteten av donorfluoreforen ved donoreksitasjon (D → D), akseptorfluofor ved donoreksitasjon (D → A), og akseptorfluoreoreoren ved akseptoreksitasjon (A → A). Nærmeste nabofiltrering forhindrer skjevhet ved å overlappe punktspredningsfunksjoner for nære emittere. Bildesegmentering gjør det mulig for brukeren å velge visse smFRET-hendelser lokalisert innenfor et interesseområde (f.eks. en celle eller en mikropattern). Som et eksempel på bildesegmentering ble T-celler farget med Fura-2 (vist til venstre) og utsatt for adaptiv terskelverdi for å identifisere cellekantene (oransje prikket linje). Skalastenger = 5 μm. (B) smFRET-baner ved hjelp av molekylær kraftsensor. Individuelle baner kan plottes inn i x-y-planet , og visualiserer deres diffusjonsatferd og lokalisering (venstre panel). Videre kan hver banes intensiteter plottes over tid for å identifisere FRET-overganger eller bleketrinn (midtpanelet viser den røde banen fra venstre panel). Den resulterende FRET-effektiviteten og stoichiometrien kan visualiseres på samme måte (høyre panel). (C) smFRET-baner ved hjelp av DNA-sensoren for Holliday-krysset. HBSS + 12 mM MgCl2 ble brukt som buffer under målingene. Bortsett fra det tilsynelatende akseptorblekingstrinnet nær sekvensenden av disse eksemplene, kan frekvensen av FRET-overganger for hver sensor bestemmes. Holliday-veikryssene bytter samsvar med en høy frekvens, mens sensoren for molekylær kraft ikke viser FRET-overganger. Denne informasjonen gjør det mulig å justere de eksperimentelle forholdene, for eksempel forsinkelsen mellom rammene, for å øke eller redusere antall observerte overganger. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverføring; smFRET = enkeltmolekyl FRET; HBSS = Hanks balanserte saltoppløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsinformasjon: Lokalisering og sporing av enkeltmolekyler (01. Tracking.ipynb). Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Denne artikkelen beskriver en rørledning for automatiserte opptak og kvantitativ analyse av smFRET-data som stammer fra mobile, men overflatetildelte sondemolekyler. Det kompletterer de to dominerende tilnærmingene til smFRET-eksperimenter, som involverer enten overflate-immobiliserte sonder eller sonder som sprer seg i løsning inn og ut av et konfokalt eksitasjonsvolum17. Det gir riktig FRET-effektivitet og molekylære posisjoner som en funksjon av tid. Det kan derfor brukes som inndata for spesialiserte analyseprogrammer, for eksempel for å kvantifisere overgangskinetikk1, FRET histogrammer39 eller todimensjonal diffusjon22.
Programvaren er utgitt under en gratis og åpen kildekode-lisens godkjent av Open Source Initiative som gir brukeren den evigvarende retten til fri bruk, endring og videredistribusjon. Github ble valgt som en utviklings- og distribusjonsplattform for å gjøre det så enkelt som mulig å skaffe programvaren og delta i utviklingsprosessen ved å rapportere feil eller bidra med kode40. Programvaren er skrevet i Python, og er ikke avhengig av proprietære komponenter. Valget av Jupyter bærbare PC-er som brukergrensesnitt forenkler inspeksjon av data på hvert analysetrinn og gjør det mulig å skreddersy og utvide rørledningen spesielt for det eksperimentelle systemet. Sdt-python-biblioteket32 fungerer som grunnlag og implementerer funksjonalitet for å evaluere fluorescensmikroskopidata, for eksempel enkeltmolekyl lokalisering, diffusjonsanalyse, fluorescensintensitetsanalyse, fargekanalregistrering, colokaliseringsanalyse og ROI-håndtering.
I prinsippet kan enkeltpartikkelsporing utføres i en-, to- eller tredimensjonale systemer. Her ble analyserørledningen for enkeltmolekyler skreddersydd for studiet av 2D-mobile systemer. Dette valget gjenspeiler tilgjengeligheten av enkle systemer, for eksempel planar-støttede lipid-bilayers (SLD-er), for å presentere mobile fluorescerende sonder. Slike lipidbilayersystemer består vanligvis av to eller flere fosfolipider moieties, hvor bulkfraksjonen bestemmer de viktigste fysisk-kjemiske parametrene til SLB (for eksempel fase og viskositet), og den mindre fraksjonen gir vedleggssteder for biomolekyler. Disse festestedene kan være biotinylerte fosfolipider for avidin- eller streptavidinbaserte proteinplattformer eller nikkel-NTA konjugerte fosfolipider for proteinplattformer med histidinmerker41. Valget av riktig plattform for å koble proteiner til SLB avhenger av det vitenskapelige spørsmålet. Leserne kan henvise til litteraturen16,38,42 for eksempler på vellykkede anvendte strategier. Tettheten av sonder i prøven bør være tilstrekkelig lav for å unngå overlappende punktspredningsfunksjoner; vanligvis anbefales mindre enn 0,1 molekyler per μm2. Se avsnittet om representative resultater (spesielt figur 6) for et eksempel som viser en passende sondetetthet. Analysemetoden gjelder også for enkelt fluorescerende merkede proteinmolekyler som sprer seg i plasmamembranen til levende celler.
Et kritisk aspekt ved smFRET-eksperimenter er produksjon og karakterisering av FRET-sondene selv. Når du velger fluoroforer for et FRET-par, bør Förster-radiusen samsvare med de forventede mellomfargede avstandene43. Fargestoffer som er motstandsdyktige mot fotobleaching, foretrekkes da de gir lange tidsspor. Men for forhøyede blekingshastigheter kan en fluoroforart brukes til å gjenkjenne multiemitterhendelser som stammer fra colokaliserte molekyler via trinnvis fotobleaching analyse; se trinn 8.1.4 i protokolldelen. Fluoroforpar bør være stedsspesifikke og kovalente festet til molekylene av interesse, og danner intra- eller intermolekylære FRET-par.
Kombinere smFRET med andre lett tilgjengelige teknikker kan øke sin romlige oppløsning utover diffraksjonsgrensen (via STED44). SmFRET-sporingsalgoritmen som presenteres her, utvider tilnærmingens anvendbarhet til nye eksperimentelle innstillinger og modellsystemer. Dette inkluderer studier av (i) kinetiske endringer i stoichiometri av mobile biomolekyler, (ii) dynamisk forening av mobile biomolekyler, (iii) frekvensen av enzymatiske reaksjoner av fritt diffuserende reaktanter, og (iv) kinetikken til konformasjonsendringer av mobile biomolekyler. De to første eksemplene krever at modellsystemer som viser intermolekylære FRET, det vil si donor og akseptor, blir konjugert for å skille biomolekylære enheter av interesse. De sistnevnte eksemplene kan gjøre bruk av biosensorer som bærer donor og akseptor innenfor samme molekylære enhet (intramolekylær FRET).
Intramolekylære FRET-baserte sensorer kan gi innsikt i iboende konformasjonsendringer av biomolekyler1,2,3,4, konformasjonsendringer forårsaket av endogen eller ekstern kraftbelastning (molekylær kraftsensorer16), eller ionkonsentrasjoner i nanomiljøet som kalsium45 og pH46 . Avhengig av modellsystemet og den foretrukne forankringsplattformen, kan slike smFRET-hendelser enten spores i 2D eller 3D: (i) planarsporing av smFRET-hendelser kan brukes til kvantifisering av reseptor-ligand interaksjonstider i en plasmamembran, foreningen av membranforankret signalforsterkning kaskader, og stoichiometriendringer av overflatereseptorer; (ii) volumsporing av smFRET-hendelser kan brukes til intra- eller intermolekylære FRET-sonder i levende celler eller i in vitro-rekonstituerte systemer.
SmFRET-sporingsmetoden ble utviklet hovedsakelig med tanke på intramolekylære FRET-sonder. Disse sondene har et fast og velkjent antall fluorescerende etiketter, et faktum som ble utnyttet til å avvise data fra agglomererte og feil syntetiserte (f.eks. ufullstendig merkede) molekyler, samt fra sonder der en av fluoroforene har blitt fotoblekert. Ved å justere filtreringstrinnene kan imidlertid metoden også brukes på intermolekylære FRET-sonder. For eksempel, i stedet for å akseptere bare molekyler med en enkelt donor og en enkelt akseptor fluorofor, kunne man undersøke de romlige banene til donor- og akseptorfargestoffer og velge for eksempel for co-diffuserende donor-akseptorbaner.
Ettersom 3D-DAOSTORM-algoritmen har støtte for å bestemme et signals posisjon langs den optiske aksen via astigmatismen på grunn av en sylindrisk linse i utslippsstrålebanen, kan 3D-eksperimenter enkelt integreres i analyserørledningen. I dette tilfellet vil akseptorsignalet ved akseptoreksitasjon tjene til å bestemme stoichiometrien og den aksiale posisjonen. Analyseprogramvaren kan også brukes til å evaluere data fra eksperimenter med immobiliserte sonder ved å bruke sin store grad av automatisering og filtreringsordninger. Faktisk ble smFRET effektivitetsdatasett fra Holliday-veikryss immobilisert på gelfase bilayers38 analysert ved hjelp av en tidlig versjon av programvaren.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Det østerrikske vitenskapsfondet (FWF) prosjektene P30214-N36, P32307-B, og av Vienna Science and Technology Fund (WWTF) LS13-030.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS) | Avanti Polar Lipids | 790404P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
| α Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective | Zeiss | 000000-1084-514 | |
| Axio Observer microscope body | Zeiss | ||
| Bandpass filter | Chroma Technology Corp | ET570/60m | donor emission filter |
| Bandpass filter | Chroma Technology Corp | ET675/50m | acceptor emission filter |
| conda-forge | conda-forge community | community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda | |
| Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5 | MENZEL | ||
| Dichroic mirror | Semrock Inc | FF640-FDi01-25×36 | separation of donor and acceptor emission |
| Dichroic mirror (quad band) | Semrock Inc | Di01-R405/488/532/635-25×36 | separation of excitation and emission light |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | for imaging buffer |
| fret-analysis | Schütz group at TU Wien | Python package for smFRET data analysis; version 3 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher Scientific | 11524766 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | for imaging buffer |
| iBeam Smart 405-S 405 nm laser | Toptica Photonics AG | ||
| iXon Ultra 897 EMCCD camera | Andor Technology Ltd | ||
| Lab-Tek chambers (8 wells) | Thermo Fisher Scientific | 177402PK | for sample preparation and imaging |
| Millenia Prime 532 nm laser | Spectra Physics | ||
| miniconda | Anaconda Inc. | Python 3 distribution. Min. version: 3.7 | |
| Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression) | Addgene | 20860 & 20859 | |
| OBIS 640 nm laser | Coherent Inc | 1185055 | |
| Optosplit II | Cairn Research | ||
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5253 | for imaging buffer |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| sdt-python | Schütz group at TU Wien | Python library for data analysis; version 17 | |
| TetraSpek bead size kit | Thermo Fisher Scientific | T14792 | Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration |
| USC500TH Ultrasound bath | VWR | for SUV formation |
References
- McKinney, S. A., Déclais, A. -C., Lilley, D. M. J., Ha, T. Structural dynamics of individual holliday junctions. Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).
- Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).
- Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), 235 (2018).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).
- Wu, P. G., Brand, L. Resonance energy transfer: Methods and applications. Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).
- Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-molecular förster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
- Malkusch, N., Dörfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex. Methods. 120, 115-124 (2017).
- Lee, J. -B., et al. Single-molecule views of MutS on mismatched DNA. DNA repair. 20, 82-93 (2014).
- Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).
- Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
- Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. How kinesin waits between steps. Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).
- Göhring, J., et al. Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements. Nature Communications. 12 (1), 2502 (2021).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669 (2018).
- Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).
- Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
- McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).
- Lee, N. K., et al. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).
- Asher, W. B., et al. Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells. Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).
- Joo, C., Ha, T. Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy. (12), Cold Spring Harbor. 1223-1237 (2012).
- Joo, C., Ha, T. Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET. Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).
- Joo, C., Ha, T. Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET. Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).
- Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. Soft-matter/pims: PIMS v0.5. , https://github.com/soft-matter/pims (2020).
- Anaconda Inc. Miniconda. , https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html (2021).
- conda-forge community. The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem. , (2015).
- JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation. , https://jupyterlab.readthedocs.io/en/stable/user/notebook.html (2021).
- Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy. Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).
- Gao, Y., Kilfoil, M. L. Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions. Optics Express. 17 (6), 4685 (2009).
- Schrangl, L. sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1). , Zenodo. (2021).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).
- Bradski, G. The OpenCV library. Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).
- Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0. Zenodo. , 4682814 (2021).
- Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. Optimal detection of changepoints with a linear computational cost. Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).
- Schrangl, L., Göhring, J., Schütz, G. J. Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories. The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328 (2018).
- Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis. ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).
- Schrangl, L. Single-molecule FRET analysis software (3.0). Zenodo. , (2021).
- Nye, J. A., Groves, J. T. Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers. Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).
- Platzer, R., et al. Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy. Nature Communications. 11 (1), 4993 (2020).
- Johnson, I., Spence, M. The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. , Life Technologies Corporation. (2010).
- Szalai, A. M., et al. Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET. Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process. New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).
