Denna artikel beskriver en väletablerad och reproducerbar lectin fläck analys för hela mount retinal preparat och protokoll som krävs för kvantitativ mätning av vaskulär parametrar ofta ändras i proliferative och icke-proliferative retinopathies.
Retinopatier är en heterogen grupp av sjukdomar som påverkar ögats neurosensoriska vävnad. De kännetecknas av neurodegeneration, gliosis och en progressiv förändring i vaskulär funktion och struktur. Även om uppkomsten av retinopathies kännetecknas av subtila störningar i visuell uppfattning, är ändringarna i vaskulär plexus de första tecknen som upptäcks av kliniker. Frånvaron eller förekomsten av neovaskularisering avgör om retinopati klassificeras som antingen icke-proliferativ (NPDR) eller proliferativ (PDR). I den meningen försökte flera djurmodeller efterlikna specifika kärlegenskaper i varje steg för att bestämma de underliggande mekanismerna som är involverade i endotelförändringar, neuronal död och andra händelser som äger rum i näthinnan. I den här artikeln kommer vi att ge en fullständig beskrivning av de förfaranden som krävs för mätning av retinala kärlparametrar hos vuxna och tidiga födelsemöss vid postnatal dag (P)17. Vi kommer att beskriva protokollen för att utföra retinal vaskulär färgning med Isolectin GSA-IB4 i hela fästen för senare mikroskopisk visualisering. Viktiga steg för bildbehandling med Image J Fiji programvara tillhandahålls också, därför kommer läsarna att kunna mäta kärltäthet, diameter och tortuositet, vaskulär förgrening, liksom avaskådeliga och neovaskulära områden. Dessa verktyg är till stor hjälp för att utvärdera och kvantifiera vaskulär förändringar i både icke-proliferative och proliferative retinopathies.
Ögonen närs av två arterio-venösa system: choroidal vaskulatur, ett externt vaskulär nätverk som bevattnar retinal pigmenterat epitel och fotoreceptorer; och den neuro-retinala vaskulaturen som bevattnar ganglioncellernas lager och näthinnans inre kärnskikt1. Näthinnevaskulaturen är ett organiserat nätverk av kärl som levererar näringsämnen och syre till näthinnecellerna och skördar avfallsprodukter för att säkerställa korrekt visuell signaltransduktion. Denna vaskulatur har några distinkta funktioner, inklusive: bristen på autonom innervation, reglering av vaskulär ton av inneboende retinal mekanismer och innehav av en komplex retinal-blod barriär2. Därför har retinal vaskulatur varit i fokus för många forskare som har studerat inte bara vasculogenes under utvecklingen, men också de förändringar och patologiska angiogenes som dessa fartyg genomgår i sjukdomar3. De vanligaste vaskulär förändringarna som observerats i retinopatier är kärl dilatation, neovaskularisering, förlust av vaskulär arborization och deformation av näthinnan huvudkärl, vilket gör dem mer ziggaggy4,5,6. En eller flera av de beskrivna ändringarna är de tidigaste tecknen som ska upptäckas av kliniker. Vaskulär visualisering ger en snabb, icke-invasiv och billig screeningmetod7. Den omfattande studien av de förändringar som observerats i kärlträdet kommer att avgöra om retinopatin är icke-proliferativ eller proliferativ och den fortsatta behandlingen. De icke-proliferative retinopathies kan manifestera sig med avvikande vaskulär morfologi, minskad vaskulär densitet, acellulära kapillärer, pericytes död, makulade ödem, bland andra. Dessutom utvecklar proliferative retinopathies också ökad vaskulär permeabilitet, extracellulära ombyggnad och bildandet av vaskulär tufts mot glaskropp håligheten som lätt nedbrytning eller inducera retinal detachement8.
När upptäckts kan retinopatin övervakas genom dess kärlförändringar9,10. Patologins progression kan följas genom kärlens strukturella förändringar, som tydligt definierar stadier av sjukdomen11. Kvantifiering av vaskulär förändringar i dessa modeller tillåtet att korrelera fartygsförändringar och neuronal död och att testa farmakologiska terapier för patienter i olika faser av sjukdomen.
Mot bakgrund av ovanstående uttalanden anser vi att erkännande och kvantifiering av vaskulär förändringar är grundläggande i retinopathies studier. I detta arbete kommer vi att visa hur man mäter olika kärlparametrar. För att göra det kommer vi att använda två djurmodeller. En av dem är den syreinducerade retinopatimusen model12, som efterliknar retinopati av råttor och vissa aspekter av proliferativ diabetesretinopati13,14. I denna modell kommer vi att mäta avascular områden, neovaskulära områden och dilatation och tortuositet av huvudfartyg. I vårt laboratorium har en metabolisk syndrom (MetS) musmodell utvecklats, vilket inducerar en icke-proliferative retinopathy15. Här kommer vi att utvärdera kärldensitet och förgrening.
Djurmodeller av retinopatier är kraftfulla verktyg för att studera kärlutveckling, ombyggnad eller patologisk angiogenes. Framgången för dessa studier inom området beror på enkel tillgång till vävnaden som gör det möjligt att utföra en mängd olika tekniker, vilket ger data från in vivo– och postmortemmöss26,27. Dessutom har stor korrelation hittats mellan in vivo-studier och klinisk analys, vilket ger solid spårbarhet oc…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Carlos Mas, María Pilar Crespo och Cecilia Sampedro från CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) för hjälp med konfokal mikroskopi, till Soledad Miró och Victoria Blanco för särskild djurvård och Laura Gatica för histologisk hjälp. Vi tackar också Victor Diaz (pro-sekreterare för institutionell kommunikation i FCQ) för videoproduktion och utgåva och Paul Hobson för hans kritiska läsning och språkrevision av manuskriptet.
Denna artikel finansierades genom bidrag från Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alla till M.C.S.).
Aluminuim foil | |||
Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
200 µL tube | Merck | Z316121 | |
Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
Potassium chloride | Merck | P9541 | |
Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Sodium chloride | Merck | S3014 | |
Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |