Summary

Isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares

Published: October 04, 2021
doi:

Summary

Apresentamos um método para isolar células e núcleos endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos expostas a condições de fluxo estáveis ou perturbadas para a realização de experimentos ômicos unicelulares.

Abstract

A aterosclerose é uma doença inflamatória das regiões arteriais expostas ao fluxo sanguíneo perturbado (fluxo d). O fluxo D regula a expressão de genes no endotélio nos níveis transcriptômico e epigenômico, resultando em respostas proaterogênicas. Recentemente, estudos de sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e ensaio de célula única para sequenciamento de cromatina acessível à transposase (scATACseq) foram realizados para determinar as alterações de acessibilidade transcriptômica e cromatina em uma resolução de célula única usando o modelo de ligadura parcial de carótida (PCL) de camundongo. Como as células endoteliais (CE) representam uma fração menor das populações celulares totais na parede da artéria, um método de digestão luminal foi usado para obter preparações unicelulares enriquecidas com CE. Para este estudo, camundongos foram submetidos à cirurgia de LCP para induzir o fluxo d na artéria carótida esquerda (ACV) enquanto usavam a artéria carótida direita (ACR) como controle. As artérias carótidas foram dissecadas dois dias ou duas semanas após a cirurgia de LCP. O lúmen de cada carótida foi submetido à digestão da colagenase, e células únicas enriquecidas com endotelial ou núcleos únicos foram obtidos. Essas preparações de célula única e núcleos únicos foram subsequentemente codificadas usando uma configuração microfluídica de 10x Genomics. As células únicas e os núcleos únicos com código de barras foram então utilizados para preparação de RNA, geração de biblioteca e sequenciamento em um sequenciador de DNA de alto rendimento. Após o processamento bioinformático, os conjuntos de dados scRNAseq e scATACseq identificaram vários tipos de células da digestão luminal, consistindo principalmente de CEs. Células musculares lisas, fibroblastos e células imunes também estavam presentes. Este método de enriquecimento CE ajudou a entender o efeito do fluxo sanguíneo no endotélio, o que poderia ter sido difícil com o método de digestão total da artéria. O método de preparação de célula única enriquecido com CE pode ser usado para realizar estudos de ômica de célula única em camundongos knockouts e transgênicos em que o efeito do fluxo sanguíneo sobre esses genes não foi estudado. É importante ressaltar que essa técnica pode ser adaptada para isolar células únicas enriquecidas com CE de explantes de artérias humanas para realizar estudos mecanicistas semelhantes.

Introduction

Este laboratório demonstrou anteriormente que a indução do fluxo d leva ao desenvolvimento rápido e robusto de aterosclerose em camundongos hiperlipidêmicos 1,2. O novo modelo de aterosclerose induzida por fluxo d em camundongos foi possível usando a cirurgia de ligadura parcial da carótida (LCP) 3. A cirurgia de LCP induz a condição de fluxo sanguíneo baixo e oscilatório ou fluxo d na artéria carótida esquerda ligada (ACV). Em contraste, a artéria carótida direita (ACR) contralateral continua a enfrentar fluxo laminar estável (s-flow). Anteriormente, para entender o efeito do fluxo d nas células endoteliais, as artérias carótidas foram dissecadas após a cirurgia de ligadura parcial e lavadas com um agente lisador à base de isotiocianato de fenol e guanidina (método de liberação de RNA/DNA luminal)2,4, que forneceu RNAs ou DNAs “a granel agrupados” enriquecidos com endotélio. Esses RNAs ou DNAs agrupados a granel foram então processados para estudos transcriptômicos ou estudos epigenômicos de metiloma de DNA, respectivamente 4,5,6. Esses estudos ajudaram a descobrir múltiplos genes sensíveis ao fluxo e microRNAs cujos papéis na biologia endotelial e na aterosclerose foram extensivamente investigados 4,6,7.

No entanto, apesar do enriquecimento endotelial, esses estudos de RNA/DNA em massa não conseguiram distinguir o papel específico de cada tipo de célula na parede da artéria na aterosclerose induzida pelo fluxo d. Isolamento unicelular (sc) enriquecido com endotélio e estudos de sequenciamento de scRNA e scATAC foram realizados para superar essa limitação8. Para isso, camundongos C57Bl6 foram submetidos à cirurgia de LCP para induzir o fluxo d na ACV enquanto usavam o RCA exposto ao fluxo s como controle. Dois dias ou duas semanas após a cirurgia de LCP, os ratos foram sacrificados e as carótidas foram dissecadas e limpas. O lúmen de ambos os LCAs e RCAs foi infundido com colagenase, e os digestos de colagenase luminal contendo CEs como fração significativa e outras células arteriais foram coletadas. A suspensão de célula única (scRNAseq) ou a suspensão de núcleos únicos (scATACseq) foram preparadas e codificadas com identificadores únicos para cada célula ou núcleo usando uma configuração de Genômica 10x. Os RNAs foram submetidos à preparação da biblioteca de cDNA e sequenciados.

Os conjuntos de dados scRNAseq e scATACseq foram processados utilizando o Cell Ranger Single-Cell Software e posteriormente analisados pelos pacotes Seurat e Signac R 9,10. A cada célula e núcleo foi atribuído um tipo de célula a partir dessas análises e agrupados no tipo de célula com base nos genes marcadores e padrões únicos de expressão gênica. Os resultados do scRNAseq e scATACseq demonstraram que essas preparações de célula única são enriquecidas com CEs e também contêm células musculares lisas (SMCs), fibroblastos e células imunes.

Uma análise mais aprofundada revelou que a população CE na digestão luminal é altamente divergente e plástica (8 clusters CE diferentes) e responsiva ao fluxo sanguíneo. Mais importante ainda, esses resultados demonstraram que o fluxo d reprograma as CEs de um fenótipo anti-inflamatório protegido por ateróbio para fenótipos pró-aterogênicos, incluindo transição pró-inflamatória, endotelial para mesenquimal, transição de células-tronco endoteliais / progenitoras e, mais surpreendentemente, transição endotelial para célula imune. Além disso, os dados scATACseq revelam novas alterações de acessibilidade à cromatina dependentes do fluxo e locais de ligação ao fator de transcrição de maneira genômica, que formam a base de várias novas hipóteses. A metodologia e o protocolo para a preparação de células endoteliais únicas para estudos multi-ômicos de célula única das artérias carótidas de camundongos são detalhados abaixo.

Protocol

Todos os procedimentos animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Emory. Camundongos C57BL/6 não hipercolesterolêmicos, pareados por idade e sexo foram usados para mitigar a variação dependente do sexo e compensar qualquer complicação de condições hipercolesterolêmicas. 1. Cirurgia de ligadura parcial da carótida (LCP) NOTA: A ligadura parcial da artéria carótida da ACL foi realizada …

Representative Results

Cirurgias de ligadura parcial da carótida foram realizadas em 44 camundongos, e o início do fluxo d na ACV foi validado pela realização de ultrassonografia um dia após a cirurgia de ligadura parcial. A cirurgia de ligadura parcial bem-sucedida causa redução da velocidade do fluxo sanguíneo e reverte o fluxo sanguíneo (fluxo perturbado) na ACV3. As artérias carótidas foram dissecadas aos dois dias ou duas semanas após a ligadura. O lúmen de cada carótida foi submetido à dige…

Discussion

Este artigo fornece um protocolo detalhado para isolar preparações unicelulares das artérias carótidas de camundongos. A influência do fluxo d nas células endoteliais pode ser estudada com precisão se a cirurgia de LCP for realizada corretamente. É crucial identificar corretamente os ramos da carótida comum, como a carótida externa, a carótida interna, a artéria occipital e a artéria tireoidiana superior. A validação dos padrões de fluxo por ultrassonografia valida ainda mais o início bem-su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento dos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde HL119798, HL095070 e HL139757 para HJ. HJ também é apoiado pelo Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. Os serviços prestados pelo Emory Integrated Genomics Core (EIGC) foram subsidiados pela Escola de Medicina da Universidade de Emory e também foram parcialmente apoiados pela Georgia Clinical and Translational Science Alliance dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de prêmio. UL1TR002378. O conteúdo fornecido acima é de responsabilidade exclusiva dos autores e não reflete as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Materials

Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade) Corning 21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes Eppendorf 022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile Fablab FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes Labcon 3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile Covidien s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged Thermo Fisher Scientic 08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered Sigma-Aldrich A6964-100ML or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) 10x Genomics 2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) 10x Genomics 2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin Sigma-Aldrich A7906-500G
Buprenorphine Med-Vet International RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit 10X Genomics 1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 10X Genomics 1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 10X Genomics 1000175
Collagenase II MP Biomedicals 2100502.5
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG
Dissecting Forceps Roboz Surgical Instruments Co RS-5005
Dnase1 New England Biolabs Inc M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) Eppendorf 22620444230VR
Fetal Bovine Serum – Premium Select R&D systems S11550
Fixed Angle Rotor Eppendorf FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline Millipore Sigma 51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) BD 305932
Isoflurane Patterson vet 789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm) Miltenyi Biotec 130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)  Miltenyi Biotec 130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride) Baxter International Inc 2B1323
Nuclei Buffer (20x) 10x Genomics PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher Scientic 70011-044
Small scissors Roboz Surgical Instruments Co RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock Roboz Surgical Instruments Co. RS-5480 or similar
Tissue Mend II Webster Veteinanry 07-856-7946
Type II Collagenase MP biomedicals 2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0 10X Genomics https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero Pliner et al., 2018 https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1 Hadley Wickham https://cran.r-project.org
Harmony Korsunsky et al., 2019 https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ Schneider et al., 2012 https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0 Qiu et al., 2017 https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2 R Foundation https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3 Stuart et al., 2019 https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5 Stuart et al., 2019 https://github.com/timoast/signac

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Cite This Article
Kumar, S., Andueza, A., Villa-Roel, N., Kim, J., Kang, D., Jo, H. Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments. J. Vis. Exp. (176), e63128, doi:10.3791/63128 (2021).

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