Summary
We presenteren een technologie die capillariteitsondersteunde assemblage in een microfluïdisch platform gebruikt om microgrote objecten die in een vloeistof zijn gesuspendeerd, zoals bacteriën en colloïden, te modelleren in voorgeschreven arrays op een polydimethylsiloxaansubstraat.
Abstract
Gecontroleerde patronen van micro-organismen in gedefinieerde ruimtelijke arrangementen bieden unieke mogelijkheden voor een breed scala aan biologische toepassingen, waaronder studies van microbiële fysiologie en interacties. Op het eenvoudigste niveau zou nauwkeurige ruimtelijke patroonvorming van micro-organismen betrouwbare, langdurige beeldvorming van grote aantallen individuele cellen mogelijk maken en het vermogen transformeren om afstandsafhankelijke microbe-microbe-interacties kwantitatief te bestuderen. Meer uniek is dat het koppelen van nauwkeurige ruimtelijke patronen en volledige controle over omgevingsomstandigheden, zoals aangeboden door microfluïdische technologie, een krachtig en veelzijdig platform zou bieden voor eencellige studies in microbiële ecologie.
Dit artikel presenteert een microfluïdisch platform om veelzijdige en door de gebruiker gedefinieerde patronen van micro-organismen te produceren binnen een microfluïdisch kanaal, waardoor volledige optische toegang mogelijk is voor langdurige monitoring met hoge doorvoer. Deze nieuwe microfluïdische technologie is gebaseerd op capillariteitsondersteunde deeltjesassemblage en maakt gebruik van de capillaire krachten die voortvloeien uit de gecontroleerde beweging van een verdampende suspensie in een microfluïdisch kanaal om individuele microsized objecten af te zetten in een reeks vallen die microgefabriceerd zijn op een polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat. Sequentiële afzettingen genereren de gewenste ruimtelijke lay-out van enkele of meerdere soorten objecten op microformaat, uitsluitend gedicteerd door de geometrie van de vallen en de vulvolgorde.
Het platform is gekalibreerd met behulp van colloïdale deeltjes van verschillende afmetingen en materialen: het heeft bewezen een krachtig hulpmiddel te zijn om diverse colloïdale patronen te genereren en oppervlaktefunctionalisatie van gevangen deeltjes uit te voeren. Verder werd het platform getest op microbiële cellen, met Escherichia coli-cellen als modelbacterie. Duizenden individuele cellen werden op het oppervlak gemodelleerd en hun groei werd in de loop van de tijd gevolgd. In dit platform maakt de koppeling van eencellige depositie en microfluïdische technologie zowel geometrische patronen van micro-organismen als nauwkeurige controle van omgevingsomstandigheden mogelijk. Het opent dus een venster op de fysiologie van afzonderlijke microben en de ecologie van microbe-microbe interacties, zoals blijkt uit voorlopige experimenten.
Introduction
Ruimtelijke patronen van afzonderlijke micro-organismen, met name binnen experimentele arena's die volledige controle over omgevingsomstandigheden mogelijk maken, zoals microfluïdische apparaten, is zeer wenselijk in een breed scala van contexten. Het rangschikken van micro-organismen in regelmatige arrays zou bijvoorbeeld de nauwkeurige beeldvorming van grote aantallen individuele cellen mogelijk maken en de studie van hun groei, fysiologie, genexpressie als reactie op omgevingsstimuli en gevoeligheid voor geneesmiddelen. Het zou ook het mogelijk maken om cel-celinteracties te bestuderen die van bijzonder belang zijn in onderzoek naar cellulaire communicatie (bijv. Quorum Sensing), kruisvoeding (bijv. Algen-bacteriële symbiose) of antagonisme (bijv. Allelopathie), met volledige controle over de ruimtelijke lokalisatie van cellen ten opzichte van elkaar. Celfysiologie en evolutiestudies1, cel-celinteractiestudies2, fenotypische differentiatiescreening3, omgevingsmonitoring4 en geneesmiddelenscreening5 behoren tot de gebieden die veel baat kunnen hebben bij een technologie die in staat is om een dergelijke kwantitatieve eencellige analyse te bereiken.
In de afgelopen jaren zijn verschillende strategieën voorgesteld om afzonderlijke cellen te isoleren en te hanteren, van holografische optische vallen6 en heterogene oppervlaktefunctionalisatiemethoden7,8,9,10 tot eencellige chemostaten11 en druppelmicrofluïdica12. Deze methoden zijn technisch zeer veeleisend of beïnvloeden de celfysiologie en bieden geen high-throughput platform voor patroonmicroben die gedurende lange perioden kunnen worden bestudeerd, waardoor eencellige resolutie, volledige optische toegang en controle over omgevingsomstandigheden worden gegarandeerd. Het doel van dit artikel is om een platform te beschrijven om bacteriën met micrometrische precisie te modelleren in voorgeschreven ruimtelijke arrangementen op een PDMS-oppervlak door middel van capillariteitsondersteunde assemblage. Dit platform maakt nauwkeurige en flexibele ruimtelijke patronen van microben mogelijk en maakt volledige optische toegang en controle over omgevingsomstandigheden mogelijk, dankzij het microfluïdische karakter.
De technologie achter dit platform is een assemblagetechnologie die de afgelopen jaren is ontwikkeld, genaamd sCAPA13,14,15 (sequentiële capillariteitsondersteunde deeltjesassemblage) die is geïntegreerd in een microfluïdisch platform16. De meniscus van een verdampende vloeistofdruppel, terwijl hij zich terugtrekt over een patroon polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat in een microfluïdisch kanaal, oefent capillaire krachten uit die de individuele colloïdale deeltjes die in de vloeistof zijn gesuspendeerd, opvangen in micrometrische putten die op het substraat zijn gemicrofabriceerd (figuur 1A). Zwevende deeltjes worden eerst door convectieve stromen naar het lucht-vloeistof-grensvlak getransporteerd en vervolgens door capillariteit in de vallen geplaatst. Capillaire krachten die door de bewegende meniscus worden uitgeoefend, werken op grotere schaal in vergelijking met krachten die betrokken zijn bij deeltjesinteracties.
Het assemblagemechanisme wordt dus niet beïnvloed door het materiaal, de afmetingen en de oppervlakte-eigenschappen van de deeltjes. Parameters zoals deeltjesconcentratie, de snelheid van de meniscus, temperatuur en oppervlaktespanning van de suspensie zijn de enige parameters die de opbrengst van het patroonproces beïnvloeden. De lezer kan een gedetailleerde beschrijving vinden van de invloed van de bovengenoemde parameters op het patroonproces in13,14,15. In de oorspronkelijke sCAPA-technologie13,14,15 werd het colloïdale patroonproces uitgevoerd in een open systeem en vereiste een zeer nauwkeurige piëzo-elektrische trap om de ophanging over de sjabloon te drijven. Dit platform maakt gebruik van een andere strategie en maakt het mogelijk om de patronen uit te voeren met standaardapparatuur die over het algemeen wordt gebruikt in microfluïdica in een gecontroleerde omgeving, waardoor de risico's van contaminatie van de monsters worden geminimaliseerd.
Dit microfluïdische platform werd eerst geoptimaliseerd op colloïdale deeltjes om regelmatige arrays van inerte deeltjes te creëren en vervolgens met succes toegepast op bacteriën. Beide microfluïdische platforms worden in dit artikel beschreven (figuur 1B,C). De meeste voorbereidende stappen en de experimentele apparatuur die in het protocol worden beschreven, zijn gemeenschappelijk voor de twee toepassingen (figuur 2). We rapporteren colloïdale patronen om aan te tonen dat de techniek kan worden gebruikt om meerdere sequentiële afzettingen op hetzelfde oppervlak uit te voeren om complexe, multimateriële patronen te creëren. In het bijzonder werd één enkel deeltje per val voor elke stap afgezet om colloïdale arrays te vormen met een specifieke geometrie en samenstelling, uitsluitend gedicteerd door de geometrie en vulvolgorde van de vallen. Wat bacteriële patronen betreft, worden enkele afzettingen beschreven, waardoor er één bacterie per val wordt afgezet. Zodra cellen op het oppervlak zijn gemodelleerd, wordt het microfluïdische kanaal gespoeld met medium om bacteriegroei te bevorderen, de voorbereidende stap van elke eencellige studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Silicium master voorbereiding
OPMERKING: De PDMS-sjablonen met de microgefabriceerde vallen die de sjabloon vormen voor colloïdale en microbiële patronen zijn vervaardigd volgens de methode die door Geissler et al. is geïntroduceerd. 17. De siliciummaster werd voorbereid door conventionele lithografie in een cleanroom. Zie de volgende stappen voor de procedure en de tabel met materialen voor de apparatuur.
- Ontwerp de functies met behulp van CAD-software (Computer Aided Design).
- Bereid het chroomglazen masker voor met een laag positieve fotoresist door de ontworpen functies bloot te leggen met een UV-directe laserschrijver.
- Ontwikkel het chroom-glazen masker met een spin-ontwikkelaar met behulp van een ontwikkelaar met een 1: 4 fotoresist/waterverhouding gedurende 15 s.
- Dompel het masker onder in chroom-etsmiddel gedurende 50 s.
- Plasma-behandel een 10 cm silicium wafer gedurende 3 min bij 600 W.
- Damp zet een laag hexamethyldisilizane af en bak bij 110 °C om de hechting naar de fotoresist te verbeteren.
- Deponeer een laag fotoresist op 4.500 × g gedurende 2 minuten.
- Stel de functie bloot aan UV via het chroomglazen masker met een maskeruitlijner gedurende 2 s en ontwikkel met een ontwikkelaar wat betreft het masker.
- Om de fabricage van de siliciummaster te voltooien, etst u de wafer via diepe reactieve ionenuitwisseling en past u de etstijd (<2 min) aan om de gewenste diepte te bereiken (gemeten met een profilometer).
2. Microkanaal schimmel voorbereiding
- Ontwerp het kanaal met CAD-software en snijd het met een slicersoftware om het ontworpen model om te zetten in instructies voor de 3D-printer, waarbij de snijafstand op 0,05 mm wordt ingesteld.
- Print het kanaal met een 3D-printer gedurende ~ 1 uur.
- Was en postcure de mal in een speciale uitharding en wasmachine.
- Doe de vorm in een container gevuld met pure isopropylalcohol (IPA) en draai de vloeistof (was gedurende 20 minuten). Haal de met IPA gevulde container uit de machine.
- Zodra de gewassen mal uit de IPA-container is verwijderd, plaatst u deze terug in de was- en uithardingsmachine en nabehandelt u deze gedurende 15 minuten bij 35 °C.
OPMERKING: De tabel met materialen rapporteert de 3D-printer en de uithardings- en wasmachine die wordt gebruikt in het matrijsvoorbereidingsprotocol. Het 3D-model werd gesneden met de eigen slicersoftware van de 3D-printer.
- Plaats de print 12 uur in een UV-oven en plaats hem 12 uur in een oven op 80 °C.
OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat al het polymeer wordt uitgehard en dat al het niet-uitgeharde polymeer uit de afdruk wordt verwijderd, omdat dit zou voorkomen dat PDMS uithardt. - Silaniseer de mal door dampafzetting van trichloorf (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silaan.
- Plaats de 3D-mal in een vacuümsiccator samen met 20 μL 100% geconcentreerd trichloorm (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaan gepipetteerd op een aluminiumfolie die dicht bij de mal is geplaatst.
- Creëer een vacuüm in de exsiccator om damp te genereren en laat 40 minuten staan.
- Verwijder de vorm van de exsiccator en spoel deze af met pure ethanol voordat u er PDMS op giet.
3. Fabricage van de microfluïdische chip
- Bereid een PDMS-mengsel door het elastomeer te mengen met zijn crosslinking-middel (Tabel met materialen). Roer het mengsel krachtig om de twee componenten gelijkmatig te mengen totdat luchtbellen zijn gevormd en het PDMS-mengsel er ondoorzichtig uitziet.
OPMERKING: De hoeveelheid cross-linker moet 10 gewichtsprocent van de hoeveelheid elastomeer zijn. - Ontgas het mengsel van elastomeer en crosslinking agent in een vacuüm exsiccator om de ingesloten luchtbellen te verwijderen. Breng het mengsel in de exsiccator over in de container die wordt gebruikt voor het mengen (stap 3.1). Ga door met het ontgassingsproces totdat alle bubbels zijn verwijderd en het mengsel er weer transparant uitziet.
OPMERKING: De tijd die doorgaans nodig is voor uitdroging is 30 minuten. - Giet 3 g van het mengsel op de siliciummaster om de sjabloon te produceren, die zal dienen als de "vloer" van de microfluïdische chip.
OPMERKING: De dikte van de PDMS-laag kan worden afgestemd door de hoeveelheid mengsel die op de siliciummaster wordt gegoten te wijzigen.- Om een sjabloon van 400 μm dik te verkrijgen, giet u 3 g PDMS op de siliciummaster, plaatst u de siliciummaster op een spincoater en spint u de laag op 21 × g gedurende 5 s en 54 × g gedurende 10 s en ontgas u vervolgens opnieuw zoals beschreven in stap 3.2 om ingesloten luchtbellen te verwijderen.
- Giet 20 g van het PDMS-mengsel op de 3D-geprinte mal om het microkanaal te maken, dat zal dienen als het "dak" van de microfluïdische chip, en ontgas het zoals beschreven in stap 3.2 gedurende 30 minuten.
- Bak zowel de siliciumwafel als de 3D-geprinte mal minstens 2 uur op 70 °C.
- Verwijder de PDMS-laag van de 3D-geprinte mal, snijd de PDMS met een mes rond de microkanalen en pons de gaten die zullen dienen als in- en uitlaat van het microfluïdische kanaal.
- Verwijder het PDMS van de siliciummaster en snijd de PDMS-laag in kleinere stukken met dezelfde afmetingen van de microfluïdische kanalen die bovenop de sjablonen worden gebonden.
- Wrijf de sjablonen en microkanalen voorzichtig in met een 1% reinigingsmiddeloplossing (zie de tabel met materialen) gedurende 5 minuten en spoel vervolgens af met gedeïoniseerd water. Spoel vervolgens de sjablonen en microkanalen met isopropanol en spoel ze af met gedeïoniseerd water. Droog de sjablonen en microkanalen gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur met perslucht op 1 bar.
- Plaats de sjablonen en de microkanalen in een plasmareiniger met de te verlijmen oppervlakken naar boven gericht. Schakel de plasmareiniger in en plasma behandel de sjablonen en de microkanalen gedurende 40 s. Haal ze uit de plasmareiniger en bind de microkanalen bovenop de sjablonen onmiddellijk door ze met elkaar in contact te brengen.
- Bewaar de microfluïdische chips vijf dagen in een oven bij 70 °C om pdms hydrofoob herstel te garanderen en een terugtrekkende contacthoek te hebben binnen het optimale bereik, tussen 30 en 60°10,11.
4. Bacteriële patronen
- Een dag voorafgaand aan het experiment groeit een populatie Escherichia coli (stam MG1655 prpsM-GFP). Ent de cultuur rechtstreeks uit de bevroren voorraad en kweek gedurende 20 uur in lysogeniebouillon (LB) medium in een schudderincubator bij 37 °C. Voeg 50 μg /ml kanamycine toe voor de cellen om het prpsM-GFP-plasmide te behouden.
- Stel op de dag van het experiment de boxincubator (figuur 2A) enkele uren voor het experiment in op 37 °C om een uniforme en stabiele temperatuur te hebben voordat het experiment wordt gestart. Plaats de spuitpomp en de verwarmde glasplaat op de microscooptrap (figuur 2B,C) en stel de temperatuur in op dezelfde temperatuur als de couveuse.
OPMERKING: De boxincubator waarin het hele systeem, inclusief de microscoop (figuur 2E), is ingesloten, zorgt ervoor dat gedurende het hele experiment een uniforme en constante temperatuur wordt gehandhaafd wanneer het kanaal met medium wordt gespoeld. - Plaats negentig minuten voor het experiment de microfluïdische chip in een vat gevuld met 100% ethanol (EtOH) en spoel het kanaal gedurende ten minste 10 minuten met 100% EtOH. Plaats de microfluïdische chip in een vacuümsiccator en ontgas gedurende ten minste 30 minuten. Vervang de EtOH met gedestilleerd water en vacuümbehandel de chip gedurende ten minste 30 minuten. Zet de microfluïdische chip gedurende 10 minuten in de oven bij 70 °C om eventuele sporen van vloeistof in het kanaal te verwijderen.
OPMERKING: Deze stap is nodig om bubbelvorming in het kanaal te voorkomen wanneer deze wordt gespoeld met kweekmedium. Dit bubbelpreventieprotocol is overgenomen van Wang et al.18. - Pipetteer 1 ml 3-(N-morfolino)propaansulfonzuur (MOPS) medium (1x) in een injectieflacon met centrifuge en voeg 10 μL 0,132 M kaliumfosfaat (K2HPO4) toe. Neem de nachtkweek uit de incubator van 37 °C en aliquot 100 μL in de injectieflacon van de centrifuge en centrifugeer de cultuur gedurende 2 minuten bij 2.300 × g. Pipetteer het supernatant voorzichtig uit de injectieflacons van de centrifuge en breng de pellet opnieuw op in 1 ml vers MOPS-medium met 0,015% v/v tween 20 en 0,01% v/v kaliumfosfaat.
OPMERKING: De typische concentratie van de bacteriële suspensie ligt in het bereik van 0,015-0,15 vol%, wat zorgt voor de vorming van een uitgebreide en mobiele accumulatiezone en de accumulatie van deeltjes op het substraat voorkomt. Het vervangen van het nachtmedium door vers medium minimaliseert de risico's van het vrijgeven van films van bacteriën op de sjabloon. Het gebrek aan koolstofbron in het verse medium voorkomt dat cellen in de suspensie groeien tijdens het patroonpatroon. Een concentratie van 0,015% v/v van Tween 20 in de suspensie is nodig om de contacthoek van de terugtrekkende vloeistof op de PDMS-sjabloon binnen het optimale bereik te laten vallen, tussen 30 en 60°. - Laad de bacteriële suspensie in een spuit van 1 ml en sluit de spuit aan op de chip via microfluïdische slangen.
- Om de verbinding tussen de spuit en de slang te bevestigen, steekt u direct een naald met een buitendiameter van 0,6 mm in de slang. Om te voorkomen dat de suspensie die in de inlaatomgeving over het kanaal achterblijft, wordt verstrooid, spoelt u vers medium door het gat dat tijdens het patroonproces als uitlaat wordt gebruikt (figuur 3A-III) in plaats van het gat dat als inlaat wordt gebruikt.
- Monteer de spuit op de spuitpomp en injecteer de suspensie in de microfluïdische chip via de inlaat aan het stroomopwaartse deel van het kanaal totdat de suspensie het sjabloongebied bedekt met vallen.
OPMERKING: Tijdens het vloeistofinjectieproces kan lucht ontsnappen via een uitlaat aan het stroomafwaartse uiteinde van het kanaal. - Stel de spuitpomp in om de bacteriële suspensie (figuur 3A-I) op te zuigen met een debiet van 0,07-0,2 μL/min, wat in de beschreven geometrie overeenkomt met een meniscuswijksnelheid van 80-100 μm/min.
- Bewaak het patroonproces via microscoopsoftware.
OPMERKING: Hier werd een vergroting van 10x gebruikt om de terugtrekkende meniscus op de sjabloon te controleren en een vergroting van 20x werd gebruikt om de afzetting van individuele bacteriën in de microfabricated vallen te volgen.
- Zodra de sjabloon is voorzien van een patroon met cellen (figuur 3A-II), verhoogt u de onttrekkingsstroomsnelheid om het microfluïdische kanaal snel te legen en spoelt u het met verse LB die eerder gedurende ten minste 30 minuten werd ontgast en bij 30 °C werd voorgewarmd.
- Stel de spuitpomp in op een debiet van 2 μL/min om het kanaal voorzichtig door te spoelen. Zodra het kanaal is gevuld, verhoogt u het debiet (15 μL/min) volgens de specifieke experimentele behoeften.
- Verkrijg beelden van groeiende bacteriën met de gewenste vergroting en tijdsinterval.
5. Colloïdale patronen
- Pipetteer 900 μL van een 0,015% v/v Tween 20 waterige oplossing in een injectieflacon met centrifuge en pipetteer 100 μL van de oorspronkelijke colloïdale suspensie erin. Centrifugeer de suspensie bij 13.500 × g gedurende 1 min. Verwijder voorzichtig het supernatant en vervang het door de waterige Tween 20 (0,015% v/v) oplossing. Herhaal dit proces drie keer om ervoor te zorgen dat het oplosmiddel van de leverancier volledig wordt vervangen door de voorraadsuspensie.
- Laad de colloïdale suspensie in een spuit van 1 ml en sluit de spuit aan op de chip via microfluïdische slangen. Injecteer de suspensie in de microfluïdische chip door de inlaat in het centrale gedeelte, aan het stroomopwaartse deel van het kanaal, en duw de suspensie geleidelijk in totdat de sjabloon is bedekt.
- Trek de colloïdale suspensie op met een stroomsnelheid van 0,07-0,2 μL / min, wat overeenkomt met een meniscus-terugtrekkende snelheid van 1-2 μm / min, en beeld het patroonproces in via microscoopsoftware. Gebruik 10x vergroting om de terugtrekkende meniscus op de sjabloon te controleren en 20x vergroting om de afzetting van individuele deeltjes in de microfabricated vallen te observeren. Verhoog de stroomsnelheid zodra de meniscus het einde van de sjabloon bereikt om het kanaal snel te legen.
OPMERKING: Colloïdale arrays die uit verschillende deeltjes bestaan, kunnen worden geproduceerd door het patroonproces van stap 5.1 tot en met 5.3 in serie uit te voeren. Het kanaal wordt geladen met een nieuwe colloïdale suspensie bij elke iteratie volgens de gewenste colloïdale arrayssamenstelling. Elke patroonstap voegt één deeltje toe aan de colloïdale array en kan sequentieel worden uitgevoerd totdat de vallen zijn gevuld met de gewenste deeltjessequentie. De samenstelling van de resulterende colloïdale arrays wordt uitsluitend bepaald door de volgorde van colloïdale suspensies die worden gebruikt om de vallen te vullen (figuur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een microfluïdisch platform dat capillariteitsondersteunde assemblage gebruikt om colloïdale deeltjes en bacteriën te patroon in vallen die microgefabriceerd zijn op een PDMS-sjabloon, werd ontwikkeld. Twee verschillende kanaalgeometrieën zijn ontworpen om de patroonvorming van colloïden en bacteriën te optimaliseren door de capillariteitsondersteunde assemblage. De eerste kanaalgeometrie (figuur 1B) bestaat uit drie 23 mm lange parallelle secties zonder fysieke barrière ertussen. De twee secties aan de zijkanten zijn 5 mm breed en 1 mm hoog, terwijl het centrale gedeelte 7 mm breed en 500 μm hoog is. Dit ontwerp helpt bij het handhaven van een goed gedefinieerde bewegende druppel met een terugtrekkende bolle meniscus. Het werkingsprincipe van dit platform wordt in detail beschreven door Pioli et al.11. Als het experiment het vullen van de laterale kanalen vereist, zoals in het geval van bacteriën die kweken, worden meestal luchtzakken gevormd. Om deze reden hebben we een tweede geometrie ontworpen en getest die het vulproces vereenvoudigt wanneer het kanaal wordt gespoeld met medium. In dit geval bestaat het platform (figuur 1C) uit een enkel recht kanaal van 20 mm lang, 3 mm breed en 500 μm hoog.
De temperatuur in het microfluïdische kanaal is een belangrijke parameter om een efficiënt depositieproces te garanderen. Het moet 15 °C boven het dauwpunt van het water worden gehouden om condensatie op het model te voorkomen. De verwarmde glasplaat onder het kanaal (figuur 2D) zorgt voor een uniforme temperatuur over de sjabloon om condensatie tijdens het patroonproces te voorkomen in het gebied dicht bij de vloeistof-luchtinterface, gekenmerkt door een hoge dampconcentratie in de lucht. De temperatuur van de verwarmde glasplaat moet dezelfde zijn als die van de incubator om condensatie op de sjabloon te voorkomen.
De rechte kanaalgeometrie werd gebruikt om stationair gefaseerde cellen (figuur 4A) van een fluorescerende E. coli-stam (MG1655 prpsM-GFP) te modelleren. Bacteriën werden afgezet in 83% van de 5.000 geanalyseerde vallen. De cellen werden eerst in de vallen geplaatst volgens het gepresenteerde protocol en vervolgens gedurende 4 uur gekweekt bij 37 °C in LB gespoeld op 10 mm/min. Patroonbacteriën hervatten de groei op verschillende tijdstippen binnen 1,5 uur vanaf het moment dat het kanaal was gevuld met verse LB (figuur 4B-I), met de mediaan op 44 min. Zodra de groei is hervat, beginnen afzonderlijke bacteriële cellen individuele kolonies te vormen, die zich uitbreiden (figuur 4B-II) totdat een oppervlaktelaag is gevormd (3,5 uur) en de resolutie van één cel verloren gaat (figuur 4B-III).
Dit proof-of-concept experiment toont aan dat capillariteitsondersteunde assemblage in een microfluïdisch kanaal kan worden gebruikt om een oppervlak met duizenden levensvatbare cellen met één bacterie te modelleren. Elf replicaties tonen aan dat patrooncellen in 45,5% van de gevallen binnen een venster van 7 uur groeiden. Vier uitgevoerde tests waarbij propidiumjodide (PI), een levend-dode vlek19, werd toegevoegd aan de verse LB die in het kanaal werd gespoeld nadat de afzetting bewees dat niet-groeiende, patroonvormige bacteriën niet bevlekt raakten. Omdat PI zich bindt aan DNA maar niet kan doordringen in cellen met een intact membraan, toont het PI-kleuringsexperiment aan dat noch het patroonproces, noch de uitdrogings- en rehydratatieprocessen het membraan van de cellen hebben beschadigd.
De driedelige kanaalgeometrie werd gebruikt om lineaire colloïdale arrays met verschillende samenstellingen te produceren door sequentiële patronen van colloïdale deeltjes uit te voeren. Figuur 5 toont de verschillende colloïdale arrays gevormd door sequentiële patronen, waaronder dimeren (figuur 5A,B) en trimers (figuur 5C), die respectievelijk twee en drie opeenvolgend gevangen deeltjes bevatten. Groene en rode fluorescerende polystyreendeeltjes werden gebruikt om zowel dimeren als trimers te assembleren. Analyse uitgevoerd over 55.000 vallen tonen aan dat groenrode (G-R) dimeren (figuur 5A, B) gemaakt door deeltjes met een diameter van 2 μm en 1 μm werden gevormd in respectievelijk 93% en 89% van de geanalyseerde vallen. Groen-rood-groene (G-R-G) trimers (Figuur 5C) werden gevormd in 52% van de 55.000 geanalyseerde vallen11. Dimeren en trimers werden geassembleerd door sequentiële afzettingen uit te voeren, waarbij de colloïdale suspensies in dezelfde richting bewogen over alle sequentiële afzettingen (figuur 3B). Als gevolg hiervan staan deeltjes die in elke afzettingsstap gevangen zitten in direct contact met die in de vorige.
Nauwkeurige positionering van deeltjes vereist geen direct contact tussen afgezette deeltjes. De afstand tussen deeltjes met patronen kan nauwkeurig worden geregeld door twee afzettingen in tegengestelde richtingen uit te voeren, waardoor dergelijke deeltjes aan de tegenovergestelde uiteinden van elke val worden gevangen (figuur 5D). De afstand tussen de ingesloten deeltjes kan worden afgestemd door vallen met de gewenste lengte te ontwerpen. Een extra mogelijkheid die het platform biedt, is chemische patronen van het oppervlak met micrometrische precisie. Dit resultaat kan worden bereikt door de sjabloon te modelleren met chemisch gefunctionaliseerde deeltjes11.
Figuur 1: Geometrieën en patroonproces van microfluïdische kanalen. (A) Schema van een zijaanzichtsectie van het microfluïdische kanaal tijdens het patroonvorming van colloïdale deeltjes. De vloeibare suspensie verdampt in het microfluïdische kanaal en convectieve stromen transporteren zwevende deeltjes naar het lucht-vloeistofinterface. Deeltjes worden dus opgehoopt en vormen de accumulatiezone. De spuitpomp trekt de vloeibare suspensie, waardoor deze zich terugtrekt en individuele deeltjes vast komen te zitten tijdens de vloeistofrecessie op de sjabloon. De pijl geeft de richting aan waarin de ophanging beweegt. (B) Schema van de kanaalgeometrie die wordt gebruikt om colloïdale deeltjes op de PDMS-sjabloon te modelleren. Het kanaal is 23 mm lang en 17 mm breed en bestaat uit drie secties: een centrale die 7 mm breed is en twee laterale die 5 mm breed zijn. De sjabloon bevindt zich op de vloer van het kanaal, in het centrale gedeelte. De doorsnede laat zien dat het centrale deel van het microfluïdische kanaal, waar de vloeibare suspensie gedurende het patroonproces is opgesloten, het ondiepste deel van het kanaal is en 500 μm hoog is, terwijl de twee laterale secties beide 1 mm hoog zijn. (C) Schema van de rechte kanaalgeometrie die wordt gebruikt om bacteriën te modelleren. Het microfluïdische apparaat bestaat uit een 20 mm lang, 3 mm breed en 500 μm hoog recht kanaal. Het rechthoekige gedeelte van dit microfluïdische apparaat, weergegeven in de doorsnede, vereenvoudigt het vulproces van het kanaal met medium. De SEM-afbeelding toont een klein deel van de PDMS-sjabloon met 2 μm lange, 1 μm brede en 500 nm diepe vallen erop gemicrofabriceerd. Schaalbalk = 2 μm. Afkortingen: PDMS = polydimethylsiloxaan; SEM = scanning elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schema van het platform voor sequentiële capillariteitsondersteunde assemblage in een microfluïdisch kanaal. (A) Box incubator. De boxincubator handhaaft een uniforme en constante temperatuur (hier 30 °C) in het microfluïdische kanaal. (B) Spuit geladen met vloeibare suspensie. De spuit wordt bestuurd door een spuitpomp (niet afgebeeld) en wordt gebruikt om de beweging van de vloeistof tijdens het patroonproces te regelen. (C) Verwarmde glasplaat. De verwarmde glasplaat wordt onder het microfluïdische kanaal geplaatst en zorgt voor een uniforme temperatuur (hier 30 °C) over de sjabloon, wat van cruciaal belang is om condensatie in de buurt van de lucht-vloeistofinterface te voorkomen. (D) Microfluïdische chip geladen met een vloeibare suspensie. De vloer van de microfluïdische chip draagt de vallen waarin bacteriën en colloïden tijdens het patroonproces worden gemodelleerd. (E) Microscoop. De verwarmde glasplaat en de microfluïdische chip worden op een microscooptrap geplaatst, waardoor volledige optische toegang wordt verleend tijdens het patroonproces en alle volgende stappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schema van de stappen die betrokken zijn bij bacteriële en colloïdale patronen. Elk paneel toont een binnenweergave van het microfluïdische kanaal en bevat slechts een klein deel van de PDMS-sjabloon. (A) Patroonvorming van bacteriën door capillariteitsondersteunde assemblage. (I) De bacteriële suspensie verdampt in het microfluïdische kanaal, waardoor convectieve stromen gesuspendeerde bacteriën naar het lucht-vloeistofinterface transporteren en zo de accumulatiezone vormen. Ondertussen wordt de suspensie getrokken door de spuitpomp en trekt zich terug op de sjabloon. De pijl geeft de richting aan waarin de bacteriële suspensie beweegt. De terugtrekkende suspensie veegt over de sjabloon en individuele cellen worden afgezet in de microgefabriceerde vallen. (II) Afgezette bacteriën worden blootgesteld aan lucht totdat het kanaal wordt gespoeld met vers medium. Het afzettingsproces is voorbij wanneer de vloeibare suspensie het einde van de sjabloon bereikt. (III) Het microfluïdische kanaal wordt gespoeld met vers medium (d.w.z. LB). De pijl geeft de richting aan waarin het verse medium wordt gespoeld. (B) Patroonvorming van colloïdale deeltjes door sequentiële capillariteitsondersteunde assemblage. (I) De colloïdale suspensie trekt zich tijdens het verdampen terug op de sjabloon en deeltjes hopen zich op aan het lucht-vloeistof-grensvlak en vormen de accumulatiezone. Individuele deeltjes worden afgezet in de vallen die microgefabriceerd zijn op de sjabloon. De pijl geeft de richting aan waarin de colloïdale ophanging beweegt. (II) Het depositieproces is voltooid wanneer de vloeibare suspensie het einde van het model bereikt. (III) Een tweede afzetting wordt in dezelfde richting uitgevoerd als de eerste afzetting om een tweede deeltje in elke val op het sjabloon te plaatsen. (IV) Zodra de tweede afzetting voorbij is, is de sjabloon voorzien van een patroon met dimeren van één groen en één rood deeltje. Afkortingen: PDMS = polydimethylsiloxaan; LB = Lysogenese bouillon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: PDMS-sjabloon met een patroon van E. coli -cellen (stam MG1655 prpsM-GFP). (A) SEM-beeld van individuele E. coli-cellen gevangen in vallen van 2 μm lang, 1 μm breed en 500 nm diep. Cellen zaten vast na één enkele afzetting. Schaalbalk = 2 μm. (B) Epifluorescentiebeelden van een klein deel van het PDMS-sjabloon (ongeveer 80 μm x 80 μm) met ingesloten cellen van E. coli nadat het microfluïdische kanaal is gevuld met kweekmedium (Lysogenesebouillon) met een beginsnelheid van 1,3 mm/min, die vervolgens wordt verhoogd tot 10 mm/min. Gevangen cellen groeien en delen meerdere keren gedurende 4 uur, uiteindelijk versmelten met cellen uit naburige vallen en bedekken het oppervlak. Schaalbalken = 10 μm. Afkortingen: PDMS = polydimethylsiloxaan; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Colloïdale clusters geassembleerd door sequentiële capillariteitsondersteunde deeltjesassemblage in het microfluïdische platform (eerste kanaalgeometrie). Epifluorescentiemicroscopiebeeld van (A) 15 dimeren samengesteld uit polystyreendeeltjes met een diameter van 2 μm met twee sequentiële afzettingen. (B) Dimeren (n = 15) samengesteld uit polystyreendeeltjes met een diameter van 1 μm met twee opeenvolgende afzettingen. (C) Trimers (n = 15) samengesteld uit polystyreendeeltjes met een diameter van 1 μm met drie opeenvolgende afzettingen. (D) Vallen (n = 15) met deeltjes die aan de uiteinden van elke valpatroon zijn aangebracht door twee opeenvolgende afzettingen in tegengestelde richtingen uit te voeren. De afstand tussen deeltjes in een val is 2 μm. Schaalbalken = 4 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven microfluïdische platform maakt het mogelijk om objecten van microformaat, zoals colloïden en bacteriën, in voorgeschreven ruimtelijke arrangementen op een PDMS-substraat te modelleren. De volledige controle over de omgevingsomstandigheden die microfluïdica biedt en de mogelijkheid om cellen met micrometrische precisie te modelleren die door sCAPA-technologie wordt verleend, maakt het een veelbelovend platform voor toekomstige fysiologie- en ecologiestudies.
In de experimenten die in dit werk worden gepresenteerd, werd de siliciummaster gerealiseerd met behulp van de fotoresist die wordt gerapporteerd in de Tabel van Materialen. Elke fotoresist die geschikt is om functies te produceren in het beschreven en bruikbare met PDMS-vorm, kan echter worden gebruikt. Hetzelfde geldt voor de 3D-printhars die wordt gebruikt om de microkanaalmal voor te bereiden. Elke hars die in staat is om kenmerken van de beschreven afmeting te produceren en compatibel is met PDMS-vormen, kan worden gebruikt.
In dit protocol optimaliseert het opslaan van de microfluïdische chips bij 70 °C gedurende 5 dagen de hydrofilie van het oppervlak (contacthoek die tussen 30 en 60° valt) wanneer Tween 20 wordt toegevoegd aan de bacteriële of colloïdale suspensie. Deze procedure garandeert de beste reproduceerbaarheid voor de terugtrekkende contacthoek onder deze experimentele omstandigheden; andere opslagtijden en temperaturen kunnen echter ook werken.
Twee toepassingen van deze microfluïdische techniek zijn gepresenteerd: 1) bacteriële patronen met individuele afzettingen van bacteriële cellen in de vallen op het PDMS-substraat, en 2) colloïdale patronen met sequentiële afzettingen van colloïden, het verkrijgen van colloïdale arrays van verschillende samenstellingen. Dit platform is volledig geoptimaliseerd om hoge opbrengsten van bacteriële depositie te garanderen, met duizenden cellen met een patroon op de PDMS-sjabloon. De combinatie van capillariteitsondersteunde assemblage en microfluïdica zorgt voor eencellige resolutie en een stabiele stroom van voedingsstoffen gedurende enkele uren, met volledige optische toegang gedurende het hele proces. De patrooncellen zijn in staat om de groei te hervatten zodra het microfluïdische kanaal wordt gespoeld met vers medium, hoewel de levensvatbaarheid van de patrooncellen nog moet worden geoptimaliseerd.
Momenteel is de belangrijkste beperking van deze techniek het gebrek aan groei van patrooncellen in 54,5% van de experimenten binnen een venster van 7 uur. Dit aspect kan verband houden met de specifieke bacteriesoort en moet verder worden onderzocht om de oorzaak van de stress te bepalen die voorkomt dat cellen opnieuw groeien. Blootstelling aan lucht en de kracht die door de meniscus wordt uitgeoefend tijdens het patroonproces kunnen tot de belangrijkste bijdragen aan bacteriële stress behoren. Verschillende mogelijke oplossingen kunnen worden geïmplementeerd om dergelijke bronnen van stress te verminderen, waaronder het gebruik van diepere vallen om de kracht die door de meniscus op cellen wordt uitgeoefend tijdens het patroonproces te verminderen. Een extra optie om de stress die gepaard gaat met blootstelling aan lucht te verminderen, zou zijn om de temperatuur van de verwarmde glasplaat te verlagen. Een temperatuur van 30 °C zorgt voor een voldoende verdampingssnelheid van de vloeibare suspensie tijdens het patroonproces en zou de hitte waaraan bacteriën worden blootgesteld verminderen nadat ze op de sjabloon zijn gemodelleerd voordat het medium wordt gespoeld.
Eenmaal volledig geoptimaliseerd, stellen we ons voor dat dit platform zal worden gebruikt in een verscheidenheid aan biologische studies met kwantitatieve eencellige analyse. De high-throughput aard van de techniek maakt het mogelijk om duizenden cellen te modelleren, waardoor grote statistieken binnen dezelfde experimentele arena worden verkregen. Volledige optische toegang maakt het mogelijk om het gedrag, de groei en de moleculaire activiteiten van grote aantallen afzonderlijke micro-organismen in de loop van de tijd te volgen, waardoor grote voordelen worden geboden bij de studie van fenotypische heterogeniteit onder homogene omgevingsomstandigheden. Het microfluïdische karakter van dit platform zorgt voor volledige controle over omgevingsomstandigheden zoals mediasamenstelling, stroomsnelheid en temperatuur, om er maar een paar te noemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de steun van SNSF PRIMA-subsidie 179834 (aan E.S.), een ETH Research Grant ETH-15 17-1 (R. S.) en een Gordon and Betty Moore Foundation Investigator Award on Aquatic Microbial Symbiosis (grant GBMF9197) (R. S.). De auteurs bedanken Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (Universiteit van Granada, Spanje) voor de SEM-beeldvorming van bacteriën en voor de inzichtelijke discussies. De auteurs bedanken Dr. Jen Nguyen (University of British Columbia, Canada), Dr. Laura Alvarez (ETH Zürich, Zwitserland), Cameron Boggon (ETH Zürich, Zwitserland) en Dr. Fabio Grillo voor de inzichtelijke discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin - Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
