Summary
マイクロ流体プラットフォーム内の毛細管現象支援アセンブリを用いて、細菌やコロイドなどの液体中に浮遊するマイクロサイズの物体をポリジメチルシロキサン基板上の所定のアレイにパターニングする技術を提示する。
Abstract
定義された空間配置への微生物の制御されたパターニングは、微生物生理学および相互作用の研究を含む、広範囲の生物学的用途のためのユニークな可能性を提供する。最も単純なレベルでは、微生物の正確な空間パターニングは、多数の個々の細胞の信頼性の高い長期イメージングを可能にし、距離依存の微生物 - 微生物相互作用を定量的に研究する能力を変革する。よりユニークなことに、マイクロ流体技術によって提供される正確な空間パターニングと環境条件の完全な制御を組み合わせることで、微生物生態学における単一細胞研究のための強力で汎用性の高いプラットフォームが提供されます。
このホワイトペーパーでは、マイクロ流体チャネル内で微生物の汎用性とユーザー定義のパターンを生成し、長期的かつ高スループットのモニタリングのための完全な光アクセスを可能にするマイクロ流体プラットフォームを紹介します。この新しいマイクロ流体技術は、毛細管現象支援粒子アセンブリに基づいており、マイクロ流体チャネル内の蒸発懸濁液の制御された動きから生じる毛細管力を利用して、ポリジメチルシロキサン(PDMS)基板上に微細化されたトラップのアレイに個々のマイクロサイズの物体を堆積させる。シーケンシャルデポジションは、トラップのジオメトリと充填シーケンスによってのみ決定される、単一または複数のタイプのマイクロサイズのオブジェクトの所望の空間レイアウトを生成する。
プラットフォームは、異なる寸法および材料のコロイド粒子を使用して較正されており、多様なコロイドパターンを生成し、捕捉された粒子の表面官能化を実行するための強力なツールであることが証明されています。さらに、プラットフォームを微生物細胞上で試験し、モデル細菌として 大腸菌 細胞を使用した。何千もの個々の細胞を表面にパターン化し、その成長を経時的にモニターした。このプラットフォームでは、単一細胞堆積とマイクロ流体技術を組み合わせることで、微生物の幾何学的パターニングと環境条件の正確な制御の両方が可能になります。したがって、予備実験によって示されているように、単一の微生物の生理学と微生物と微生物の相互作用の生態学への窓が開かれます。
Introduction
単一の微生物の空間パターニングは、特にマイクロ流体デバイスなどの環境条件を完全に制御できる実験分野では、幅広い文脈で非常に望ましい。例えば、微生物を規則的な配列に配置することで、多数の個々の細胞を正確にイメージングし、それらの増殖、生理機能、環境刺激に応答した遺伝子発現、および薬物感受性の研究を可能にする。また、細胞コミュニケーション(例えば、クォーラムセンシング)、交配(例えば、藻類 - 細菌共生)、または拮抗作用(例えば、アレロパシー)に関する研究において特に関心のある細胞間相互作用を研究することを可能にする。細胞生理・進化研究1、細胞間相互作用研究2、表現型分化スクリーニング3、環境モニタリング4、薬物スクリーニング5 は、このような定量的単一細胞解析を実現できる技術から大きな恩恵を受けることができる分野の一つです。
近年、ホログラフィック光学トラップ6および不均一な表面機能化方法7,8,9,10から単一細胞ケモスタット11および液滴マイクロ流体12まで、単一細胞を単離および処理するためのいくつかの戦略が提案されている。これらの方法は、技術的に非常に要求が厳しいか、細胞生理機能に影響を与え、長期間にわたって研究できる微生物をパターン化するための高スループットプラットフォームを提供しず、単一セル分解能、完全な光学アクセス、および環境条件の制御を保証します。この論文の目標は、毛細管現象支援アセンブリを介してPDMS表面上の所定の空間配置にマイクロメトリック精度で細菌をパターン化するプラットフォームを記述することです。このプラットフォームは、微生物の正確で柔軟な空間パターニングを可能にし、そのマイクロ流体の性質のおかげで、環境条件に対する完全な光学アクセスと制御を可能にします。
このプラットフォームの背後にある技術は、マイクロ流体プラットフォーム16に統合されたsCAPA13,14,15(シーケンシャルキャピラリーアシスト粒子アセンブリ)と名付けられた近年開発されたアセンブリ技術です。蒸発する液滴のメニスカスは、マイクロ流体チャネル内のパターン化されたポリジメチルシロキサン(PDMS)基板上を後退しながら、液体中に懸濁した個々のコロイド粒子を基板上に微細化されたマイクロメトリックウェルにトラップする毛細管力を発揮する(図1A)。懸濁粒子は、最初に対流電流によって気液界面に輸送され、次いで毛細管現象によってトラップに入れられる。移動メニスカスによって加えられる毛細血管力は、粒子相互作用に関与する力と比較して、より大きなスケールで作用する。
したがって、アセンブリ機構は、粒子の材料、寸法、および表面特性の影響を受けない。粒子濃度、メニスカスの速度、温度、懸濁液の表面張力などのパラメータは、パターニングプロセスの収率に影響を与える唯一のパラメータです。読者は、パターニングプロセスに対する前述のパラメータの影響の詳細な説明をin13、14、15で見つけることができる。オリジナルのsCAPA技術13,14,15では、コロイドパターニングプロセスはオープンシステムで行われ、テンプレートを横切ってサスペンションを駆動するために高精度の圧電ステージが必要でした。このプラットフォームは、異なる戦略を活用し、制御された環境でマイクロフルイディクスで一般的に使用される標準機器でパターニングを実行できるため、サンプルを汚染するリスクを最小限に抑えることができます。
このマイクロ流体プラットフォームは、まずコロイド粒子上で最適化され、不活性粒子の規則的な配列を作成し、その後細菌に首尾よく適用されました。このホワイトペーパーでは、両方のマイクロ流体プラットフォームについて説明します(図1B、C)。プロトコルに記載されている準備ステップと実験装置のほとんどは、2つのアプリケーションで共通です(図2)。我々は、コロイドパターニングを報告して、この技術を使用して同じ表面上で複数の連続的な堆積を行い、複雑でマルチマテリアルパターンを作成できることを実証する。特に、各ステップごとに1つの単一粒子を堆積させて、トラップの形状および充填シーケンスによってのみ決定される特定の形状および組成を有するコロイド配列を形成する。細菌のパターニングに関しては、単一の堆積が記載されており、その結果、トラップごとに1つの細菌が堆積する。細胞が表面にパターニングされると、マイクロ流体チャネルは、細菌増殖を促進するために培地でフラッシュされる、任意の単一細胞研究の予備段階である。
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Protocol
1. シリコンマスターの準備
注:コロイドおよび微生物パターニングのためのテンプレートを形成する微細加工トラップを有するPDMSテンプレートは、Geisslerらによって導入された方法に従って作製された。17。 シリコンマスターは、クリーンルーム内で通常のリソグラフィー法により作製した。手順については次の手順を参照し、機器 の材料表 を参照してください。
- コンピュータ支援設計 (CAD) ソフトウェアを使用して機能を設計します。
- UVダイレクトレーザーライターで設計された特徴を露光することによって、ポジ型フォトレジストの層を有するクロムガラスマスクを準備する。
- クロムガラスマスクを、1:4のフォトレジスト対水比で15秒間現像液を用いてスピン現像液で現像する。
- マスクをクロムエッチャントに50秒間浸します。
- 10cmのシリコンウェーハを600Wで3分間プラズマ処理する。
- ヘキサメチルジシリザンの層を蒸着し、110°Cでベークするとフォトレジストに対する密着性が向上した。
- フォトレジストの層を4,500× g で2分間堆積させる。
- マスクアライナーでクロムガラスマスクを通して2秒間UVに露出させ、マスクは現像液で現像します。
- シリコンマスターの製造を完了するには、深い反応性イオン交換を介してウェーハをエッチングし、所望の深さ(プロフィロメータで測定)を達成するためにエッチング時間(<2分)を調整します。
2. マイクロ流路金型作製
- CADソフトウェアでチャンネルを設計し、スライサーソフトウェアでスライスして、デザインしたモデルを3Dプリンタの指示に変換し、スライス距離を0.05mmに設定します。
- チャンネルを3Dプリンタで約1時間印刷します。
- 金型を専用の養生洗濯機で洗って後硬化させます。
- 純粋なイソプロピルアルコール(IPA)を充填した容器に型を入れ、液体を渦巻き(20分間洗浄する)。IPAで満たされた容器を機械から取り出します。
- 洗浄した金型をIPA容器から取り出したら、洗浄硬化機に戻し、35°Cで15分間ポストキュアします。
注: 材料表 には、金型準備プロトコルで使用されている3Dプリンタと硬化および洗濯機が報告されています。3Dモデルは、3Dプリンタ独自のスライサーソフトウェアでスライスされました。
- プリントをUVオーブンに12時間置き、80°Cのオーブンに12時間置きます。
メモ:この手順では、PDMSが硬化するのを防ぐため、すべてのポリマーが硬化し、硬化していないすべてのポリマーが印刷物から除去されます。 - トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シランの蒸着によりモールドをシラン化する。
- 3Dモールドを真空デシケーターに入れ、100%濃縮トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シランを金型の近くに置いたアルミニウム箔にピペットで20 μL入れます。
- デシケーター内に真空を作り、蒸気を発生させ、40分間放置する。
- デシケーターから金型を取り出し、PDMSを注ぐ前に純粋なエタノールですすいでください。
3. マイクロ流体チップの作製
- エラストマーとその架橋剤を混合してPDMS混合物を調製する(材料表)。気泡が形成され、PDMS混合物が不透明に見えるまで、混合物を激しく攪拌して2つの成分を均一にブレンドする。
注:架橋剤の量は、エラストマーの量の10重量%でなければならない。 - エラストマーと架橋剤の混合物を真空デシケーターで脱気し、捕捉された気泡を除去する。混合物をデシケーター内で混合に用いた容器に移す(ステップ3.1)。すべての気泡が除去され、混合物が再び透明に見えるまで、脱気プロセスを続けます。
注: 通常、乾燥に必要な時間は 30 分です。 - シリコンマスターに3gの混合物を注ぎ、マイクロ流体チップの「床」として機能するテンプレートを生成します。
メモ: PDMS 層の厚さは、シリコンマスターに注がれる混合液の量を変更することで調整できます。- 厚さ400μmのテンプレートを得るには、シリコンマスターに3gのPDMSを注ぎ、シリコンマスターをスピンコーターの上に置き、21× g で5秒間、54× g で10秒間スピンコートした後、ステップ3.2で説明したように再び脱気して閉じ込められた気泡を除去した。
- 3Dプリントされたモールドに20gのPDMS混合物を注ぎ、マイクロ流体チップの「屋根」として機能するマイクロチャネルを作り、ステップ3.2の説明に従って30分間脱気する。
- シリコンウェーハと3Dプリントモールドの両方を70°Cで少なくとも2時間焼きます。
- PDMS層を3Dプリントされた金型から剥がし、マイクロ流路の周りの刃でPDMSを切断し、マイクロ流体流路の入口と出口として機能する穴を打ち抜きます。
- PDMSをシリコンマスターから剥がし、PDMS層をテンプレートの上に結合されるマイクロ流体チャネルと同じ寸法の小さな断片に切断します。
- テンプレートとマイクロチャネルを1%洗剤溶液( 材料表を参照)で5分間優しくこすり、イオン交換水ですすいでください。次に、テンプレートとマイクロチャネルをイソプロパノールですすぎ、脱イオン水ですすいでください。テンプレートとマイクロチャンネルを室温で1バールの圧縮空気で1分間乾燥させます。
- テンプレートとマイクロチャンネルをプラズマクリーナーに入れ、接着する表面を上向きにします。プラズマクリーナーの電源を入れ、テンプレートとマイクロチャンネルを40秒間プラズマ処理します。プラズマクリーナーから取り出し、テンプレートの上にマイクロチャンネルを互いに接触させてすぐに接着します。
- マイクロ流体チップを70°Cのオーブンに5日間保管してPDMS疎水性回復を確保し、30〜60°10,11の最適な範囲内の後退接触角を有する。
4. 細菌パターニング
- 実験の1日前に、 エシェリヒア・コリ (株MG1655 prpsM-GFP)の集団を増殖させた。凍結ストックから直接培養物を接種し、37°Cのシェーカーインキュベーター内のリゾゲンブロス(LB)培地中で20時間一晩生育させた。 細胞に50 μg/mLのカナマイシンを加え、prpsM-GFPプラスミドを保持する。
- 実験当日、実験開始前に均一で安定した温度を有するように実験数時間前にボックスインキュベーター(図2A)を37°Cに設定した。シリンジポンプと加熱したガラス板を顕微鏡ステージ(図2B、C)にセットアップし、ボックスインキュベーターと同じ温度に温度を設定します。
注:顕微鏡(図2E)を含むシステム全体が囲まれたボックスインキュベーターは、チャネルを媒体でフラッシュしたときに、実験全体を通して均一で一定の温度が維持されることを保証します。 - 実験の90分前に、マイクロ流体チップを100%エタノール(EtOH)で満たされた容器に入れ、少なくとも10分間、チャネルを100%EtOHでフラッシュする。マイクロ流体チップを真空デシケーターに入れ、少なくとも30分間脱気する。EtOHを蒸留水と交換し、チップを少なくとも30分間真空処理する。マイクロ流体チップを70°Cのオーブンに10分間入れ、流路に残った微量の液体を除去した。
注:このステップは、培養培地を流したときのチャネル内の気泡形成を防止するために必要である。この気泡防止プロトコルは、Wangら18から適応された。 - 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)培地(1x)のピペット1 mLを遠心分離バイアルに入れ、10 μLの0.132 Mリン酸カリウム(K2HPO4)を加える。一晩培養物を37°Cのインキュベーターから取り出し、100 μLを遠心分離機バイアルにアリコートし、培養物を2,300 × gで2分間遠心分離した。遠心分離機バイアルから上清を軽くピペットで取り出し、ペレットを0.015% v/vのTween 20および0.01% v/vのリン酸カリウムを含む1mLの新鮮なMOPS培地に再懸濁する。
注:細菌懸濁液の典型的な濃度は0.015〜0.15体積%の範囲であり、これは拡張された移動性蓄積ゾーンの形成を保証し、基質上の粒子の蓄積を防止する。一晩培地を新鮮な培地に交換すると、テンプレート上の細菌のフィルムを放出するリスクが最小限に抑えられます。新鮮な培地中の炭素源の欠如は、テンプレートパターニング中に細胞が懸濁液中で増殖するのを妨げる。懸濁液中のTween 20の0.015% v/vの濃度は、PDMSテンプレート上の後退液の接触角が30〜60°の最適範囲内に収まるようにするために必要である。 - 細菌懸濁液を1mLシリンジにロードし、マイクロ流体チューブを介してシリンジをチップに接続します。
- シリンジとチューブの接続を固定するには、外径0.6mmの針をチューブに直接挿入します。流路を挟んで入口近傍に残留する懸濁液が飛散するのを避けるために、パターニングプロセス中に出口として使用される孔(図3A−III)を通して新鮮な媒体を流す。
- シリンジをシリンジポンプに取り付け、懸濁液がテンプレート領域をトラップで覆うまで、チャネルの上流部分に位置する入口を通って懸濁液をマイクロ流体チップに注入する。
メモ: 液体注入プロセス中、空気はチャネルの下流端にある出口から逃げることがあります。 - シリンジポンプをセットして、細菌懸濁液(図3A-I)を0.07-0.2μL/minの流速で引き抜くように設定しますが、これは記載された形状ではメニスカス後退速度80-100μm/minに相当します。
- 顕微鏡ソフトウェアを介してパターニングプロセスを監視します。
注:ここでは、テンプレート上の後退メニスカスを監視するために10倍の倍率を使用し、微細加工トラップへの個々の細菌の沈着を監視するために20倍の倍率を使用した。
- テンプレートが細胞でパターン化されたら(図3A-II)、引き抜き流量を増やしてマイクロ流体チャネルをすばやく空にし、以前に少なくとも30分間脱気し、30°Cで予温した新鮮なLBで洗い流します。
- シリンジポンプを流量2 μL/minに設定して、流路を静かに流します。チャネルが満たされたら、特定の実験ニーズに応じて流量(15 μL/分)を増やします。
- 所望の倍率および時間間隔で増殖する細菌の画像を取得する。
5. コロイドパターニング
- 遠心分離機バイアルに0.015% v/v Tween 20水溶液900 μLをピペットし、元のコロイド懸濁液100 μLをピペットに入れます。懸濁液を13,500 × g で1分間遠心分離する。上清を静かに取り除き、Tween 20水溶液(0.015% v/v)と交換してください。このプロセスを3回繰り返して、サプライヤーの溶媒をストックサスペンションから完全に交換できるようにします。
- コロイド懸濁液を1mLシリンジにロードし、マイクロ流体チューブを介してシリンジをチップに接続します。流路の上流部にある中央部に位置する入口からマイクロ流体チップに懸濁液を注入し、テンプレートが覆われるまで懸濁液を徐々に押し込む。
- メニスカス後退速度1~2μm/minに相当する0.07~0.2μL/minの流速でコロイド懸濁液を抜き取り、顕微鏡ソフトでパターニング過程を画像化します。10倍の倍率を使用してテンプレート上の後退メニスカスを監視し、20倍の倍率を使用して微細加工トラップへの個々の粒子の堆積を観察します。メニスカスがテンプレートの端に達したら流量を増やして、チャンネルをすばやく空にします。
注: 複数のパーティクルで構成されるコロイド配列は、ステップ 5.1 から 5.3 までのパターニング プロセスを直列に実行することによって生成できます。チャネルは、所望のコロイド配列の構成に従って、各反復で新しいコロイド懸濁液をロードされる。各パターニングステップは、コロイド配列に1つの粒子を追加し、トラップが所望の粒子の配列で満たされるまで連続して実行することができる。得られたコロイド配列の組成は、トラップを充填するために使用されるコロイド懸濁液の配列によってのみ与えられる(図3B)。
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Representative Results
毛細管現象支援アセンブリを利用して、PDMSテンプレート上に微細加工されたトラップにコロイド粒子と細菌をパターン化するマイクロ流体プラットフォームが開発されました。毛細管現象支援アセンブリによるコロイドと細菌のパターニングを最適化するために、2つの異なるチャネル形状が設計されています。最初のチャネル形状(図1B)は、長さ23mmの平行な3つのセクションで構成され、それらの間に物理的な障壁はありません。側面の2つのセクションは幅5mm、高さ1mmで、中央セクションは幅7mm、高さ500μmです。この設計は、後退する凸状のメニスカスを有する明確に定義された可動液滴を維持するのに役立つ。このプラットフォームの動作原理は、Pioliらによって詳細に説明されています。実験で横方向の流路を充填する必要がある場合、細菌培養の場合のように、通常、エアポケットが形成される。このため、チャネルを媒体でフラッシュしたときの充填プロセスを簡素化する2番目のジオメトリを設計してテストしました。この場合、プラットフォーム(図1C)は、長さ20mm、幅3mm、高さ500μmの単一の直線チャネルで構成されています。
マイクロ流体チャネル内の温度は、効率的な堆積プロセスを確実にするための重要なパラメータである。テンプレート上の結露を避けるために、水の露点より15°C高く維持する必要があります。流路の下にある加熱されたガラス板(図2D)は、空気中の蒸気濃度が高いことを特徴とする液体 - 空気界面に近い領域でのパターニングプロセス中の結露を防ぐために、テンプレート全体で均一な温度を保証します。加熱されたガラス板の温度は、テンプレート上の結露を避けるために、ボックスインキュベーターの温度と同じでなければなりません。
ストレートチャネル形状を利用して、蛍光大腸菌株(MG1655 prpsM-GFP)の静止期細胞(図4A)をパターン化しました。細菌は、分析された5,000個のトラップの83%に沈着した。細胞を最初に提示されたプロトコールに従ってトラップに入れ、続いて10mm/minでフラッシュしたLB中で37°Cで4時間増殖させた。パターン化された細菌は、チャネルが新鮮なLBで満たされたときから1.5時間以内に異なる時間に増殖を再開し(図4B-I)、中央値は44分であった。増殖が再開されると、単一の細菌細胞が個々のコロニーを形成し始め、表層が形成され(3.5時間)、単一細胞分解能が失われるまで(図4B-II)、それが拡大する(図4B-III)。
この概念実証実験は、マイクロ流体チャネル内の毛細管現象支援アセンブリを使用して、何千もの生存可能な単一細菌細胞で表面をパターン化できることを示しています。11の複製は、パターン化された細胞が7時間以内の症例の45.5%で成長したことを示している。生死染色剤19であるヨウ化プロピジウム(PI)を、沈着後にチャネルに流された新鮮なLBに添加して行った4つの試験は、増殖していないパターン化された細菌が染色されないことを証明した。PIはDNAに結合するが、無傷の膜では細胞に浸透できないため、PI染色実験は、パターニングプロセスも乾燥および再水和プロセスも細胞の膜を損傷しないことを示している。
3セクションチャネル形状を使用して、コロイド粒子のシーケンシャルパターニングを行うことにより、異なる組成の線形コロイドアレイを作製した。図5は、それぞれ2つおよび3つの連続的に捕捉された粒子を含む、二量体(図5A、B)および三量体(図5C)を含む、逐次パターニングによって形成された異なるコロイドアレイを示す。緑色および赤色の蛍光ポリスチレン粒子は、二量体および三量体の両方を組み立てるために使用された。55,000個のトラップにわたって実施された分析は、直径2μmおよび1μmの粒子によって作られた緑赤色(G-R)二量体(図5A,B)が、それぞれ分析されたトラップの93%および89%において形成されたことを示している。緑-赤-緑(G-R-G)三量体(図5C)は、分析された55,000個のトラップの52%に形成されました11。二量体および三量体は、コロイド懸濁液がすべての逐次堆積にわたって同じ方向に移動する、逐次堆積を実行することによって組み立てられた(図3B)。その結果、各堆積工程で捕捉された粒子は、前の堆積工程で捕捉された粒子と直接接触する。
粒子の正確な位置決めは、堆積粒子間の直接接触を必要としない。パターン化された粒子間の距離は、反対方向に2回の堆積を行い、各トラップの両端にそのような粒子を捕捉することによって正確に制御することができる(図5D)。トラップされた粒子間の距離は、所望の長さのトラップを設計することによって調整することができる。プラットフォームによって提供される追加の可能性は、マイクロメトリック精度での表面の化学パターニングです。この結果は、化学的に官能化された粒子11を用いてテンプレートをパターニングすることによって達成することができる。
図1:マイクロ流体チャネルの形状とパターニングプロセス (a)コロイド粒子のパターニング時のマイクロ流体流路の側面図断面の概略図。液体懸濁液はマイクロ流体チャネルの内部で蒸発し、対流電流は浮遊粒子を気液界面に向かって輸送する。粒子はこのようにして蓄積され、蓄積ゾーンを形成する。シリンジポンプは液体懸濁液を引っ張り、後退を促し、個々の粒子はテンプレート上の液体後退中に捕捉される。矢印は、サスペンションが移動している方向を表す。(B)PDMSテンプレート上のコロイド粒子のパターン化に使用されるチャネル形状の概略図。チャネルは長さ23mm、幅17mmで、幅7mmの中央セクションと幅5mmの2つの側面セクションで構成されています。テンプレートは、チャネルのフロアの中央セクション内にあります。断面は、液体懸濁液がパターニングプロセス全体を通して閉じ込められているマイクロ流体チャネルの中心部がチャネルの最も浅い部分であり、高さ500μmであるのに対し、2つの側断面は両方とも1mmの高さであることを示している。(C)バクテリアのパターン化に使用される直線チャネル形状の概略図。マイクロ流体デバイスは、長さ20mm、幅3mm、高さ500μmの直線流路で構成されています。このマイクロ流体装置の矩形断面は、断面に示されており、媒体によるチャネルの充填プロセスを簡素化する。SEM画像は、PDMSテンプレートのごく一部に、長さ2μm、幅1μm、深さ500nmのトラップを微細加工したものを示しています。スケールバー = 2 μm。略語:PDMS=ポリジメチルシロキサン;SEM = 走査型電子顕微鏡。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マイクロ流体チャネルにおけるシーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリ用のプラットフォームの概略図。 (A)ボックスインキュベーター。ボックスインキュベーターは、マイクロ流体チャネルの内部で均一で一定の温度(ここでは30°C)を維持します。(b)液体懸濁液を装填したシリンジ。シリンジは、シリンジポンプ(図示せず)によって制御され、パターニングプロセス中の液体の動きを制御するために使用される。(c)加熱されたガラス板。加熱されたガラス板は、マイクロ流体チャネルの下に配置され、テンプレート全体で均一な温度(ここでは30°C)を保証し、これは空気 - 液体界面の近傍での結露を避けるために重要である。(d)液体懸濁液を装填したマイクロ流体チップ。マイクロ流体チップの床には、パターニングプロセス中に細菌やコロイドがパターン化されるトラップがあります。(E)顕微鏡。加熱されたガラス板とマイクロ流体チップを顕微鏡ステージ上に配置して、パターニングプロセスおよび以下のすべてのステップ中に完全な光学アクセスを付与します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:細菌およびコロイドパターニングに関与するステップの概略図。 各パネルは、マイクロ流体チャネルの内部図を示し、PDMSテンプレートのごく一部のみを含む。(A)毛細管現象支援アセンブリによる細菌のパターニング。(i)細菌懸濁液はマイクロ流体流路の内部で蒸発し、対流電流を引き起こして懸濁細菌を気液界面に輸送し、蓄積ゾーンを形成する。その間、懸濁液はシリンジポンプによって引っ張られ、テンプレート上で後退する。矢印は、細菌懸濁液が移動している方向を表す。後退した懸濁液はテンプレートを横切って掃引され、個々の細胞は微細加工トラップに堆積する。(II)沈着した細菌は、チャネルが新鮮な培地で洗い流されるまで空気に曝される。堆積プロセスは、液体懸濁液がテンプレートの端に達すると終了する。(III)マイクロ流体チャネルを、新鮮な媒体(すなわち、LB)でフラッシュする。矢印は、新鮮な培地が洗い流される方向を表す。(B)逐次毛細管現象支援アセンブリによるコロイド粒子のパターニング。(i)コロイド懸濁液は蒸発しながらテンプレート上を後退し、粒子が気液界面に蓄積して蓄積ゾーンを形成する。個々の粒子は、テンプレート上に微細加工されたトラップに堆積される。矢印は、コロイド懸濁液が移動している方向を表す。(II)液体懸濁液がテンプレートの端部に達した時点で堆積プロセスが完了する。(III)第2の堆積を第1の堆積と同じ方向に実行し、第2の粒子をテンプレート上の各トラップに配置する。(IV)2回目の堆積が終了すると、テンプレートは1つの緑色粒子と1つの赤色粒子の二量体でパターン化される。略語:PDMS=ポリジメチルシロキサン;LB = リソゲニーブロス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4: 大腸菌 (株MG1655 prpsM-GFP)細胞でパターン化したPDMSテンプレート。 (a)長さ2μm、幅1μm、深さ500nmのトラップに捕捉された個々の 大腸菌 細胞のSEM像。細胞は、1回の堆積後に捕捉された。(B)マイクロ流体チャネルを培養液(リゾゲニーブロス)で初速1.3mm/minで充填した後、 大腸菌 の捕捉細胞を用いたPDMSテンプレートのごく一部(約80μm x 80μm)の落射蛍光画像。トラップされた細胞は4時間にわたって複数回増殖して分裂し、最終的に隣接するトラップからの細胞と合流して表面を覆う。スケールバー = 10 μm。略語:PDMS=ポリジメチルシロキサン;GFP = 緑色蛍光タンパク質。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マイクロ流体プラットフォームにおける逐次キャピラリティー支援粒子アセンブリ(第1チャネル形状)を介して組み立てられたコロイドクラスター。 (A)直径2μmのポリスチレン粒子から組み立てられた15二量体の落射蛍光顕微鏡像を2回連続して堆積させた。(b)直径1μmのポリスチレン粒子から2つの連続した堆積で組み立てられた二量体(n=15)。(c)直径1μmのポリスチレン粒子から3つの連続した堆積を有する三量体(n = 15)を組み立てた。(D)2つの連続した堆積を反対方向に実行することによって、各トラップの四肢に粒子をパターン化したトラップ(n = 15)。トラップ内の粒子間の距離は2μmである。スケール バー = 4 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するマイクロ流体プラットフォームは、コロイドや細菌などのマイクロサイズの物体をPDMS基板上の所定の空間配置にパターニングすることを可能にする。マイクロフルイディクスが提供する環境条件を完全に制御し、sCAPA技術によって付与されたマイクロメトリック精度で細胞をパターン化する能力により、将来の生理学および生態学研究にとって非常に有望なプラットフォームとなっています。
本研究で提示した実験では、 材料表に報告されたフォトレジストを用いてシリコンマスターを実現した。しかし、PDMS成形で説明され、使用可能なサイズ範囲のフィーチャーを製造するのに適した任意のフォトレジストを使用することができる。マイクロ流路モールドの作製に用いた3D印刷用樹脂についても同様である。記載された寸法の特徴を生成し、PDMS成形と互換性のある任意の樹脂を使用することができる。
このプロトコルでは、マイクロ流体チップを70°Cで5日間保管することで、Tween 20を細菌またはコロイド懸濁液に添加したときの表面親水性(接触角が30〜60°の間)が最適化されます。この手順は、これらの実験条件下での後退接触角の最良の再現性を保証する。ただし、他の保存時間と温度も機能する場合があります。
このマイクロ流体技術の2つの用途が提示されている:1)PDMS基板上のトラップへの細菌細胞の個々の堆積を伴う細菌パターニング、および2)コロイドの逐次堆積を含むコロイドパターニングは、異なる組成のコロイドアレイを得る。このプラットフォームは、PDMSテンプレート上に数千の細胞がパターン化され、細菌沈着の高収率を保証するために完全に最適化されています。キャピラリティーアシストアセンブリとマイクロフルイディクスの組み合わせにより、シングルセル分解能と数時間の栄養素の安定した流れが保証され、プロセス全体を通して完全な光学アクセスが保証されます。パターン化された細胞は、マイクロ流体チャネルが新鮮な培地でフラッシュされると増殖を再開することができますが、パターン化された細胞の生存率はまだ最適化する必要があります。
現在、この技術の主な制限は、7時間以内の実験の54.5%でパターン化された細胞の成長がないことです。この側面は、特定の細菌種に関連している可能性があり、細胞が再増殖するのを妨げるストレスの根本原因を決定するためにさらに調査する必要がある。空気曝露およびパターニングプロセス中にメニスカスによって加えられる力は、細菌ストレスの主な寄与の1つであり得る。このようなストレス源を軽減するために、パターニングプロセス中にメニスカスによって細胞に加えられる力を低減するためのより深いトラップの使用を含む、いくつかの可能な解決策を実施することができる。空気曝露に関連するストレスを低減するための追加の選択肢は、加熱されたガラス板の温度を低下させることである。30°Cの温度は、パターニングプロセス中の液体懸濁液の十分な蒸発速度を保証し、培地がフラッシュされる前にテンプレート上にパターニングされた後、細菌が曝露される熱を低減するであろう。
完全に最適化されると、このプラットフォームは定量的な単一細胞分析を含むさまざまな生物学的研究に使用されることを想定しています。この手法のハイスループットな性質により、数千のセルのパターニングが可能になり、同じ実験領域内で大きな統計情報が得られます。完全な光アクセスにより、多数の単一微生物の挙動、成長、および分子活動を経時的に追跡できるため、均質な環境条件下での表現型不均一性の研究に大きな利点があります。このプラットフォームのマイクロ流体特性は、ほんの数例を挙げると、媒体組成、流量、温度などの環境条件に対する完全な制御性を保証します。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin - Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
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