Summary
우리는 미세 유체 플랫폼에서 모세혈관 보조 어셈블리를 사용하여 박테리아 및 콜로이드와 같은 액체에 매달려있는 미세 크기의 물체를 폴리디메틸실록산 기판에 규정 된 배열로 패턴화하는 기술을 제시합니다.
Abstract
정의된 공간 배열로 미생물의 통제된 패터닝은 미생물 생리학 및 상호 작용의 연구를 포함하여 생물학 응용의 넓은 범위에 대한 독특한 가능성을 제공합니다. 가장 간단한 수준에서, 미생물의 정확한 공간 패터닝은 개별 세포의 많은 수의 믿을 수 있고 장기적인 화상 진찰을 가능하게 하고 거리 의존적인 미생물 상호 작용을 정량적으로 공부하는 기능을 변환할 것입니다. 보다 유일하게, 미세유체 기술이 제공하는 바와 같이 정확한 공간 패터닝과 환경 조건에 대한 완전한 제어를 결합하면 미생물 생태학의 단일 세포 연구를 위한 강력하고 다재다능한 플랫폼을 제공할 것입니다.
이 논문은 미생물 채널 내에서 다재다능하고 사용자 정의한 미생물 패턴을 생성하는 미세 유체 플랫폼을 제공하여 장기적이고 높은 처리량 모니터링을 위한 완벽한 광학 액세스를 제공합니다. 이 새로운 미세 유체 기술은 모세혈관 보조 입자 조립을 기반으로 하며 미세 유체 채널 내부의 증발 현탁액의 제어된 모션으로 발생하는 모세관력을 악용하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판에 미세매단된 트랩 배열에 개별 미세 크기의 물체를 증착합니다. 순차 적 기탁은 트랩의 형상및 충진 시퀀스에 의해서만 지시되는 단일 또는 다중 유형의 마이크로 크기의 객체의 원하는 공간 레이아웃을 생성합니다.
플랫폼은 다양한 치수와 재료의 콜로이드 입자를 사용하여 보정되었습니다 : 그것은 다양한 콜로이드 패턴을 생성하고 갇힌 입자의 표면 기능화를 수행하는 강력한 도구로 입증되었습니다. 더욱이, 플랫폼은 모델 박테리아로 대장균 세포를 사용하여 미생물 세포에서 시험되었다. 수천 개의 개별 세포가 표면에 패턴화되었고 시간이 지남에 따라 성장을 모니터링했습니다. 이 플랫폼에서 단일 세포 증착 및 미세 유체 기술의 결합을 통해 미생물의 기하학적 패턴화와 환경 조건의 정밀한 제어를 모두 허용합니다. 그것은 이렇게 단 하나 세균의 생리학 및 예비 실험에 의해 도시된 세균 성 상호 작용의 생태로 창을 엽니다.
Introduction
단일 미생물의 공간 패터닝, 특히 미세 유체 장치와 같은 환경 조건을 완전히 제어 할 수있는 실험 분야 내에서 광범위한 맥락에서 매우 바람직합니다. 예를 들어, 미생물을 정규 배열로 배열하면 많은 수의 개별 세포와 그들의 성장, 생리학, 환경 자극에 대한 반응의 유전자 발현 및 약물 감수성에 대한 연구의 정확한 이미징을 허용할 것입니다. 또한 세포 통신(예를 들어, 쿼럼 센싱), 교차 공급(예를 들어, 조류 세균 공생증) 또는 길항성(예를 들어, 알로파증)으로 연구에 특히 관심이 있는 세포 상호 작용을 연구할 수 있으며, 서로 에 비해 세포의 공간 국산화를 완전히 제어할 수 있습니다. 세포 생리학 및 진화 연구1, 세포 세포 상호 작용 연구2, 표현형 분화 스크리닝3, 환경 모니터링4 및 약물 스크리닝5 는 이러한 정량적 단일 세포 분석을 달성 할 수있는 기술로부터 크게 혜택을 누릴 수있는 분야 중 하나입니다.
단일 세포를 분리하고 처리하기 위한 몇 가지 전략이 최근 몇 년 동안 제안되었으며, 홀로그램 광학 트랩6 및 이질표면 기능화 방법7,8,9,10 ~ 단일 세포 chemostats11 및 액적 미세 유체12. 이러한 방법은 기술적으로 매우 까다롭거나 세포 생리학에 영향을 미치며 장기간 연구할 수 있는 미생물을 패턴화하는 고처리량 플랫폼을 제공하지 못하여 단일 세포 해상도, 완전한 광학 액세스 및 환경 조건에 대한 제어를 보장합니다. 이 논문의 목표는 모세관 보조 어셈블리를 통해 PDMS 표면의 소정의 공간 배열로 미세 메트릭 정밀도로 박테리아를 패턴화하는 플랫폼을 설명하는 것입니다. 이 플랫폼은 미생물의 정밀하고 유연한 공간 패터닝을 허용하고 미세유체 특성 덕분에 환경 조건에 대한 완전한 광학 액세스 및 제어기능을 가능하게 합니다.
이 플랫폼의 이면에 있는 기술은 최근 몇 년 동안 개발된 조립 기술으로, 미세유체 플랫폼에 통합된 sCAPA13,14,15(순차 모세혈관 지원 입자 조립)입니다. 증발하는 액체 액적의 반월 상연은, 미세유체 채널 내부의 패턴 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판을 후퇴시키면서, 액체에 매달린 개별 콜로이드 입자를 기판에 미세하게 변형된 미세메트릭 우물(도 1A)으로 트랩하는 모세관력을 발휘한다. 일시 중단된 입자는 먼저 대류 전류에 의해 공기-액체 인터페이스로 이송된 다음 모세관에 의해 트랩에 배치됩니다. 움직이는 반월상 연골에 의해 가해지는 모세관력은 입자 상호 작용에 관여하는 힘에 비해 더 큰 규모로 작용합니다.
따라서, 어셈블리 메커니즘은 입자의 재료, 치수 및 표면 특성에 의해 영향을 받지 않는다. 입자 농도, 반월상 연골의 속도, 온도 및 서스펜션의 표면 장력과 같은 파라미터는 패터닝 공정의 수율에 영향을 미치는 유일한 파라미터입니다. 독자는 13,14,15에서 패터닝 공정에 앞서 언급한 매개 변수의 영향에 대한 자세한 설명을 찾을 수 있습니다. 원래 sCAPA 기술13,14,15에서, 콜로이드 패터닝 공정은 개방형 시스템에서 수행되었고 템플릿을 가로질러 서스펜션을 구동하기 위해 고정밀 압전 단계가 필요했습니다. 이 플랫폼은 다른 전략을 악용하고 제어 된 환경에서 일반적으로 미세 유체에 사용되는 표준 장비로 패터닝을 수행 할 수 있으므로 샘플을 오염시킬 위험을 최소화합니다.
이 미세 유체 플랫폼은 먼저 콜로이드 입자에 최적화되어 불활성 입자의 정기적 인 배열을 만든 다음 박테리아에 성공적으로 적용되었습니다. 두 미세 유체 플랫폼은 이 백서에 설명되어 있습니다(그림 1B, C). 프로토콜에 기재된 대부분의 준비 단계 및 실험 장비는 두 응용 프로그램에 대해 공통적입니다(그림 2). 콜로이드 패터닝을 보고하여 이 기술을 사용하여 동일한 표면에서 여러 순차 적 기탁을 수행하여 복잡하고 다중 물질적인 패턴을 만들 수 있음을 입증합니다. 특히, 트랩의 형상 및 충진 시퀀스에 의해서만 지시된 특정 형상 및 컴포지션을 가진 콜로이드 어레이를 형성하기 위해 각 단계에 대해 트랩당 하나의 단일 입자가 증착되었다. 세균 패턴에 관해서는, 단일 기탁이 설명되어 트랩 당 하나의 박테리아가 증착됩니다. 일단 세포가 표면에 패턴화되면, 미세 유체 채널은 세균 성장을 촉진하기 위해 매체로 플러시된다, 어떤 단일 세포 연구의 예비 단계.
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Protocol
1. 실리콘 마스터 준비
참고: 콜로이드 및 미생물 패터닝을 위한 템플릿을 형성하는 마이크로 패브릭 트랩을 포함하는 PDMS 템플릿은 가이슬러 등에서 도입한 방법에 따라 제작되었다. 17. 실리콘 마스터는 클린룸에서 기존의 리소그래피에 의해 제조되었다. 장비의 절차 및 재료 표에 대한 다음 단계를 참조하십시오.
- CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 기능을 디자인합니다.
- UV 다이렉트 레이저 라이터로 디자인된 기능을 노출하여 긍정적인 포토레지스트 레이어로 크롬 글래스 마스크를 준비합니다.
- 1:4 포토레지스트대 물 비율을 1:4로 사용하여 스핀 개발자와 함께 크롬 유리 마스크를 개발합니다.
- 50 s에 대 한 크롬 etchant에 마스크를 담그다.
- 플라즈마 처리 는 600 W에서 3 분 동안 10cm 실리콘 웨이퍼를 처리합니다.
- 증기-예틸드실리자네층을 예치하고 110°C에서 굽아 포토레지스트쪽으로 접착을 개선한다.
- 포토레지스트 레이어를 4,500× g 로 2분 동안 증정합니다.
- 2s용 마스크 정렬기로 크롬 글래스 마스크를 통해 UV에 기능을 노출하고 마스크에 대한 개발자와 함께 개발합니다.
- 실리콘 마스터의 제조를 완료하려면 깊은 반응이온 교환을 통해 웨이퍼를 식히고 에칭 시간(<2분)을 조정하여 원하는 깊이(profilometer로 측정)를 달성합니다.
2. 마이크로 채널 금형 준비
- CAD 소프트웨어로 채널을 설계하고 슬라이서 소프트웨어로 슬라이스하여 설계된 모델을 3D 프린터의 지침으로 변환하여 슬라이스 거리를 0.05mm로 설정합니다.
- ~1h의 3D 프린터로 채널을 인쇄합니다.
- 전용 경화 및 세탁기로 금형을 세척하고 후처리하십시오.
- 순수한 이소프로필 알코올(IPA)으로 채워진 용기에 금형을 넣고 액체를 소용돌이치십시오 (20 분 동안 세척). IPA로 채워진 용기를 기기에서 꺼내십시오.
- 세척된 금형이 IPA 용기에서 제거되면 세척 및 경화기에 다시 넣고 35°C에서 15분 동안 포스트큐어를 처리합니다.
참고: 재료 테이블 은 금형 준비 프로토콜에 사용되는 3D 프린터와 경화 및 세탁기를 보고합니다. 3D 모델은 3D 프린터의 독자적인 슬라이서 소프트웨어로 슬라이스되었습니다.
- 12 시간 동안 UV 오븐에 인쇄를 놓고 12 시간 동안 80 °C의 오븐에 놓습니다.
참고: 이 단계는 모든 폴리머가 경화되고 모든 경화되지 않은 폴리머가 PDMS가 경화되는 것을 방지하기 때문에 인쇄물에서 제거되도록 합니다. - 트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸)의 증기 증착을 통해 금형을 실란화한다.
- 3D 몰드을 진공 건조기에 넣고 100% 농축 트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실레인 파이펫과 함께 금형에 가깝게 배치된 알루미늄 호일에 파이펫을 넣습니다.
- 건조기에서 진공을 만들어 증기를 생성하고 40분 동안 둡니다.
- 데시케이터에서 금형을 제거하고 PDMS를 붓기 전에 순수 에탄올로 헹구십시오.
3. 미세 유체 칩의 제조
- 제고제(재료표)와 엘라스토머를 혼합하여 PDMS 혼합물을 준비합니다. 혼합물을 격렬하게 저어서 기포가 형성되고 PDMS 혼합물이 불투명해 보일 때까지 두 성분을 균일하게 혼합합니다.
참고: 교차 링커의 양은 엘라스토머의 무게에 의해 10%여야 합니다. - 갇힌 기포를 제거하기 위해 진공 건조기에서 엘라스토머와 교차 연결제의 혼합물을 탈가스. 혼합에 사용되는 용기에 건조기내의 혼합물을 전달(단계 3.1). 모든 거품이 제거되고 혼합물이 다시 투명해 보일 때까지 탈기 공정을 계속합니다.
참고: 탈수에 일반적으로 필요한 시간은 30분입니다. - 실리콘 마스터에 혼합물 3 g을 부어 미세 유체 칩의 "바닥"역할을하는 템플릿을 생성합니다.
참고: PDMS 층의 두께는 실리콘 마스터에 부어진 혼합물의 양을 변경하여 조정할 수 있습니다.- 400 μm 두께의 템플릿을 얻으려면 실리콘 마스터에 PDMS 3 g을 붓고, 실리콘 마스터를 스핀 코트에 넣고, 스핀 코트는 21 × g 에서 5 s 및 54 × g 에 대해 10 s로, 그리고 3.2 단계에서 설명된 대로 다시 드가하여 갇힌 기포를 제거합니다.
- 3D 프린팅 금형에 PDMS 혼합물 20g을 부어 마이크로채널을 만들고, 이는 미세 유체 칩의 "지붕"역할을 하고, 30분 동안 3.2단계에서 설명된 바와 같이 분해한다.
- 실리콘 웨이퍼와 3D 인쇄 금형을 70°C에서 2시간 이상 굽습니다.
- 3D 인쇄 금형에서 PDMS 층을 껍질을 벗기고, 마이크로 채널 주위에 블레이드로 PDMS를 자르고, 미세 유체 채널의 입구와 출구역할을 하는 구멍을 펀치합니다.
- 실리콘 마스터에서 PDMS를 껍질을 벗기고 템플릿 위에 결합될 미세 유체 채널의 동일한 치수로 PDMS 층을 작은 조각으로 자른다.
- 1% 세제 용액( 재료 표 참조)을 사용하여 템플릿과 마이크로채널을 부드럽게 문지른 다음 탈이온화된 물로 헹구십시오. 다음으로 템플릿과 마이크로 채널을 이소프로파놀로 헹구고 탈이온화된 물로 헹구습니다. 1 bar에서 압축 공기로 1 분 동안 실온에서 템플릿과 마이크로 채널을 건조시십시오.
- 서피스가 접합된 플라즈마 클리너에 템플릿과 마이크로채널을 배치합니다. 플라즈마 클리너를 켜고 플라즈마는 템플릿과 40 초마이크로 채널을 처리합니다. 플라즈마 클리너에서 꺼내서 템플릿 위에 있는 마이크로 채널을 즉시 결합하여 서로 접촉하십시오.
- PDMS 소수성 회복을 보장하고 최적의 범위 내에서 후퇴 접촉 각을 가지고, 사이 30 과 60 ° 10,11 을 보장하기 위해 5 일 동안 70 °C에서 오븐에 미세 유체 칩을 저장합니다.
4. 세균 패터닝
- 실험 하루 전에, 대장균 의 인구를 성장 (균주 MG1655 prpsM-GFP). 냉동 육수로부터 직접 배양을 접종하고 37°C에서 셰이커 인큐베이터에서 리소제니 국물(LB) 배지에서 20시간 동안 하룻밤 동안 자랍니다. prpsM-GFP 플라스미드를 유지하기 위해 세포를 위해 50 μg/mL의 카나마이신을 추가합니다.
- 실험 당일, 실험 전에 상자 인큐베이터(도 2A)를 실험 전에 몇 시간 전에 균일하고 안정적인 온도를 가지도록 설정하여 실험을 시작한다. 주사기 펌프를 설정하고 현미경 단계(그림 2B,C)에 가열된 유리 플레이트를 설정하여 박스 인큐베이터와 동일한 온도로 온도를 설정합니다.
참고: 현미경(그림 2E)을 포함한 전체 시스템이 밀폐되어 있는 박스 인큐베이터는 채널이 매체로 플러시될 때 전체 실험에서 균일하고 일정한 온도를 유지하도록 합니다. - 실험 90분 전에 100% 에탄올(EtOH)으로 채워진 용기에 미세유체 칩을 넣고 100% EtOH로 채널을 10분 이상 세척합니다. 미세 유체 칩을 진공 건조기와 데가스에 적어도 30분 간 배치합니다. EtOH를 증류수로 교환하고 칩을 최소 30분 동안 진공 처리합니다. 마이크로 유체 칩을 70°C에서 10분 동안 오븐에 넣어 채널에 남아 있는 액체의 흔적을 제거합니다.
참고: 이 단계는 배양 매체로 플러시 채널의 거품 형성을 방지하기 위해 필요합니다. 이 거품 방지 프로토콜은 Wang et al.18에서 채택되었습니다. - 파이펫 1 mL 3-(N-morpholino)프로파네설포닉산(MOPS) 배지(1x)를 원심분리기 바이알에 넣고 0.132M 칼륨 인산염(K2HPO4)의 10 μL을 추가한다. 37°C 인큐베이터및 알리쿼트 100 μL에서 하룻밤 문화를 원심분리기 바이알으로 꺼내 2분 × g에서 원심분리기로 한다. 원심분리기 바이알에서 상체를 부드럽게 피펫하고, 0.015% v/v의 Tween 20 및 0.01% v/v의 칼륨 인산염으로 신선한 MOPS 배지 1mL로 펠릿을 재차 질한다.
참고: 세균현탁액의 전형적인 농도는 0.015-0.15vol%의 범위에 있으며, 이는 확장 및 이동식 축적 영역의 형성을 보장하고 기판에 입자의 축적을 방지합니다. 하룻밤 매체를 신선한 매체로 교체하면 템플릿에 박테리아 필름을 방출할 위험이 최소화됩니다. 신선한 배지에서 탄소 공급원이 부족하면 템플릿 패터닝 중에 세포가 현탁액에서 자라는 것을 방지할 수 있습니다. 서스펜션에서 Tween 20의 0.015% v/v의 농도는 30~60°의 최적의 범위 내에 속하는 PDMS 템플릿의 후퇴액체의 접촉 각에 필요하다. - 세균 현탁액을 1mL 주사기에 적재하고 주사기를 미세유체 튜브를 통해 칩에 연결합니다.
- 주사기와 튜브 사이의 연결을 확보하려면 외지0.6mm의 바늘을 튜브에 직접 삽입하십시오. 채널 을 가로 질러 입구 부근에 남아있는 서스펜션을 분산하지 않도록하기 위해, 입구로 사용되는 구멍이 아닌 패터닝 과정에서 콘센트로 사용되는 구멍을 통해 신선한 매체를 플러시한다(도 3A-III).
- 주사기 펌프에 주사기를 장착하고 서스펜션이 트랩으로 템플릿 영역을 덮을 때까지 채널의 상류 부분에 위치한 입구를 통해 미세 유체 칩에 서스펜션을 주입합니다.
참고: 액체 주입 과정에서 공기는 채널의 하류 끝에 있는 콘센트를 통해 빠져나갈 수 있습니다. - 주사기 펌프를 0.07-0.2 μL/min의 유속으로 철회하도록 주사기 펌프를 설정하여, 이는 기술된 기하학에서 80-100 μm/min의 반월상 연골 후퇴 속도에 해당한다.
- 현미경 소프트웨어를 통해 패터닝 프로세스를 모니터링합니다.
참고: 여기서, 10배배율은 템플릿에서 후퇴하는 반월상연골을 모니터링하는 데 사용되었고, 20배배배율은 개별 박테리아의 증착을 미세가공된 함정으로 모니터링하는 데 사용되었다.
- 템플릿이 세포(그림 3A-II)로 패턴화되면, 금출 유량을 증가하여 미세 유체 채널을 신속하게 비우고 이전에 30분 이상 탈유하고 30°C에서 예동된 신선한 LB로 플러시합니다.
- 주사기 펌프를 2 μL/min의 유량으로 설정하여 채널을 부드럽게 플러시합니다. 채널이 채워지면 특정 실험 요구에 따라 유량(15 μL/min)을 증가시킵니다.
- 원하는 배율 및 시간 간격으로 박테리아가 자라는 이미지를 획득합니다.
5. 콜로이드 패터닝
- 0.015% v/v 트위엔 20수성 용액의 파이펫 900 μL을 원심분리기 바이알과 파이펫 100 μL로 원래 콜로이드 서스펜션의 들어올림. 1분 동안 13,500 × g 의 서스펜션원심분리. 상체를 부드럽게 제거하고 수성 트위엔 20 (0.015 % v / v) 용액으로 교체하십시오. 이 프로세스를 세 번 반복하여 공급업체의 용매를 재고 정지에서 완전히 교체할 수 있도록 합니다.
- 콜로이드 서스펜션을 1mL 주사기에 적재하고 주사기를 미세유체 튜브를 통해 칩에 연결합니다. 채널의 상류 부분에 있는 중앙 섹션 내에 있는 입구를 통해 미세 유체 칩에 서스펜션을 주입하고 템플릿이 적용될 때까지 서스펜션을 점진적으로 밀어 넣습니다.
- 0.07-0.2 μL/min의 유속으로 콜로이드 서스펜션을 철회하고, 반월상 연골 후퇴 속도에 해당하는 1-2 μm/min, 현미경 소프트웨어를 통해 패터닝 공정을 이미지화한다. 10배 배율을 사용하여 템플릿의 후퇴 하는 반월 상 연골을 모니터링하고 20 배율로 개별 입자의 증착을 미세 가공 된 트랩으로 관찰하십시오. 반월 상 연골이 템플릿의 끝에 도달하면 유량을 늘려 채널을 빠르게 비웁시다.
참고: 여러 입자로 구성된 콜로이드 어레이는 5.1단계에서 5.3단계부터 5.3단계의 패터닝 공정을 연속하여 실행하여 생성될 수 있다. 채널은 원하는 콜로이드 어레이의 컴포지션에 따라 각 반복에 새 콜로이드 서스펜션이 로드됩니다. 각 패터닝 단계는 콜로이드 어레이에 하나의 입자를 추가하고 트랩이 원하는 입자의 시퀀스로 채워질 때까지 순차적으로 실행할 수 있습니다. 결과 콜로이드 어레이의 조성물은 트랩을 채우는 데 사용되는 콜로이드 서스펜션의 시퀀스에 의해서만 주어집니다(도 3B).
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Representative Results
모세혈관 보조 어셈블리를 이도하여 콜로이드 입자와 박테리아를 PDMS 템플릿에 미세하게 제작된 트랩으로 패턴화하는 미세유체 플랫폼이 개발되었습니다. 두 개의 서로 다른 채널 지오메트리는 모세관 보조 어셈블리를 통해 콜로이드와 박테리아의 패터를 최적화하도록 설계되었습니다. 첫 번째 채널 지오메트리(그림 1B)는 물리적 장벽이 없는 3개의 23mm 길이의 평행 섹션으로 구성됩니다. 측면의 두 섹션은 폭 5mm, 높이 1mm이며 중앙 부분은 폭 7mm, 높이는 500 μm입니다. 이 디자인은 후퇴 볼록 모양의 반월 상연으로 잘 정의 된 움직이는 물방울을 유지하는 데 도움이됩니다. 이 플랫폼의 작동 원리는 Pioli 등 al.11에 의해 자세히 설명됩니다. 실험이 박테리아 배양의 경우와 같이 측면 채널을 채우는 것이 필요한 경우 공기 주머니가 일반적으로 형성됩니다. 이러한 이유로 채널이 매체로 플러시될 때 충진 프로세스를 간소화하는 두 번째 형상을 설계하고 테스트했습니다. 이 경우 플랫폼(그림 1C)은 길이 20mm, 너비 3mm 및 500 μm 높이의 직선 채널로 구성됩니다.
미세 유체 채널의 온도는 효율적인 증착 공정을 보장하는 중요한 매개 변수입니다. 템플릿의 응축을 피하기 위해 물 이슬점 위에 15°C를 유지해야 합니다. 채널(도 2D) 아래의 가열된 유리 판은 공기 중의 높은 증기 농도를 특징으로 하는 액체 공기 인터페이스에 가까운 영역에서 패터닝 공정 중에 응축을 방지하기 위해 템플릿 전체에 걸쳐 균일한 온도를 보장합니다. 가열 된 유리 플레이트의 온도는 템플릿의 응축을 피하기 위해 상자 인큐베이터의 온도와 같아야합니다.
직선 채널 지오메트리는 형광 대장균 균주(MG1655 prpsM-GFP)의 고정 된 위상 세포 (도 4A)로 이용되었다. 박테리아는 분석된 5,000개의 함정의 83%에 증착되었습니다. 세포는 제시된 프로토콜에 따라 트랩에 먼저 배치되었고, 이후 10mm/min에서 플러시된 LB에서 37°C에서 4시간 동안 성장하였다. 패턴 박테리아는 채널이 신선한 LB (그림 4B-I)로 채워졌을 때로부터 1.5 시간 이내에 다른 시간에 성장을 재개했으며 중앙값은 44 분이었습니다. 성장이 재개되면, 단일 세균 세포는 표면 층이 형성될 때까지 확장 (도 4B-II) 확장 개별 식민지형성을 시작 (3.5 h) 및 단세포 해상도가 손실됩니다 (도 4B-III).
이 개념 증명 실험은 미세 유체 채널에서 모세혈관 보조 조립을 사용하여 수천 개의 실행 가능한 단일 박테리아 세포로 표면을 패턴화하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 11개의 복제는 패턴처리된 세포가 7h 창 내의 케이스의 45.5%에서 증가했다는 것을 보여줍니다. 4개의 시험은 증착 후에 채널로 플러시된 신선한 LB에, 살아있는 죽은 얼룩 (PI) 인 propidium 요오드 (PI)를 추가한 것을, 패턴이 없는 박테리아가 얼룩지지 않았다는 것을 증명했습니다. PI가 DNA에 결합하지만 그대로 막으로 세포를 관통할 수 없기 때문에 PI 염색 실험은 패터닝 과정이나 건조 및 수화 과정이 세포의 멤브레인을 손상시키지 않는다는 것을 보여줍니다.
3단 채널 지오메트리는 콜로이드 입자의 순차적 패터닝을 수행하여 서로 다른 조성물을 가진 선형 콜로이드 어레이를 생성하는 데 사용되었습니다. 도 5는 각각 2개 및 3개의 순차적으로 갇힌 입자를 포함하는 디머(도 5A, B) 및 트리머(그림 5C)를 포함하는 순차적 패터닝을 통해 형성된 상이한 콜로이드 어레이를 나타낸다. 녹색 및 빨간색 형광 폴리스티렌 입자는 디머와 트리머를 모두 조립하는 데 사용되었습니다. 55,000개 이상의 트랩을 실시한 분석에 따르면 직경 2μm 및 1 μm의 입자에 의해 만들어진 녹색 빨간색(G-R) 디머(그림 5A,B)가 각각 분석된 트랩의 93%와 89%로 형성되었다. 그린-레드그린(G-R-G) 트리머(그림 5C)는 분석된 트랩111의 52%로 형성되었다. 디머와 트리머는 순차적 기탁을 실행하여 조립되었으며, 콜로이드 서스펜션은 모든 순차 적 기탁(그림 3B)에서 동일한 방향으로 이동합니다. 그 결과, 각 증착 단계에 갇힌 입자는 이전 증착 단계에 갇힌 입자와 직접 접촉한다.
입자의 정확한 위치는 증착된 입자 간의 직접적인 접촉이 필요하지 않습니다. 패턴 입자 사이의 거리는 반대 방향으로 두 개의 기탁을 수행하여 정확하게 제어할 수 있으므로 각 트랩의 반대쪽 끝에 이러한 입자를 트래핑할 수 있습니다(그림 5D). 갇힌 입자 사이의 거리는 원하는 길이의 트랩을 설계하여 조정할 수 있습니다. 플랫폼에서 제공하는 추가 가능성은 미세 메트릭 정밀도표면의 화학 적 패터닝입니다. 이러한 결과는 화학적으로 기능화된 입자11로 템플릿을 패터닝하여 얻을 수 있다.
그림 1: 미세 유체 채널의 형상 및 패터닝 공정. (A) 콜로이드 입자의 패터닝 중에 미세 유체 채널의 측면 뷰 섹션의 회로도. 액체 현탁액은 미세 유체 채널 내부로 증발하고 대류 전류는 부유 된 입자를 공기 액체 인터페이스로 운반합니다. 따라서 입자가 축적되어 축적 영역을 형성합니다. 주사기 펌프는 액체 현탁액을 당겨 물러날 것을 유도하고 개별 입자는 템플릿의 액체 경기 침체 중에 갇히게됩니다. 화살표는 서스펜션이 이동하는 방향을 나타냅니다. (B) PDMS 템플릿에서 콜로이드 입자를 패턴화하는 데 사용되는 채널 형상의 회로도. 채널은 길이 23mm, 너비 17mm이며, 길이가 7mm이고 폭이 5mm인 측면 2개 섹션의 세 가지 섹션으로 구성되어 있습니다. 템플릿은 중앙 섹션 내의 채널 바닥에 있습니다. 단면은 액체 현탁액이 패터닝 공정 전반에 걸쳐 국한되는 미세 유체 채널의 중앙 단면이 채널의 가장 얕은 부분이며 500 μm 높이이며 두 측면 단면은 모두 1mm 높다는 것을 보여줍니다. (C) 박테리아를 패턴화하는 데 사용되는 직선 채널 형상의 회로도. 미세 유체 장치는 길이 20mm, 폭 3mm, 500 μm 높이의 직선 채널로 구성됩니다. 단면에 표시된 이 미세 유체 장치의 직사각형 섹션은 채널의 충진 과정을 매체로 단순화합니다. SEM 이미지는 2 μm 길이, 1 μm 폭 및 500 nm 깊이 트랩이 미세 제작된 PDMS 템플릿의 작은 부분을 보여줍니다. 스케일 바 = 2 μm. 약어: PDMS = 폴리디메틸실록산; SEM = 전자 현미경 검사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 미세 유체 채널에서 순차적인 모세혈관 지원 어셈블리를 위한 플랫폼의 회로도. (A) 박스 인큐베이터. 박스 인큐베이터는 미세유체 채널 내부의 균일하고 일정한 온도(여기, 30°C)를 유지합니다. (B) 액체 현탁액이 로드된 주사기. 주사기는 주사기 펌프(도시되지 않음)에 의해 제어되며 패터닝 공정 중에 액체의 움직임을 제어하는 데 사용됩니다. (C) 가열 유리 접시. 가열 된 유리 플레이트는 미세 유체 채널 아래에 배치되며 공기 액체 인터페이스 부근의 응축을 피하는 것이 중요한 템플릿 을 가로 질러 균일 한 온도 (여기, 30 °C)를 보장합니다. (D) 액체 현탁액이 장착된 미세 유체 칩. 미세 유체 칩의 바닥에는 패턴 화 과정에서 박테리아와 콜로이드가 패턴화되는 트랩이 있습니다. (E) 현미경. 가열 된 유리 플레이트와 미세 유체 칩은 현미경 단계에 배치되어 패터닝 공정 및 다음 모든 단계에서 완전한 광학 액세스 권한을 부여합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 세균 및 콜로이드 패터닝과 관련된 단계의 회로도. 각 패널은 미세 유체 채널의 내부 보기를 나타내며 PDMS 템플릿의 작은 부분만 포함합니다. (A) 모세혈관 보조 조립을 통해 박테리아의 패터닝. (I) 세균현탁액은 미세유체 채널 내부에서 증발하여 대류 전류가 부유세균을 공기-액체 인터페이스로 이송하여 축적 영역을 형성한다. 한편, 서스펜션은 주사기 펌프에 의해 당겨지고 템플릿에서 후퇴합니다. 화살표는 세균 현탁액이 이동하는 방향을 나타냅니다. 후퇴 서스펜션은 템플릿을 가로 질러 스윕하고, 개별 세포는 미세 제작 트랩에 증착됩니다. (II) 증착된 박테리아는 채널이 신선한 매체로 플러시될 때까지 공기에 노출됩니다. 액체 현탁액이 템플릿의 끝에 도달하면 증착 프로세스가 끝났습니다. (III) 미세 유체 채널은 신선한 매체(즉, LB)로 플러시됩니다. 화살표는 새 매체가 플러시되는 방향을 나타냅니다. (B) 순차적인 모세혈관 지원 어셈블리를 통해 콜로이드 입자의 패터닝. (I) 콜로이드 서스펜션은 증발하는 동안 템플릿에 후퇴하고, 입자는 공기 액체 인터페이스에 축적되어 축적 영역을 형성한다. 개별 입자는 템플릿에서 미세 제작된 트랩에 증착됩니다. 화살표는 콜로이드 서스펜션이 이동하는 방향을 나타냅니다. (II) 액체 현탁액이 템플릿의 끝에 도달하면 증착 프로세스가 완료됩니다. (III) 두 번째 증착은 템플릿의 각 트랩에 두 번째 파티클을 배치하기 위해 첫 번째 증착과 동일한 방향으로 실행됩니다. (IV) 두 번째 증착이 끝나면 템플릿은 녹색 하나와 빨간색 파티클 1개의 희미한 모양으로 패턴화됩니다. 약어: PDMS = 폴리디메틸실록산; LB = 리소제니 국물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 대장균 (균주 MG1655 prpsM-GFP) 세포로 패턴화된 PDMS 템플릿. (A) 2 μm 길이, 1 μm 폭 및 500 nm 깊이의 트랩에 갇힌 개별 대장균 세포의 SEM 이미지. 세포는 하나의 증착 후에 갇혀 있었습니다. 스케일 바 = 2 μm. (B) 미세 유체 채널 후 E. coli 의 갇힌 세포와 함께 PDMS 템플릿의 작은 부분 (약 80 μm x 80 μm)의 Epi fluorescence 이미지는 1.3mm / min의 초기 속도로 배양 배지 (Lysogeny 국물)로 채워집니다. 갇힌 세포는 4시간 동안 여러 번 성장하고 분할하며, 결국 인접한 트랩의 세포와 병합되어 표면을 덮습니다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: PDMS = 폴리디메틸실록산; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 미세 유체 플랫폼(제1 채널 형상)에서 순차적인 모세혈관 지원 입자 어셈블리를 통해 조립된 콜로이드 클러스터. 직경 2 μm의 직경2 μm을 가진 폴리스티렌 입자로부터 조립된 (A) 15개의 디머의 에피플루오에시언 현미경 이미지. (B) 다이머(n =15)는 직경 1μm의 폴리스티렌 입자로부터 조립되어 2개의 순차적 기탁을 갖는다. (C) 트리머(n=15)는 직경 1μm의 폴리스티렌 입자로부터 조립된 3개의 순차적 기탁. (D) 트랩(n = 15)은 반대 방향으로 두 개의 순차 적 기탁을 실행하여 각 트랩의 사지에 패턴입자가 있습니다. 트랩의 입자 사이의 거리는 2 μm입니다. 스케일 바 = 4 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 미세유체 플랫폼은 콜로이드 및 박테리아와 같은 마이크로 크기의 물체를 PDMS 기판에 규정된 공간 배열로 패터닝할 수 있게 합니다. 미세 유체학이 제공하는 환경 조건과 sCAPA 기술로 부여된 미세 메트릭 정밀도로 세포를 패턴화하는 능력은 미래의 생리학 및 생태 연구를 위한 매우 유망한 플랫폼입니다.
이 작품에 제시된 실험에서 실리콘 마스터는 재료표에 보고된 포토레지스트를 사용하여 실현되었다. 그러나 PDMS 성형으로 설명되고 사용할 수 있는 크기 범위에서 피처를 생성하는 데 적합한 모든 포토레지스트를 사용할 수 있습니다. 마이크로채널 금형을 준비하는 데 사용되는 3D 프린팅 수지도 마찬가지입니다. 설명된 치수의 특징을 생성할 수 있고 PDMS 성형과 호환가능한 모든 수지도 사용될 수 있다.
이 프로토콜에서, 미세 유체 칩을 70°C에서 5일 동안 저장하면 Tween 20이 세균 또는 콜로이드 현탁액에 첨가될 때 표면 친수성(30~60°) 표면 친성(접촉 각도 30~60°) 최적화된다. 이 절차는 이러한 실험 조건하에서 후퇴 접촉 각도에 대한 최상의 재현성을 보장합니다. 그러나 다른 저장 시간과 온도도 작동 할 수 있습니다.
이 미세 유체 기술의 두 가지 응용 분야가 제시되었습니다 : 1) PDMS 기판에 트랩으로 세균 세포의 개별 기탁을 포함하는 세균 패턴, 및 2) 콜로이드의 순차적 기탁을 포함하는 콜로이드 패터닝, 다른 조성물의 콜로이드 배열을 얻는. 이 플랫폼은 PDMS 템플릿에 패턴처리된 수천 개의 세포와 함께 세균 증착의 높은 수율을 보장하기 위해 완전히 최적화되었습니다. 모세혈관 보조 조립과 미세 유체의 조합은 단세포 분해능과 몇 시간 동안 영양소의 안정적인 흐름을 보장하며, 공정 전반에 걸쳐 완전한 광학 적 접근을 보장합니다. 패턴 처리된 세포는 미세 유체 채널이 신선한 매체로 플러시되면 성장을 재개할 수 있지만 패턴 된 세포의 생존가능성은 여전히 최적화되어야합니다.
현재, 이 기술의 주요 한계는 7 h 창 내의 실험의 54.5%에서 패턴 세포의 성장의 부족입니다. 이 양상은 특정 세균성 종과 관련이 있을 수 있고 세포가 다시 성장하는 것을 방지하는 스트레스의 근본 원인을 결정하기 위하여 추가 조사될 필요가 있습니다. 패터닝 과정에서 반월 상 연골에 의해 가해지는 공기 노출 및 힘은 세균 스트레스에 주요 기여자 중 하나일 수 있다. 패터닝 과정에서 반월상연상 연골에 의해 세포에 가해지는 힘을 줄이기 위해 더 깊은 트랩을 사용하는 것을 포함하여 이러한 스트레스 원을 줄이기 위해 몇 가지 가능한 솔루션을 구현할 수 있다. 공기 노출과 관련된 응력감소를 줄이는 추가 옵션은 가열된 유리 판의 온도를 낮추는 것입니다. 30°C의 온도는 패터닝 과정에서 액체 현탁액의 충분한 증발 속도를 보장하고 매체가 플러시되기 전에 템플릿에 패턴화 된 후 열 박테리아가 노출되는 것을 감소시킬 것이다.
완전히 최적화되면 이 플랫폼이 정량적 단일 세포 분석을 포함하는 다양한 생물학적 연구에서 사용될 것으로 계획합니다. 이 기술의 높은 처리량 특성은 수천 개의 세포를 패터닝할 수 있게 해 주며 동일한 실험 분야 내에서 큰 통계를 제공합니다. 완전한 광학 접근은 시간이 지남에 따라 많은 수의 단일 미생물의 행동, 성장 및 분자 활동을 추적할 수 있으므로 균일한 환경 조건하에서 페노티픽 이질성 연구에서 주요 이점을 제공합니다. 이 플랫폼의 미세유체 특성은 미디어 구성, 유량 및 온도와 같은 환경 조건에 대한 완전한 제어가능성을 보장합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 SNSF PRIMA 보조금 179834 (E.S.), ETH 연구 보조금 ETH-15 17-1 (R. S.), 수생 미생물 심바이오시스 (보조금 GBMF9197) (R. S.)에 대한 고든과 베티 무어 재단 조사관 상을 인정합니다. 저자는 박테리아의 SEM 화상 진찰및 통찰력 있는 토론을 위한 박사 미겔 엔젤 페르난데스-로드리게스 (그라나다 대학, 스페인) 감사합니다. 저자들은 젠 응우옌 박사(캐나다 브리티시 컬럼비아 대학), 로라 알바레즈 박사(스위스 ETH 취리히), 카메론 보곤(ETH 취리히, 스위스), 파비오 그릴로 박사에게 감사의 인사를 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin - Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
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