Summary
Bakteri ve kolloidler gibi bir sıvıda asılı mikro boyutlu nesneleri polidimetilsiloksisan substratında öngörülen dizilere desenleştirmek için mikroakışkan bir platformda kapilarite destekli montaj kullanan bir teknoloji sunuyoruz.
Abstract
Mikroorganizmaların tanımlanmış mekansal düzenlemelere kontrollü bir şekilde desenlenerek, mikrobiyal fizyoloji ve etkileşim çalışmaları da dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik uygulamalar için benzersiz olanaklar sunar. En basit düzeyde, mikroorganizmaların doğru mekansal desenlemleri, çok sayıda bireysel hücrenin güvenilir, uzun süreli görüntülenmesini sağlayacak ve mesafeye bağlı mikrop-mikrop etkileşimlerini nicel olarak inceleme yeteneğini dönüştürecektir. Daha benzersiz bir şekilde, mikroakışkan teknolojinin sunduğu gibi, doğru mekansal desenleme ve çevresel koşullar üzerinde tam kontrol sağlamak, mikrobiyal ekolojide tek hücreli çalışmalar için güçlü ve çok yönlü bir platform sağlayacaktır.
Bu makale, mikroakışkan bir kanal içinde çok yönlü ve kullanıcı tanımlı mikroorganizma desenleri üretmek için mikroakışkan bir platform sunarak uzun süreli, yüksek verimli izleme için tam optik erişim sağlar. Bu yeni mikroakışkan teknoloji, kılcal damar destekli parçacık montajına dayanır ve mikroakışkan bir kanalın içindeki buharlaşan süspansiyonun kontrollü hareketinden kaynaklanan kılcal kuvvetlerden yararlanarak mikro boyutlu nesneleri polidimetilsiloksisan (PDMS) substratına mikrofabrik bir dizi tuzakta biriktirir. Sıralı çökeltiler, yalnızca tuzakların geometrisi ve dolum sırası tarafından dikte edilen tek veya birden fazla mikro boyutlu nesne türünün istenen uzamsal düzenini oluşturur.
Platform, farklı boyut ve malzemelerden kolloidal parçacıklar kullanılarak kalibre edilmiştir: çeşitli kolloidal desenler oluşturmak ve sıkışmış parçacıkların yüzey fonksiyonelleştirmesini gerçekleştirmek için güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, platform Escherichia coli hücreleri model bakteri olarak kullanılarak mikrobiyal hücreler üzerinde test edildi. Yüzeyde binlerce bireysel hücre desenlendi ve zaman içinde büyümeleri izlendi. Bu platformda, tek hücreli biriktirme ve mikroakışkan teknolojinin birleşmesi, hem mikroorganizmaların geometrik desenlenmesine hem de çevresel koşulların hassas kontrolüne izin verir. Böylece, ön deneylerde gösterildiği gibi, tek mikropların fizyolojisine ve mikrop-mikrop etkileşimlerinin ekolojisine bir pencere açar.
Introduction
Tek mikroorganizmaların, özellikle mikroakışkan cihazlar gibi çevresel koşullar üzerinde tam kontrol sağlayan deneysel arenalarda mekansal desenleme, çok çeşitli bağlamlarda son derece arzu edilir. Örneğin, mikroorganizmaların düzenli diziler halinde düzenlenmesi, çok sayıda bireysel hücrenin doğru görüntülenmesine ve çevresel uyaranlara yanıt olarak büyüme, fizyoloji, gen ekspresyonu ve ilaç duyarlılığının incelenmesine izin verecektir. Ayrıca, hücresel iletişim (örneğin, çekirdek algılama), çapraz besleme (örneğin, alg-bakteriyel simbiyoz) veya antagonizm (örneğin, allelopati) araştırmalarında özel olarak ilgi çekici hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesine ve hücrelerin birbirine göre mekansal lokalizasyonu üzerinde tam kontrole sahip olmasına izin verecektir. Hücre fizyolojisi ve evrim çalışmaları1, hücre-hücre etkileşim çalışmaları2, fenotipik farklılaşma taraması3, çevresel izleme4 ve ilaç taraması5 , bu tür nicel tek hücreli analizleri başarabilen bir teknolojiden büyük ölçüde yararlanabilecek alanlar arasındadır.
Holografik optik tuzaklar6 ve heterojen yüzey fonksiyonelleştirme yöntemleri7,8,9,10'dan tek hücreli kemostatlara11 ve damlacık mikroakışkanlarına12 kadar tek hücreleri izole etmek ve işlemek için son yıllarda çeşitli stratejiler önerilmiştir. Bu yöntemler teknik olarak çok zorludur veya hücre fizyolojisini etkiler ve tek hücreli çözünürlük, tam optik erişim ve çevresel koşullar üzerinde kontrol sağlayarak uzun süre çalışılabilen mikropları örüntülemek için yüksek verimli bir platform sağlayamaz. Bu makalenin amacı, bakterileri mikrometrik hassasiyetle, kapilarite destekli montaj yoluyla PDMS yüzeyinde öngörülen mekansal düzenlemelere desenlamak için bir platform tanımlamaktır. Bu platform, mikropların hassas ve esnek uzamsal desenlemesine izin verir ve mikroakışkan doğası sayesinde çevresel koşullar üzerinde tam optik erişim ve kontrol sağlar.
Bu platformun arkasındaki teknoloji, mikroakışkan bir platforma entegre edilen sCAPA13,14,15 (sıralı kapilarite destekli parçacık montajı) adlı son yıllarda geliştirilen bir montaj teknolojisidir16. Buharlaşan bir sıvı damlacığın menisküsleri, mikroakışkan bir kanalın içindeki desenli bir polidimetilsiloksan (PDMS) substratı üzerinde çekilirken, sıvıda asılı kalan bireysel kolloidal parçacıkları alt tabaka üzerinde mikrofebrik kuyulara hapseden kılcal kuvvetler uygular (Şekil 1A). Askıda parçacıklar önce konvektif akımlarla hava-sıvı arayüzüne taşınır ve daha sonra kapilarite ile tuzaklara yerleştirilir. Hareketli menisküs tarafından uygulanan kılcal kuvvetler, parçacık etkileşimlerine katılan kuvvetlere kıyasla daha büyük ölçekte hareket eder.
Böylece, montaj mekanizması parçacıkların malzeme, boyut ve yüzey özelliklerinden etkilenmez. Partikül konsantrasyonu, menisküs hızı, sıcaklık ve süspansiyonun yüzey gerilimi gibi parametreler, desenleme işleminin verimini etkileyen tek parametrelerdir. Okuyucu, yukarıda belirtilen parametrelerin desenleme işlemi üzerindeki etkisinin ayrıntılı bir açıklamasını 13,14,15'te bulabilir. Orijinal sCAPA teknolojisinde13,14,15, kolloidal desenleme işlemi açık bir sistemde gerçekleştirildi ve süspansiyonu şablon boyunca sürmek için yüksek hassasiyetli bir piezoelektrik aşama gerektirdi. Bu platform farklı bir stratejiden yararlanır ve desenlemenin genellikle mikroakışkanlarda kullanılan standart ekipmanlarla kontrollü bir ortamda gerçekleştirildiğini ve böylece numunelerin kirlenme risklerini en aza indirmesini sağlar.
Bu mikroakışkan platform, düzenli inert parçacık dizileri oluşturmak için önce kolloidal parçacıklar üzerinde optimize edildi ve daha sonra bakterilere başarıyla uygulandı. Her iki mikroakışkan platform da bu makalede açıklanmıştır (Şekil 1B,C). Hazırlık adımlarının ve protokolde açıklanan deneysel ekipmanların çoğu iki uygulama için ortaktır (Şekil 2). Tekniğin karmaşık, çokmal desenler oluşturmak için aynı yüzeyde birden fazla sıralı çökelti gerçekleştirmek için kullanılabileceğini göstermek için kolloidal desenleme rapor ediyoruz. Özellikle, belirli bir geometriye ve bileşime sahip kolloidal diziler oluşturmak için her adım için tuzak başına tek bir parçacık biriktirildi, sadece tuzakların geometrisi ve dolum sırası tarafından dikte edildi. Bakteriyel desenleme gelince, tek ifadeler tanımlanır ve bu da tuzak başına bir bakterinin birikmesine neden edilir. Hücreler yüzeyde desenlendikten sonra, mikroakışkan kanal, herhangi bir tek hücreli çalışmanın ön adımı olan bakteri üremesini teşvik etmek için orta ile yıkanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Silikon master hazırlığı
NOT: Kolloidal ve mikrobiyal desenleme şablonlarını oluşturan mikrofabrik tuzakları taşıyan PDMS şablonları Geissler ve ark. 17. Silikon ustası, temiz bir odada geleneksel litografi ile hazırlandı. Prosedür için aşağıdaki adımlara ve ekipman için Malzeme Tablosuna bakın.
- Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanarak özellikleri tasarlayın.
- Tasarlanan özellikleri UV doğrudan lazer yazıcı ile ortaya sürerek krom cam maskesini pozitif fotoresist tabakasıyla hazırlayın.
- Krom cam maskesini, 15 sn için 1:4 fotoresistten su oranına bir geliştirici kullanarak bir spin geliştiricisi ile geliştirin.
- Maskeyi 50 s boyunca krom vbhant içine daldırın.
- Plazma-tedavi 10 cm silikon gofret için 3 dakika 600 W.
- Buhar bir hexamethyldisilizane tabakası biriktirin ve fotoresiste doğru yapışma geliştirmek için 110 °C'de pişirin.
- 2 dakika boyunca 4.500 × g'da bir fotoresist tabakası yatırın.
- Özelliği, 2 s için maske hizalayıcılı krom cam maske aracılığıyla UV'ye maruz bırakın ve maskeye gelince bir geliştiriciyle geliştirin.
- Silikon ustasının imalatını tamamlamak için, gofret derin reaktif iyon değişimi ile kazıyın, istediğiniz derinliğe ulaşmak için gravür süresini (<2 dk) ayarlayın (profilometre ile ölçülür).
2. Mikrokanel kalıp hazırlama
- Kanalı CAD yazılımıyla tasarlayın ve dilimleyici bir yazılımla dilimleyerek tasarlanan modeli 3D yazıcı için talimatlara dönüştürün ve dilimleme mesafesini 0,05 mm olarak ayarlayın.
- Kanalı ~1 saat boyunca 3D yazıcıyla yazdırın.
- Kalıbı özel bir kürleme ve çamaşır makinesinde yıkayın ve postcure edin.
- Kalıbı saf izopropil alkol (IPA) ile dolu bir kaba koyun ve sıvıyı girdaplayın (20 dakika yıkayın). IPA dolu kabı makineden çıkar.
- Yıkanmış kalıp IPA kabından çıkarıldıktan sonra, yıkama ve kürleme makinesine geri koyun ve 35 ° C'de 15 dakika boyunca postcure edin.
NOT: Malzeme Masası , 3D yazıcıyı ve kalıp hazırlama protokolünde kullanılan kür ve çamaşır makinesini raporlar. 3D model, 3D yazıcının tescilli dilimleyici yazılımı ile dilimlendi.
- Baskıyı 12 saat boyunca bir UV fırınına yerleştirin ve 12 saat boyunca 80 °C'de bir fırına yerleştirin.
NOT: Bu adım, PDMS'nin kürlemesini önleyeceği için tüm polimerin kürlanmasını ve tüm kesilmemiş polimerlerin baskıdan çıkarılmasını sağlar. - Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane buhar birikimi yoluyla kalıbı silezleştirin.
- 3D kalıbı, kalıba yakın yerleştirilmiş alüminyum bir folyo üzerine pipetlenmiş 20 μL konsantre Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane ile birlikte bir vakum kurutucuya yerleştirin.
- Buhar üretmek ve 40 dakika bekletmek için kurutucuda bir vakum oluşturun.
- Kalıbı kurutucudan çıkarın ve üzerine PDMS dökmeden önce saf etanol ile durulayın.
3. Mikroakışkan çipin imalatı
- Elastomer'ı çapraz bağlama maddesiyle (Malzeme Tablosu) karıştırarak pdms karışımı hazırlayın. Hava kabarcıkları oluşana ve PDMS karışımı opak görünene kadar iki bileşeni eşit şekilde karıştırmak için karışımı kuvvetlice karıştırın.
NOT: Çapraz bağlayıcı miktarı, elastomer miktarının ağırlığına göre% 10 olmalıdır. - Sıkışan hava kabarcıklarını çıkarmak için elastomer ve çapraz bağlama maddesinin karışımını bir vakum kurutucuda gazdan arındırın. Kurutucudaki karışımı karıştırma için kullanılan kaba aktarın (adım 3.1). Tüm kabarcıklar çıkarılana ve karışım tekrar şeffaf görünene kadar gaz giderme işlemine devam edin.
NOT: Genellikle desiccation için gereken süre 30 dakikadır. - Mikroakışkan çipin "zemini" olarak hizmet edecek şablonu üretmek için silikon ustasına 3 g karışım dökün.
NOT: PDMS katmanının kalınlığı, silikon ana üzerine dökülen karışım miktarı değiştirilerek ayarlanabilir.- 400 μm kalınlığında bir şablon elde etmek için, silikon ana üzerine 3 g PDMS dökün, silikon ustayı bir spin kaplayıcıya yerleştirin ve 5 s için 21 × g ve 10 s için 54 × g'da spin coat ve ardından sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarmak için 3.2 adımda açıklandığı gibi tekrar gaz çözün.
- Mikroakışkan çipin "çatısı" olarak hizmet edecek mikrokanalı yapmak için 3D baskılı kalıba PDMS karışımından 20 g dökün ve 30 dakika boyunca 3.2 adımda açıklandığı gibi gazdan arındırın.
- Hem silikon gofret hem de 3D baskılı kalıbı 70 °C'de en az 2 saat pişirin.
- PDMS katmanını 3D baskılı kalıptan soyun, PDMS'yi mikrokanellerin etrafında bir bıçakla kesin ve mikroakışkan kanalın giriş ve çıkışı olarak hizmet edecek delikleri delin.
- PDMS'yi silikon ustasından soyun ve PDMS katmanını şablonların üzerine yapıştırılacak mikroakışkan kanalların aynı boyutlarıyla daha küçük parçalara bölün.
- Şablonları ve mikrokanelleri% 1 deterjan çözeltisi kullanarak hafifçe ovalayın ( Malzeme Masasına bakın) 5 dakika boyunca ve ardından deiyonize suyla durulayın. Daha sonra, şablonları ve mikrokanelleri izopropanol ile durulayın ve deiyonize su ile durulayın. Şablonları ve mikrokanelleri oda sıcaklığında 1 barda basınçlı hava ile 1 dakika kurutun.
- Şablonları ve mikrokanelleri, bağlanacak yüzeyler yukarı bakacak şekilde bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Plazma temizleyiciyi açın ve plazma şablonları ve mikrokanelleri 40 s boyunca tedavi edin. Plazma temizleyiciden çıkar ve mikrokanelleri hemen şablonların üzerine birbirleriyle temas ettirerek yapıştırın.
- PDMS hidrofobik geri kazanımı sağlamak ve 30 ila 60°10,11 arasında optimum aralıkta geri çekilen temas açısına sahip olmak için mikroakışkan talaşları beş gün boyunca 70 °C'de bir fırında saklayın.
4. Bakteriyel desenleme
- Deneyden bir gün önce, Escherichia coli popülasyonunu büyütün (MG1655 prpsM-GFP suşu). Kültürü doğrudan donmuş stoktan aşılayın ve 37 °C'de bir çalkalayıcı inkübatörde lysogeny et suyu (LB) ortamında 20 saat boyunca bir gecede büyüyün. PrpsM-GFP plazmidini korumak için hücreler için 50 μg/mL kanamycin ekleyin.
- Deney günü, kutu inkübatörü (Şekil 2A) deneye başlamadan önce düzgün ve istikrarlı bir sıcaklığa sahip olacak şekilde deneyden birkaç saat önce 37 °C olarak ayarlayın. Şırınga pompasını ve ısıtılmış cam plakayı mikroskop aşamasına (Şekil 2B,C) kurun ve sıcaklığı kutu inkübatörü ile aynı sıcaklığa ayarlayın.
NOT: Mikroskop (Şekil 2E) dahil olmak üzere tüm sistemin içine yer aldığı kutu inkübatörü, kanal ortamla yıkandığında tüm deney boyunca düzgün ve sabit bir sıcaklığın korunmasını sağlar. - Deneyden doksan dakika önce, mikroakışkan çipi% 100 etanol (EtOH) ile dolu bir kap içine koyun ve kanalı en az 10 dakika boyunca% 100 EtOH ile yıkayın. Mikroakışkan çipi bir vakum kurutucusunda ve degazda en az 30 dakika yerleştirin. EtOH'u damıtılmış suyla değiştirin ve çipi en az 30 dakika vakumla tedavi edin. Kanalda kalan sıvı izlerini gidermek için mikroakışkan çipi 10 dakika boyunca 70 °C'de fırına koyun.
NOT: Bu adım, kültür ortamı ile yıkandığında kanalda kabarcık oluşumunu önlemek için gereklidir. Bu kabarcık önleme protokolü Wang ve ark.18'den uyarlanmıştır. - Pipet 1 mL 3-(N-morpholino)propansülfonic asit (MOPS) orta (1x) santrifüj şişe içine ve 10 μL 0.132 M potasyum fosfat (K2HPO4) ekleyin. Gece kültürünü 37 °C inkübatörden çıkarın ve aliquot 100 μL'yi santrifüj şişesine alın ve kültürü 2 dakika boyunca 2.300 × g'da santrifüj edin. Süpernatantı santrifüj şişelerinden hafifçe borulayın ve peleti 1 mL taze MOPS ortamında 0.015% v / v Tween 20 ve% 0.01 potasyum fosfat v / v ile yeniden atın.
NOT: Bakteriyel süspansiyonun tipik konsantrasyonu% 0.015-0.15 vol aralığındadır, bu da genişletilmiş ve mobil bir biriktirme bölgesinin oluşumunu sağlar ve parçacıkların substratta birikmesini önler. Gece ortamının taze ortamla değiştirilmesi, şablonda bakteri filmlerinin serbest bırakılması risklerini en aza indirir. Taze ortamdaki karbon kaynağı eksikliği, şablon desenleme sırasında süspansiyonda hücrelerin büyümesini önler. PDMS şablonundaki geri çekilen sıvının temas açısının 30 ila 60° arasında en uygun aralığa düşmesi için süspansiyondaki Tween 20'nin %0,015 v/v konsantrasyonu gereklidir. - Bakteri süspansiyonunu 1 mL şırıngaya yükleyin ve şırıngayı mikroakışkan boru ile çipe bağlayın.
- Şırınga ile boru arasındaki bağlantıyı sabitlemek için, doğrudan dış çapı 0,6 mm olan bir iğneyi boruya yerleştirin. Giriş çevresinde kalan süspansiyonun kanal boyunca dağılmasını önlemek için, taze ortamı giriş olarak kullanılan delik yerine, desenleme işlemi sırasında çıkış olarak kullanılan delikten (Şekil 3A-III) boşaltın.
- Şırıngayı şırınga pompasına monte edin ve süspansiyon şablon bölgesini tuzaklarla kaplayana kadar kanalın yukarı akış kısmında bulunan girişten süspansiyonu mikroakışkan çipe enjekte edin.
NOT: Sıvı enjeksiyon işlemi sırasında, hava kanalın aşağı akış ucunda bulunan bir çıkıştan kaçabilir. - Şırıng pompasını bakteri süspansiyonu (Şekil 3A-I) 0,07-0,2 μL/dk akış hızında çekecek şekilde ayarlayın, bu da tarif edilen geometride 80-100 μm/ dk menisküs geri çekilme hızına karşılık gelir.
- Mikroskop yazılımı ile desenleme işlemini izleyin.
NOT: Burada, şablondaki geri çekilen menisküsleri izlemek için 10x büyütme ve mikrofabrik tuzaklara bireysel bakterilerin birikmesini izlemek için 20x büyütme kullanıldı.
- Şablon hücrelerle desenlendikten sonra (Şekil 3A-II), mikroakışkan kanalı hızlı bir şekilde boşaltmak ve daha önce en az 30 dakika gazdan arındırılan ve 30 ° C'de önceden ısıtılmış taze LB ile yıkamak için geri çekilme akış hızını artırın.
- Kanalı hafifçe yıkamak için şırınna pompasını 2 μL/dk akış hızına ayarlayın. Kanal doldurulduktan sonra, belirli deneysel ihtiyaçlara göre akış hızını (15 μL/ dk) artırın.
- İstenilen büyütme ve zaman aralığında büyüyen bakterilerin görüntülerini elde edin.
5. Kolloidal desenleme
- Pipet 900 μL% 0.015 v/v Ara 20 sulu çözeltiyi bir santrifüj şişesine ve pipet 100 μL orijinal kolloidal süspansiyon içine. Süspansiyonu 1 dakika boyunca 13.500 × g'da santrifüj edin. Üstnatant yavaşça çıkarın ve sulu Ara 20 (%0,015 v/v) çözeltisi ile değiştirin. Tedarikçinin çözücüsünden stok süspansiyonundan tamamen değiştirilmesini sağlamak için bu işlemi üç kez tekrarlayın.
- Kolloidal süspansiyonu 1 mL şırıngaya yükleyin ve şırıngayı mikroakışkan boru ile çipe bağlayın. Süspansiyonu, kanalın yukarı akış kısmında, orta bölümde bulunan girişten mikroakışkan çipe enjekte edin ve şablon kaplanana kadar süspansiyonu kademeli olarak itin.
- Kolloidal süspansiyonu 0,07-0,2 μL/dk akış hızında çekin, bu da 1-2 μm/dk menisküs çekme hızına karşılık gelir ve mikroskop yazılımı aracılığıyla desenleme işlemini görüntüleyin. Şablondaki geri çekilen menisküsleri izlemek için 10x büyütme ve mikrofabrik tuzaklara tek tek parçacıkların birikmesini gözlemlemek için 20x büyütme kullanın. Menisküs, kanalı hızlı bir şekilde boşaltmak için şablonun sonuna ulaştığında akış hızını artırın.
NOT: Çeşitli parçacıklardan oluşan kolloidal diziler, seri olarak 5.1 ile 5.3 arası desenleme işlemi çalıştırılarak üretilebilir. Kanal, istenen kolloidal dizilerin bileşimine göre her yinelemede yeni bir kolloidal süspansiyon ile yüklenir. Her desen adımı kolloidal diziye bir parçacık ekler ve tuzaklar istenen parçacıkların dizisiyle doldurulana kadar sırayla çalıştırılabilir. Elde edilen kolloidal dizilerin bileşimi sadece tuzakları doldurmak için kullanılan kolloidal süspansiyonların dizisi tarafından verilir (Şekil 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kolloidal parçacıkları ve bakterileri pdms şablonunda mikrofabrik olarak tasarlanmış tuzaklara sokmak için kapillarite destekli montajdan yararlanan mikroakışkan bir platform geliştirilmiştir. Kolloidlerin ve bakterilerin kapillarite destekli montaj yoluyla desenlerini optimize etmek için iki farklı kanal geometrisi tasarlanmıştır. İlk kanal geometrisi (Şekil 1B), aralarında fiziksel bariyer olmayan üç 23 mm uzunluğunda paralel bölümden oluşur. Yanlardaki iki bölüm 5 mm genişliğinde ve 1 mm yüksekliğinde, orta bölüm ise 7 mm genişliğinde ve 500 μm yüksekliğindedir. Bu tasarım, geri çekilen dışbükey şekilli menisküs ile iyi tanımlanmış hareketli bir damlacık korumaya yardımcı olur. Bu platformun çalışma prensibi Pioli ve ark.11 tarafından ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Deney, bakteri kültleme durumunda olduğu gibi yanal kanalların doldurulması gerektiriyorsa, genellikle hava cepleri oluşur. Bu nedenle, kanal orta ile yıkandığında dolum işlemini basitleştiren ikinci bir geometri tasarladık ve test ettik. Bu durumda, platform (Şekil 1C) tek bir 20 mm uzunluğunda, 3 mm genişliğinde ve 500 μm yüksekliğinde düz bir kanaldan oluşur.
Mikroakışkan kanaldaki sıcaklık, verimli bir biriktirme işlemi sağlamak için önemli bir parametredir. Şablonda yoğuşma olmaması için çiy su noktasının 15 °C üzerinde tutulmalıdır. Kanalın altındaki ısıtmalı cam plaka (Şekil 2D), sıvı hava arayüzüne yakın bölgede, havadaki yüksek buhar konsantrasyonu ile karakterize edilen desenleme işlemi sırasında yoğuşmayı önlemek için şablon genelinde eşit bir sıcaklık sağlar. Şablonda yoğuşma olmaması için ısıtılmış cam plakanın sıcaklığı kutu inkübatörü ile aynı olmalıdır.
Düz kanal geometrisi, floresan E. coli suşu (MG1655 prpsM-GFP) sabit fazlı hücreleri (Şekil 4A) desenleştirmek için yararlanılmıştır. Analiz edilen 5.000 tuzağın %83'unda bakteri bir şekilde bire birildi. Hücreler ilk olarak sunulan protokole göre tuzaklara yerleştirildi ve daha sonra 10 mm / dk'da yıkanmış LB'de 37 ° C'de 4 saat boyunca yetiştirildi. Desenli bakteriler, kanalın taze LB (Şekil 4B-I) ile doldurulduğu andan itibaren 1,5 saat içinde farklı zamanlarda büyümeye devam etti ve ortancası 44 dk'daydı. Büyümeye devam edildikten sonra, tek bakteri hücreleri tek tek koloniler oluşturmaya başlar, bu da bir yüzey tabakası oluşana (3,5 saat) ve tek hücre çözünürlüğü kaybedilene kadar genişler (Şekil 4B-II).
Bu kavram kanıtı deneyi, mikroakışkan bir kanaldaki kapilarite destekli montajın binlerce canlı tek bakteri hücresine sahip bir yüzeyi desenleştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. 11 kopya, desenli hücrelerin 7 saat içinde vakaların% 45,5'inde büyüdüğünü göstermektedir. İfadenin büyümeyen, desenli bakterilerin lekelenmediğini kanıtladıktan sonra kanala temizlenen taze LB'ye canlı ölü bir leke19 olan propidium iyodür (PI) eklenerek dört test yapıldı. PI DNA'ya bağlandığı halde sağlam bir zarla hücrelere nüfuz edemediği için PI boyama deneyi, ne desenleme işleminin ne de karartma ve yeniden sulanma işlemlerinin hücrelerin zarlarına zarar verdiğini göstermektedir.
Üç kesitli kanal geometrisi, kolloidal parçacıkların sıralı desenlemesini gerçekleştirerek farklı bileşimlere sahip doğrusal kolloidal diziler üretmek için kullanılmıştır. Şekil 5, sırasıyla iki ve üç sıralı sıkışmış parçacıklar içeren dimerler (Şekil 5A,B) ve trimerler (Şekil 5C) dahil olmak üzere sıralı desenleme yoluyla oluşturulan farklı kolloidal dizileri göstermektedir. Yeşil ve kırmızı floresan polistiren parçacıkları hem dimerleri hem de trimerleri birleştirmek için kullanıldı. 55.000'den fazla tuzak üzerinde yapılan analizler, analiz edilen tuzakların sırasıyla% 93 ve% 89'unda 2 μm ve 1 μm çapında parçacıklar tarafından yapılan yeşil-kırmızı (G-R) dimerlerin (Şekil 5A,B) oluştuğunu göstermektedir. Analiz edilen 55.000 tuzağın %52'sinde yeşil-kırmızı-yeşil (G-R-G) trimerler (Şekil 5C) oluşturulmuştur11. Dimerler ve trimerler sıralı ifadeler çalıştırılarak monte edildi ve kolloidal süspansiyonlar tüm sıralı ifadeler boyunca aynı yönde hareket etti (Şekil 3B). Sonuç olarak, her biriktirme adımında sıkışan parçacıklar, bir öncekinde sıkışanlarla doğrudan temas halindedir.
Parçacıkların hassas konumlandırılması, biriken parçacıklar arasında doğrudan temas gerektirmez. Desenli parçacıklar arasındaki mesafe, zıt yönlerde iki tortu gerçekleştirilerek hassas bir şekilde kontrol edilebilir, böylece bu tür parçacıkları her tuzağın karşı uçlarına hapsedebilir (Şekil 5D). Sıkışan parçacıklar arasındaki mesafe, istenen uzunluğa sahip tuzaklar tasarlanarak ayarlanabilir. Platform tarafından sunulan ek bir olasılık, yüzeyin mikrometrik hassasiyetle kimyasal desenlendir. Bu sonuç, şablonun kimyasal olarak işlevselleştirilmiş parçacıklarla desenlenerek elde edilebilir11.
Şekil 1: Mikroakışkan kanalların geometrileri ve desenleme işlemi. (A) Kolloidal parçacıkların deseni sırasında mikroakışkan kanalın yan görünüm bölümünün şeması. Sıvı süspansiyon mikroakışkan kanalın içinde buharlaşır ve konvektif akımlar askıya alınmış parçacıkları hava-sıvı arayüzüne doğru taşır. Parçacıklar böylece birikir ve biriktirme bölgesini oluşturur. Şırınd pompası sıvı süspansiyonu çekerek geri çekilmesini ve şablondaki sıvı durgunluğu sırasında tek tek parçacıkların sıkışmasını neden olur. Ok, süspansiyonun hareket ettiği yönü temsil eder. (B) PDMS şablonunda kolloidal parçacıkları desenlamak için kullanılan kanal geometrisinin şeması. Kanal 23 mm uzunluğunda ve 17 mm genişliğindedir ve üç bölümden oluşur: 7 mm genişliğinde merkezi bir bölüm ve 5 mm genişliğinde iki yanal bölüm. Şablon kanalın zemininde, orta bölümdedir. Kesit, sıvı süspansiyonun desenleme işlemi boyunca hapsedildiği mikroakışkan kanalın orta bölümünün kanalın en sığ kısmı olduğunu ve 500 μm yüksekliğinde olduğunu, iki yan bölümün de 1 mm yüksekliğinde olduğunu göstermektedir. (C) Bakterileri desenlamak için kullanılan düz kanal geometrisinin şeması. Mikroakışkan cihaz 20 mm uzunluğunda, 3 mm genişliğinde ve 500 μm yüksekliğinde düz kanaldan oluşur. Kesitte gösterilen bu mikroakışkan cihazın dikdörtgen bölümü, kanalın dolgu işlemini orta ile basitleştirir. SEM görüntüsü, PDMS şablonunun küçük bir kısmını 2 μm uzunluğunda, 1 μm genişliğinde ve üzerinde mikrofabrik 500 nm derinliğinde tuzaklar ile gösterir. Ölçek çubuğu = 2 μm. Kısaltmalar: PDMS = polidimetilsiloksan; SEM = taramalı elektron mikroskopisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikroakışkan bir kanalda sıralı kapillarite destekli montaj için platformun şeması. (A) Kutu inkübatörü. Kutu inkübatörü, mikroakışkan kanalın içinde düzgün ve sabit bir sıcaklık (burada, 30 °C) tutar. (B) Sıvı süspansiyon yüklü şırınna. Şırınd bir şırınma pompası tarafından kontrol edilir (gösterilmez) ve desenleme işlemi sırasında sıvının hareketini kontrol etmek için kullanılır. (C) Isıtmalı cam plaka. Isıtmalı cam plaka mikroakışkan kanalın altına yerleştirilir ve hava sıvısı arayüzünün yakınında yoğuşmayı önlemek için kritik olan şablon boyunca eşit bir sıcaklık (burada, 30 °C) sağlar. (D) Sıvı süspansiyon yüklü mikroakışkan çip. Mikroakışkan çipin zemini, bakteri ve kolloidlerin desenleme işlemi sırasında desenlendirilme tuzaklarını taşır. (E) Mikroskop. Isıtılmış cam plaka ve mikroakışkan çip, desenleme işlemi sırasında ve aşağıdaki tüm adımlar sırasında tam optik erişim sağlayan bir mikroskop aşamasına yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bakteriyel ve kolloidal desenleme ile ilgili adımların şeması. Her panel mikroakışkan kanalın iç görünümünü gösterir ve PDMS şablonunun yalnızca küçük bir bölümünü içerir. (A) Bakterilerin kapilarite destekli montaj yoluyla desenlenerek. (I) Bakteriyel süspansiyon mikroakışkan kanalın içinde buharlaşır ve konvektif akımların askıya alınan bakterileri hava-sıvı arayüzüne taşımasına neden olur ve böylece biriktirme bölgesini oluşturur. Bu arada, süspansiyon şırıngam pompası tarafından çekilir ve şablon üzerinde çekilir. Ok, bakteri süspansiyonun hareket ettiği yönü temsil eder. Geri çekilen süspansiyon şablon boyunca süpürülür ve tek tek hücreler mikrofabrik tuzaklara birikir. (II) Biriken bakteriler, kanal taze ortamla yıkanana kadar havaya maruz kalır. Sıvı süspansiyon şablonun sonuna ulaştığında biriktirme işlemi sona erzilir. (III) Mikroakışkan kanal taze ortamla (yani LB) yıkanır. Ok, taze ortamın yıkandığı yönü temsil eder. (B) Kolloidal parçacıkların sıralı kapillarite destekli montaj yoluyla desenlenerek. (I) Kolloidal süspansiyon buharlaşırken şablona çekilir ve parçacıklar hava-sıvı arayüzünde birikir ve biriktirme bölgesini oluşturur. Bireysel parçacıklar şablonda mikrofabrik olarak tuzaklara biriktirilir. Ok, kolloidal süspansiyonun hareket ettiği yönü temsil eder. (II) Sıvı süspansiyon şablonun sonuna ulaştığında biriktirme işlemi tamamlanır. (III) Şablondaki her bindirmeye ikinci bir parçacık yerleştirmek için ilk biriktirmeyle aynı yönde ikinci bir biriktirme çalıştırılır. (IV) İkinci biriktirme sona erdiğinde, şablon bir yeşil ve bir kırmızı parçacık dimer ile desenlenmiştir. Kısaltmalar: PDMS = polidimetilsiloksan; LB = Lysogeny suyu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: E. coli (strain MG1655 prpsM-GFP) hücreleri ile desenli PDMS şablonu. (A) 2 μm uzunluğunda, 1 μm genişliğinde ve 500 nm derinliğinde tuzaklara sıkışmış bireysel E. coli hücrelerinin SEM görüntüsü. Hücreler tek bir ifadeden sonra tuzağa düşürüldü. Ölçek çubuğu = 2 μm. (B) Mikroakışkan kanal 1,3 mm/dk başlangıç hızında kültür ortamı (Lysogeny suyu) ile doldurulduktan sonra E. coli'nin sıkışmış hücreleri ile PDMS şablonunun küçük bir bölümünün (yaklaşık 80 μm x 80 μm) epifluoresans görüntüleri, daha sonra 10 mm/dk'ya yükseltilir. Kapana kısılmış hücreler 4 saat boyunca birden fazla kez büyür ve bölünür, sonunda komşu tuzaklardan gelen hücrelerle birleşir ve yüzeyi kaplar. Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: PDMS = polidimetilsiloksan; GFP = yeşil floresan protein. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kolloidal kümeler mikroakışkan platformda sıralı kapillarite destekli parçacık montajı ile birleştirilmiştir (ilk kanal geometrisi). (A) 15 dimerin epifluoresans mikroskopi görüntüsü, iki sıralı çökelti ile 2 μm çapında polistiren parçacıklardan monte edilmiştir. (B) Dimerler (n = 15), iki sıralı çökelti ile 1 μm çapında polistiren parçacıklardan monte edilmiştir. (C) Trimerler (n = 15), üç sıralı tortu ile 1 μm çapında polistiren parçacıklardan monte edilmiştir. (D) Her tuzağın ekstremitelerinde desenli parçacıklarla (n = 15) zıt yönlerde iki sıralı tortu çalıştırarak tuzaklar. Bir tuzaktaki parçacıklar arasındaki mesafe 2 μm'dir. Ölçek çubukları = 4 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan mikroakışkan platform, kolloidler ve bakteriler gibi mikro boyutlu nesnelerin PDMS alt tabakasında öngörülen uzamsal düzenlemelere desenlenerek örüntülmesini sağlar. Mikroakışkanların sunduğu çevresel koşullar üzerindeki tam kontrol ve sCAPA teknolojisinin verdiği mikrometrik hassasiyetle hücreleri desenleme yeteneği, onu gelecekteki fizyoloji ve ekoloji çalışmaları için çok umut verici bir platform haline getirmektedir.
Bu çalışmada sunulan deneylerde silikon ustası, Malzeme Tablosu'nda bildirilen fotoresist kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, açıklanan boyut aralığında özellikler üretmek için uygun olan ve PDMS kalıplama ile kullanılabilen herhangi bir fotoresist kullanılabilir. Aynı şey mikrokanel kalıbını hazırlamak için kullanılan 3D baskı reçinesi için de geçerlidir. Açıklanan boyutun özelliklerini üretebilen ve PDMS kalıplama ile uyumlu herhangi bir reçine kullanılabilir.
Bu protokolde, mikroakışkan talaşların 5 gün boyunca 70 °C'de saklanması, bakteriyel veya kolloidal süspansiyona Tween 20 eklendiğinde yüzey hidrofilizliğini (30 ila 60 ° arasında düşen temas açısı) optimize eder. Bu prosedür, bu deneysel koşullar altında geri çekilen temas açısı için en iyi tekrarlanabilirliği sağlar; ancak, diğer depolama süreleri ve sıcaklıklar da çalışabilir.
Bu mikroakışkan tekniğin iki uygulaması sunulmuştur: 1) PDMS substratındaki tuzaklara bakteri hücrelerinin bireysel çökeltilerini içeren bakteriyel desenleme ve 2) kolloidlerin sıralı çökeltilerini içeren kolloidal desenleme, farklı bileşimlerin kolloidal dizilerini elde etmek. Bu platform, PDMS şablonunda desenli binlerce hücre ile yüksek bakteri birikimi verimi sağlamak için tamamen optimize edilmiştir. Kapilarite destekli montaj ve mikroakışkanların kombinasyonu, işlem boyunca tam optik erişim ile tek hücreli çözünürlük ve birkaç saat boyunca sabit besin akışı sağlar. Desenli hücreler, mikroakışkan kanal taze ortamla yıkandıktan sonra büyümeye devam edebilir, ancak desenli hücrelerin yaşayabilirliğinin hala optimize edilmesi gerekir.
Şu anda, bu tekniğin en büyük sınırlaması, 7 saat içinde yapılan deneylerin% 54,5'inde desenli hücrelerin büyümemesidir. Bu yön spesifik bakteri türleriyle ilgili olabilir ve hücrelerin yeniden büyümesini önleyen stresin temel nedenini belirlemek için daha fazla araştırılması gerekir. Hava maruziyeti ve menisküslerin desenleme işlemi sırasında uyguladığı kuvvet bakteriyel strese en büyük katkıda bulunanlar arasında olabilir. Bu tür stres kaynaklarını azaltmak için, desenleme işlemi sırasında menisküs tarafından hücrelere uygulanan kuvveti azaltmak için daha derin tuzakların kullanılması da dahil olmak üzere çeşitli olası çözümler uygulanabilir. Hava maruziyeti ile ilgili stresi azaltmak için ek bir seçenek, ısıtılmış cam plakanın sıcaklığını azaltmak olacaktır. 30 °C'lik bir sıcaklık, desenleme işlemi sırasında sıvı süspansiyonun yeterli buharlaşma oranını sağlar ve orta yıkamadan önce şablonda desenlendikten sonra maruz kaldıkları ısı bakterilerini azaltır.
Tamamen optimize edildikten sonra, bu platformun nicel tek hücreli analiz içeren çeşitli biyolojik çalışmalarda kullanılacağını öngörüyoruz. Tekniğin yüksek verimli doğası, aynı deneysel arenada büyük istatistikler sağlayarak binlerce hücrenin desenlenerek örüntüye izin verir. Tam optik erişim, zaman içinde çok sayıda tek mikroorganizmanın davranışını, büyümesini ve moleküler aktivitelerini izlemeyi sağlar, böylece homojen çevresel koşullar altında fenotipik heterojenliğin incelenmesinde büyük avantajlar sağlar. Bu platformun mikroakışkan doğası, medya bileşimi, akış hızı ve sıcaklık gibi çevresel koşullar üzerinde tam kontrol edilebilirlik sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, SNSF PRIMA hibe 179834 (E.S.'ye), bir ETH Araştırma Hibesi ETH-15 17-1'den (R. S.) ve Gordon ve Betty Moore Vakfı SuCul Mikrobiyal Simbiyoz Araştırmacı Ödülü'nden (GBMF9197 hibe) (R. S.) destek kabul ediyorlar. Yazarlar, bakterilerin SEM görüntülemesi ve içgörülü tartışmalar için Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez'e (İspanya Granada Üniversitesi) teşekkür ediyor. Yazarlar, içgörülü tartışmalar için Dr. Jen Nguyen (Kanada British Columbia Üniversitesi), Dr. Laura Alvarez (ETH Zürih, İsviçre), Cameron Boggon (ETH Zürih, İsviçre) ve Dr. Fabio Grillo'ya teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin - Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
