Summary
이 프로토콜은 인간 혈액-뇌 장벽(BBB) 시험관내 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 내피 세포와 혈관주위세포는 삽입 필터의 양쪽(혈액 구획)에 파종되고 성상세포는 하단 웰(뇌 구획)에 파종됩니다. 상기 모델 특성화는 나노입자 수송 실험에 사용되었다.
Abstract
뇌로의 약물 전달은 뇌 실질에 대한 접근을 제어하고 제한하는 혈액-뇌 장벽(BBB)의 매우 특이적이고 제한적인 특성으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 그러나 나노 기술의 발달로 약물 전달을 개선하기 위해 새로운 나노 물질의 대형 패널이 개발되어 전임상 분석 프레임에서 뇌 침투를 예측하기 위해 신뢰할 수있는 시험관 내 마이크로 시스템의 필요성이 강조되었습니다. 다음은 인간 세포만을 사용하여 BBB를 모델링하는 미세생리학적 시스템을 설정하는 간단한 방법입니다. 그 구성에서 모델은 뇌 유사 내피 세포 (BREC), 혈관 주위 세포 및 성상 세포를 포함하는 삼중 배양으로 구성되며, 세 가지 주요 BBB 세포 행위자는 화합물을 조일 필요없이 BBB 특성을보다 생리 학적 방식으로 유도하고 조절하는 데 필요합니다. 삼중 배양 6일 후 준비된 12웰 플레이트 형식으로 개발된 이 모델은 물리적 특성, 유전자 및 단백질 발현을 특징으로 하며 고분자 나노겔 수송 측정에 사용됩니다. 이 모델은 건강하고 병리학적인 조건에서 광범위한 실험에 사용할 수 있으며 분자 및 입자 수송의 전임상 평가는 물론 세포 간 및 세포 내 트래피킹에 유용한 도구입니다.
Introduction
뇌 모세 혈관 내피 세포 (EC) 수준에 국한된 BBB는 뇌 항상성과 신경 세포의 기능을 유지하는 데 중요한 뇌 실질에 대한 접근을 제어하고 조절합니다 1,2. 그러나 뇌 병리학의 경우 뇌 실질에 대한 접근 부족은 치료 전략 개발에 실질적인 장애물을 나타냅니다.
BBB EC는 세포 간 경로 1,2,3을 제어하는 유출 펌프, 특정 수송체 및 수용체 시스템과 관련된 세포 간 공간을 밀봉하는 TJ (tight junction) 단백질을 포함한 복잡한 특성 세트를 가지고 있습니다. 또한, 이러한 모든 특성은 BBB EC 기저막에 내장 된 혈관 주위 세포 및 말단이 뇌 모세 혈관 1,2,3을 둘러싸고있는 성상 세포와의 통신 덕분에 유도되고 유지됩니다. 따라서 BBB를 시험관 내에서 연구하는 것은 구조의 복잡성과 신경 혈관 단위 (NVU)를 구성하는 다양한 세포 유형 간의 통신을 고려할 때 어려운 과제입니다.2. 더욱이, 상이한 세포 유형은 BBB 특성의 유도 및 유지에 중요하며 결과적으로 BBB를 통한 교차의 예측에 영향을 미친다. 뇌로의 약물 전달을 위한 상이한 전략은 BBB제한된 특성4을 우회하기 위한 전술의 큰 패널을 사용하여 이미 테스트되었다. 보다 최근에는 나노 기술의 발전과 함께 약물 운반체 5,6으로 응용하기위한 새로운 재료가 개발되고 있습니다. 더 높은 부하, 독성 감소 및 약물의 생체 이용률 증가 외에도이 새로운 나노 물질은 BBB를 가로 지르고 실질 5,6의 세포를 특이 적으로 표적으로하는 트로이 목마 전략을 위해 기능화 될 수 있습니다. 평가되는 다양한 유형의 나노 물질 중에서 나노 젤은 주로 콜로이드 특성과 자극 반응 특성 7,8,9,10,11,12,13,14,15를 도입하기 위해 화학 구조를 조정할 수있는 능력으로 인해 상당한 관심을 끌었습니다.
시험관내 모델은 현재 약물16의 뇌 침투를 예측하기 위해 인간 세포를 사용하는 전임상 연구를 위해 개발되고 있다. 이러한 모델의 다양한 설정은, 뇌 EC의 단층으로부터 다중 셀 시스템(16)에 이르기까지 이용가능하다. BBB 유도 및 유지에서 NVU 세포의 중요성과 병리학 적 환경에 대한 조정 된 반응을 고려할 때, BBB in vitro 모델은 예측 2,17의 관련성을 향상시키기 위해 이러한 모든 주인공을 고려해야합니다.
현재의 방법은 특정 세포 및 인간 분자 메커니즘을 연구하기 위해 인간 세포와 함께 완전히 개발 된 인간 BBB의 삼중 배양 시험관 내 모델을 설정하는 것을 설명합니다. 생리학적으로 관련되기 위해, 상기 모델은 조임 화합물을 사용하지 않고 BBB 특성을 유도하고 유지하는 데 필요한 BBB의 주요 3개의 세포 행위자(EC, pericytes 및 성상세포)로 구성되며, 시험관내 BBB 모델16,18로서 고려되는 데 필요한 특성 세트를 나타낸다. 이 모델은 혈액 및 뇌 구획을 구분하는 구성으로 설정되며, 뇌 침투를 예측하기 위한 약물 및 입자 수송의 전임상 연구에 적합합니다. 모델의 유용성은 고분자 나노겔의 수송을 측정함으로써 설명된다.
Protocol
이 프로토콜은 프랑스 고등 교육 연구부 (참조 : CODECOH DC2011-1321)와 지역 조사 검토위원회 (프랑스 Beuvry의 Béthune 산부인과 병원)의 승인을 받았습니다. 내피 세포 (ECs)를 얻기 위해 프랑스 법률에 따라 제대혈을 수집하기 위해 기증자의 부모로부터 서면 및 정보에 입각 한 동의를 얻었습니다. 혈관주위세포는 Takashi Kanda 교수(일본 우베 야마구치 대학 의과대학원 신경학 및 임상 신경과학과)가 제공하며, 참고문헌19에 따라 분리되었습니다. 일차 인간 뇌 피질 성상 세포는 상업적 공급자로부터 구입합니다 ( 재료 표 참조).
1. 세포 배양
- 내피 세포의 배양
참고: 내피 세포(EC)는 Pedroso et al.20에 설명된 방법에 따라 인간 제대혈에서 분리된 CD34+ 조혈 줄기 세포에서 파생됩니다. EC의 내피 표현형은 Pedroso et al.20에 기재되어 있습니다.- 5%의 태아 송아지 혈청(FCS), 0.5%의 겐타마이신 및 1%의 내피 세포 성장 보충제(ECM)가 보충된 내피 세포 배지를 사용하여 인간 EC를 배양합니다( 재료 표 참조).
- 계대 배양 EC의 경우 모델 설정 이틀 전에 한 접시에 2% 젤라틴 10mL를 37°C에서 15분 동안 코팅한 다음 따뜻한 ECM 20mL로 교체합니다. 100만 개의 세포를 함유하는 ECs의 바이알 1개(세포는 세포 동결 전에 단계 2.3.3에 기재된 바와 같이 수동으로 계수됨)를 사전 코팅된 세포 배양 접시에서 해동시킨다.
- 37°C에서 3시간 후, 배지를 갱신하고, 5% CO2 및 21%O2 하에 37°C에서 인큐베이터 내부의 가습된 분위기에서 삼배양이 설정될 때까지 세포를 유지한다.
- 혈관주위세포의 배양
참고 : pericytes는 Shimizu et al.19에 의해 발표 된 프로토콜에 따라 인간의 뇌에서 분리되며, 분리 절차는 Kanda et al.21 이 수정 한 방법을 따릅니다.- 4.5g/L의 포도당(DMEM HG), 10%의 FCS, 1%의 드 페니실린/스트렙토마이신 및 1%의 L-글루타민이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지를 사용하여 혈관주위세포를 배양합니다( 재료 표 참조).
- pericyte 계대 배양의 경우, 모델 설정 5 일 전에 실온 (RT)에서 1 시간 동안 0.02N 아세트산에서 콜라겐 유형 I 용액 100μg / mL의 8mL / dish로 두 접시를 코팅 한 다음 RT DMEM HG로 두 번 세척합니다. 10 mL의 따뜻한 배지를 함유하는 원뿔형 튜브에서 100만 개의 세포를 함유하는 혈관주위세포의 한 바이알을 해동시키고, 현탁액을 20°C에서 190 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
- 펠릿을 10mL의 따뜻한 배지에 재현탁하고 15mL의 따뜻한 배지/접시로 미리 채워진 미리 코팅된 세포 배양 접시에 시드합니다. 배지는 3일 후에 갱신되고, 세포는 5% CO2 및 21%O2 하에 37°C에서 가습된 배양기에서 삼배양의 세팅까지 유지된다.
- 성상 세포의 배양
- 20 %의 FCS, 1 %의 성상 세포 성장 보충제 및 1 %의 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액 (AM)이 보충 된 성상 세포 배지를 사용하여 성상 세포를 배양하십시오 ( 재료 표 참조).
- 성상 세포를 계대 배양하기 위해 모델 설정 1 주일 전에 T75 세포 배양 플라스크 10mL를 2μg / cm 2 폴리 -L- 라이신 (PLL) 10mL로 37 ° C에서 1 시간 동안 코팅하고 RT 멸균 수로2 회 세척합니다. 20mL의 따뜻한 배지에 100만 개의 세포가 포함된 성상세포 바이알 하나를 해동하고 미리 코팅된 T75 세포 배양 플라스크에서 시드합니다.
참고: 상업적으로 얻은 세포 바이알은 ~100만 개의 세포의 존재를 확인하므로 여기에서 세포 계수가 수행되지 않았습니다. - 세포를 5% CO2 및 21%O2 하에 37°C에서 가습된 인큐베이터에 유지한다. 배지는 24 시간 후에 갱신 된 다음 삼중 재배가 설정 될 때까지 2 일마다 갱신됩니다.
2. 삼중 문화 모델 설정
참고: 세 가지 셀 유형의 조립은 같은 날에 수행됩니다. 삼중 배양 설정 전날, 되돌린 삽입 필터( 재료 표 참조)에서 콜라겐 유형 I 코팅을 수행하고 12웰 플레이트의 PLL 사전 코팅된 웰에 성상세포를 파종합니다.
- 우물에 성상 세포의 파종
- 단계 1.3.2에 설명된 대로 2μg/cm2PLL 용액 500μL로 웰을 코팅합니다.
- 따뜻한 인산염 완충 식염수(칼슘 및 마그네슘이 없는 1X(1X PBS-CMF)(표 1)로 세포를 한 번 세척한 후 따뜻한 20% 트립신/EDTA(T/E) 용액 10mL로 37°C에서 3분 동안 배양하고 플라스크에서 세포를 기계적으로 분리합니다. 현탁액을 5mL의 따뜻한 희석되지 않은 FCS가 들어있는 원추형 튜브로 옮깁니다.
참고 : 제공자의 프로토콜22에 따르면, 플라스크를 인큐베이터에 1 분 동안 놓고 플라스크를 두드려 분리를 완료함으로써 성상 세포 수집을 최적화 할 수 있습니다. 나머지 세포는 5mL의 T/E 중화 용액으로 수집하여 FCS 함유 원추형 튜브에 넣어야 합니다. - 현탁액을 190 x g에서 20°C에서 5분 동안 원심분리한다.
- 5mL의 따뜻한 AM에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 현미경 하에서 수동 계수 챔버를 사용하여 80μL의 1X PBS-CMF에 20μL의 세포 현탁액을 희석하여 세포를 계수합니다( 재료 표 참조). 각 PLL 사전 코팅된 웰에 약 40,000개의 세포/cm2 를 1.5mL의 따뜻한 AM 부피로 플레이팅합니다.
- 되돌린 삽입 필터에 혈관주위세포 파종
- 뒤집힌 인서트 필터에 250μL의 콜라겐 유형 I 용액(100μg/mL)을 추가하고 멸균 핀셋을 사용하여 덮인 25mm 높이의 접시( 재료 표 참조) 주변에 놓습니다. 멸균 조건에서 RT에서 코팅을 1 시간 동안 그대로 두십시오.
알림: 사용한 접시는 후드 외부에서 멸균을 유지하고 되돌린 필터의 용액과 접시 덮개 사이의 접촉을 방지할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다. - 흡인 시스템에 연결된 유리 피펫으로 콜라겐 유형 I 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 250μL의 RT DMEM HG로 두 번 세척한 다음 인서트 필터에서 모든 용액을 조심스럽게 제거합니다. 코팅된 인서트 필터는 세포가 파종될 때까지 멸균 조건에서 RT에 두십시오.
알림: 코팅 절차 중에 멤브레인 손상을 방지하기 위해 필터를 만지지 않도록 주의하십시오. 콜라겐 유형 I로 코팅되면 삽입 필터를 RT에서 밤새 보관할 수 있습니다. - 삼중 배양 설정 당일에 따뜻한 1X PBS-CMF 10mL로 주위세포를 두 번 씻고 따뜻한 트립신 2mL로 세포를 배양합니다. 현미경으로 세포를 관찰함으로써 트립신의 작용을 모니터링한다. 세포가 분리되기 시작하면 트립신을 제거하고 기계적 해리 전에 따뜻한 ECM 5mL를 추가합니다.
- 현미경 하에서 수동 계수 챔버를 사용하여 80μL의 1X PBS-CMF에 20μL의 세포 현탁액을 희석하여 세포를 계수하고, 250μL의 부피로 사전 코팅된 되돌린 삽입 필터에 44,500 cells/cm2를 시드합니다. 인서트 필터를 37 ° C의 가습 인큐베이터에 5 % CO 2 및 21 % O2 하에서 3 시간 동안 보관하십시오.
- 1.5mL의 따뜻한 ECM/웰이 들어 있는 12웰 플레이트에서 멸균 핀셋을 사용하여 삽입 필터를 조심스럽게 되돌립니다. 이제 인서트 필터를 반대쪽에 코팅할 준비가 되었습니다.
- 뒤집힌 인서트 필터에 250μL의 콜라겐 유형 I 용액(100μg/mL)을 추가하고 멸균 핀셋을 사용하여 덮인 25mm 높이의 접시( 재료 표 참조) 주변에 놓습니다. 멸균 조건에서 RT에서 코팅을 1 시간 동안 그대로 두십시오.
- 삽입 필터에 내피 세포 파종
- 인서트 필터의 윗면을 500μL의 세포외 기질 기반 하이드로겔(1/48v/v)로 코팅합니다(재료 표 참조). 1 시간 후, 5 % CO 2 및 21 % O2 하에 37 °C의 가습 인큐베이터에서, 500 μL의 RT DMEM HG로 1 회 세척한다.
- 따뜻한 1X PBS-CMF 10mL로 한 번 세척하고 따뜻한 트립신 2mL로 세포를 배양합니다. 세포가 분리되기 시작하면 트립신을 제거하고 기계적 해리 전에 따뜻한 ECM 5mL를 추가합니다.
- 현미경 하에서 수동 계수 챔버를 사용하여 80μL의 1X PBS-CMF에 20μL의 세포 현탁액을 희석하여 세포를 계수하고 500μL의 따뜻한 ECM 부피로 사전 코팅된 삽입 필터에 71,500 cells/cm2 의 밀도로 EC를 시드합니다.
- AM을 1.5mL의 따뜻한 ECM/웰로 교체한 다음 시드된 삽입 필터(EC + pericytes)를 성상세포가 포함된 웰에 옮깁니다.
- 삼배양 세포 시스템을 5% CO2 및 21%O2 하에 37°C의 가습 인큐베이터에 넣습니다.
- BBB 특성의 유도를 위한 삼중세포 배양액의 유지
참고: EC에서 BBB 속성을 유도하려면 6일간의 삼중 배양이 필요합니다.- 흡인 시스템과 연결된 유리 피펫을 사용하여 상부 및 하부 구획에서 배지를 조심스럽게 제거하고 6 일까지 격일로 배지를 갱신하십시오.
- 상부 구획에서 500 μL 및 하부 구획에서 1.5 mL의 부피로 따뜻한 ECM으로 신속하게 교체하고, 세포를 5 % CO 2 및 21 % O2 하에서 37 °C에서 가습 인큐베이터에 다시 넣었다.
3. BBB 표현형 검증
참고: 6일간의 삼중 배양 후, ECs에서 BBB 표현형을 유도하는데 필요한 시간, 인간 BBB 모델은 실험을 위해 준비된다. 뇌 유사 내피 세포 (BREC)의 물리적 완전성은 BBB 완전성 마커에 대한 투과성 분석을 사용하여 평가 된 TJ 단백질의 면역 형광 염색에 의해 시각화됩니다. BBB 표현형 검증에는 Deligne et al.,23에 설명된 절차에 따라 유전자/단백질 발현 분석 및 유출 펌프 기능도 포함됩니다. Pericytes 및 Astrocytes는 Deligne et al.에 기재된 절차에 따라 각각의 염색 마커에 의해 가시화된다. 2020년23월.
- 면역형광염색
- 인서트 필터와 성상 세포를 얼음처럼 차가운 메탄올 / 아세톤 (50 / 50 v / v)에 1 분 동안 고정하고 RT 1X PBS-CMF로 두 번 세척하십시오.
- 메스를 사용하여 멤브레인을 절단하여 필터를 인서트에서 조심스럽게 분리하십시오. Deligne et al.23에 따라 멤브레인 및 바닥 웰에서 면역세포화학을 수행합니다.
알림: 블로킹 단계의 경우 RT에서 250분 동안 30μL의 SEA BLOCK 블로킹 버퍼( 재료 표 참조)를 사용하십시오.
- BBB 무결성 분석
- 나트륨 플루오레세인(NaF) 및 20kDa 덱스트란(FD20)과 같이 분자량이 다른 BBB 무결성 마커를 사용한 투과성 분석을 통해 BLEC의 물리적 무결성을 평가합니다( 재료 표 참조).
참고: 실험은 Deligne et al.23에 설명된 절차에 따라 수행할 수 있습니다.
- 나트륨 플루오레세인(NaF) 및 20kDa 덱스트란(FD20)과 같이 분자량이 다른 BBB 무결성 마커를 사용한 투과성 분석을 통해 BLEC의 물리적 무결성을 평가합니다( 재료 표 참조).
- 유출 펌프 기능
- Elacridar, P-gp 및 BCRP 억제제의 유무에 관계없이 Rhodamine 123 (R123)의 세포 내 축적을 측정하여 P- 당 단백질 (P-gp) 및 유방암 저항성 단백질 (BCRP)의 기능을 평가합니다 ( 재료 표 참조).
참고: 실험은 Deligne et al.23에 설명된 절차에 따라 수행할 수 있습니다.
- Elacridar, P-gp 및 BCRP 억제제의 유무에 관계없이 Rhodamine 123 (R123)의 세포 내 축적을 측정하여 P- 당 단백질 (P-gp) 및 유방암 저항성 단백질 (BCRP)의 기능을 평가합니다 ( 재료 표 참조).
- 유전자 및 단백질 발현
- 세포의 콜드 링거 헤페스(RH)(표 1)로 빠르게 세척한 후 얼음 상에서 유전자 및 단백질 샘플 수집을 수행한다. EC 샘플 수집 전에, 반전된 삽입 필터(20)로부터 혈관주위세포를 긁어낸다.
4. 나노 겔 수송
참고: 삼중 배양 BLEC 모델의 내강에서 내강 구획으로의 고분자 나노겔(NG)의 통과를 추정하기 위해 0.1mg/mL의 NG 용액을 6일째에 내강 구획에 24시간 동안 첨가했습니다. 연구 된 NG는 평균 크기가 8-10 nm 인 형광 태그 N- 이소 프로필 아크릴 아미드 (NIPAM) 기반 하이드로 겔이었다 ( 재료 표 참조).
- 나노 겔 분말의 무게를 측정하고 1 mg / mL의 농도로 ECM에 가용화합니다. 용액을 10분 동안 초음파 처리하고 0.2μm PTFE 필터를 사용하여 필터링합니다.
참고: 실험 당일 신선한 NG 용액을 준비하십시오. - 내강 구획의 배지를 변경하고 최종 농도 0.1mg/mL에 대해 상부 구획에 NG 용액 50μL를 추가합니다.
참고: 원래 용액에서 1:10의 희석을 수행하십시오. - 24시간 배양 후 내강(20μL) 및 절강(200μL) 구획에서 분취량을 수집하여 검은색 96웰 플레이트에 넣습니다.
- 477/540nm에서 여기/방출 파장 설정을 사용하여 검은색 96웰 플레이트가 있는 형광 멀티플레이트 리더(재료 표 참조)를 사용하여 형광을 정량화합니다. 시간 = 0 h (t0)6,15에서 추가 된 초기 작업 용액에 대한 교차 비율을 계산합니다.
참고: 형광 측정을 위해 96웰 플레이트를 준비하려면 내강 구획에서 200μL의 용액과 내강 구획에서 20μL의 용액을 추가하고 t0 준비(최종 부피 200μL에 도달하려면 ECM 180μL를 추가). 또한 판독 판에 교정 곡선과 블랭크를 포함하십시오. 기기 파라미터: 검출 방법 - 형광, 광학 위치 - 상단, 판독 유형 - 엔드포인트, 여기 파장 - 477 nm, 방출 파장 - 540 nm, 감도 - 100, 쉐이크 - 5초 동안 이중 궤도.
Representative Results
인간 삼중 문화 BBB 모델의 설정
인간 BBB in vitro 모델의 설정에 필요한 프로토콜은 그림 1 에 설명되어 있으며 순서를 엄격하게 준수해야하는 연속 단계를 포함합니다. 먼저, 세 가지 세포 유형을 삽입 필터 시스템에 조립하기 전에 세포 배양 접시(그림 1A)에서 개별적으로 배양합니다. 삼중 배양 설정은 사전 코팅된 바닥 웰에 첫 번째 세포 유형인 성상세포를 파종하는 것으로 시작됩니다. 다음 날, pericytes와 EC는 각각 삽입 필터의 사전 코팅 된 경사 및 내강 표면에 파종됩니다. 그런 다음 삽입 필터가 성상 세포 위로 옮겨집니다. 상기 모델은 ECs에서 BBB 특성을 유도하는데 필요한 시간인 6일 동안 배양물에서 유지되고, 특허받은 공동배양 모델24에 따라 격일로 배지를 갱신한다. 그런 다음 EC의 이름이 BLEC로 바뀝니다(그림 1B).
인간 BBB 모델의 특성화
삼중 세포 배양 모델은 BBB 특이적 특성의 세트의 존재에 대해 특성화되었다. 우선, 면역 세포 화학 데이터는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β (PDGFR-β) 25,26 및 pericytes에 대한 desmin 및 성상 세포에 대한 glial 섬유소 산성 단백질 (GFAP) 26과 같은 기존의 마커의 발현을 확인했습니다 (그림 2A). 따라서, pericytes 및 성상 세포와 함께 6 일간의 배양 후, VE-Cadherin의 부착 접합 염색으로 시각화 된 BLECs의 단층은 세포 경계에서 TJ 단백질 Claudin-5 및 ZO-1의 지속적인 국소화를 나타냅니다 (그림 2A). TJ의 설정은 도 2B에 도시된 바와 같이, 저분자량, 즉 NaF(376 Da)16,27 및 고분자량, 즉 FD20(20 kDa)27의 BBB 완전성 마커를 사용하여 측정된 낮은 반세포 투과성 계수와 상관관계가 있다. 측정된 값은 ECs23,24,28의 정확한 소스를 사용하여 검증된 BBB in vitro 모델과 비교할 수 있습니다. 전체적으로, 이러한 결과는 생체 내 BBB의 특징 인 삼중 배양 BLEC 단층의 낮은 paracellular 투과성을 강조합니다. 또한, BLECs에서의 R123 세포 내 축적은 유출 펌프 억제제 Elacridar 23,24의 존재가 부재 한 대조군 조건에 비해 현저한 증가를 나타냈다 (그림 2C). 이것은 BLEC에서 활성 유출 펌프 분자, 즉 P-gp 및 BCRP의 존재를 나타냅니다.
BLECs를 추가로 특성화하기 위해 주요 BBB 기능의 유전자 발현 및 단백질 수준을 연구했습니다(그림 3). 삼중 배양 모델로 얻은 데이터는 대조군 모델로 사용된 ECs 및 pericytes24 로 구성된 검증되고 특허받은 공동 배양 모델과 비교되었습니다. 성상 세포는 삼중 배양 모델에서 초기 공동 배양 모델에 추가 된 세 번째 세포 유형을 나타냅니다. 따라서, 삼중 배양 BLECs의 유전자 발현 분석 (그림 3A)은 공동 배양 BLECs와 비교하여 TJ 단백질 (claudin-5 및 zonula occludens-1) 및 유출 펌프 (P-gp 및 BCRP)와 같은 주요 BBB 기능의 발현 유지와 가장 많이 연구 된 BBB 수송 체 (포도당 수송 체 1) 및 수용체 (트랜스페린 수용체). 단백질 정량 데이터(도 3B)는 전사 결과와 일치하는 것으로 확인되었다. 전반적으로, 이들 데이터는 검증된 공동배양 모델과 유사한 삼중 배양 BLEC 층에서 BBB 특성의 양성 유도를 지지한다. 전체적으로 삼중 배양 모델은 BBB를 모델링하기 위해 시험관 내 미세생리학적 시스템에 필요한 물리적 및 대사적 특성을 표시합니다.
약물 전달 전략에 대한 적용 가능성 - 나노겔 수송 측정
새로운 뇌 전달 전략을 연구하기 위해 삼중 배양 모델을 사용할 가능성을 평가하기 위해 형광 태그가 부착 된 NIPAM 기반 중성 NG의 수송이 6,15로 평가되었습니다. 시간 0에서, NG는 0.1 mg / mL의 농도로 내강 구획에 배치되었다 (그림 4A). 24 시간의 배양 후, NG의 5.82 %가 abluminal 구획 (그림 4B)에서 발견되어 BLEC를 가로 지르는 능력을 입증했습니다.
결과는 무결성 마커로 설명된 대로 작고 큰 화합물의 투과성을 측정하고 고분자 NG와 같은 나노 물질의 수송을 평가하는 모델의 적합성을 보여줍니다.
그림 1: 인간 BBB의 삼중 배양 시험 관내 모델의 설정을 위한 중요한 단계의 표현 . (A) BBB 모델의 세 가지 세포 구성 요소 인 내피 세포 (EC), 혈관 주위 세포 (PC) 및 성상 세포 (AC)의 위상차 이미지. 스케일 바 = 250 μm. (B) 삼중 배양 인간 BBB in vitro 모델의 설정을 위한 개략도 및 예시적인 타임라인. 강조 표시된 상자는 반전된 인서트 필터의 코팅 절차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 삼중 배양 BBB 모델의 특성 평가. (A) BLE (Claudin-5 : CLD5, Zona Occludens-1 : ZO1 및 VE- Cadherin : Ve-Cadh), 혈관 주위 세포 (혈소판 유래 성장 인자 수용체 -β : PDGFR-β 및 데스 민) 및 성상 세포 (Glial 섬유소 산성 단백질 : GFAP)에 대한 고유 한 마커의 대표적인 면역 염색 이미지. 스케일 바 = 10 μm. (B) 형광 BBB 무결성 마커, 나트륨 플루오레세인 (NaF, 376 Da, Pe : 0.61 ± 0.062) 및 FITC- 덱스 트란 (FD20, 20 kDa, Pe : 0.04 ± 0.005)에 대한 BLECs의 세포 투과성. N = 3; n = 9. 평균 ± SEM. (C) ECs에서의 P-gp 및 BCRP 기능성은 엘라크리다르가 있는 세포내 R123(124.2% ± 3.39%)과 없는 것(100% ± 8.79%)을 정량화함으로써 평가하였다. N = 4; n = 12. 평균± SEM. p = 0.017(쌍체되지 않은 t-검정 사용). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 공동 배양 BBB 모델과 비교한 삼중 배양 모델에서 BLEC 유전자 발현 및 특유의 마커의 단백질 수준 평가. (A) RPLP0의 발현에 의해 정규화 된 단단한 접합 단백질 (Claudin-5 : CLD5 및 Zona Occludens-1 : ZO1), 수송 체 (포도당 수송 체 -1 : GLUT1, P- 당 단백질 : PGP 및 유방암 저항성 단백질 : BCRP) 및 큰 분자 수용체 (트랜스페린 수용체 : TRFR)의 유전자 발현. N = 3; n = 9. (B) β- 액틴의 발현에 의해 표준화 된 단단한 접합 단백질 (CLD5 및 ZO1), 수송 체 (GLUT1, PGP 및 BCRP) 및 큰 분자 수용체 (TRFR)의 단백질 수준. N = 3; n = 9. SEM± 평균. (A) 및 (B)의 경우, 값 >1은 삼중 배양 모델에서 더 높은 유전자 발현 또는 단백질 수준에 대응한다. 빨간색 선은 두 모델의 발현 수준(유전자 또는 단백질)이 동일한 값 1에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 삼중 배양 모델에서 나노겔 수송 측정. (A) 나노겔 수송 분석의 개략적 표현. (B) 삼중 배양 모델에서 배양 24시간 후 나노겔 수송 비율(5.82% ± 0.09%). N = 2; n = 6. SEM± 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼의 이름 | 구성 | 메모 | ||||
| 분자량 | ||||||
| 인산염 완충 식염수, 칼슘 마그네슘 프리 | PBS-CMF | 나트륨 | 8 g / L | 58.4 | 모든 화합물을 멸균 수에 넣고 완전히 용해 될 때까지 기다리십시오. 수득된 용액의 pH는 7.3-7.4의 범위여야 한다. 0.22 μm 멤브레인을 사용하여 용액을 여과하고 멸균 용액을 4°C에서 보관한다. | |
| 증권 시세 표시기 | 0.2 g / L | 74.55 | ||||
| KH2PO4 | 0.2 g / L | 136.09 | ||||
| NaHPO4-12 H2O | 2.87 g / L | 358.14 | ||||
| 물 | ||||||
| 링거 헤페스 | 상대습도 | 나트륨 | 8.8 g / 리터 | 58.4 | 모든 화합물을 멸균 수에 첨가하고 완전히 용해 될 때까지 기다리십시오. pH를 7.4로 조정합니다(시작 용액 pH 약 6.8). 0.22 μm 멤브레인을 사용하여 용액을 여과하고 멸균 용액을 4°C에서 보관한다. | |
| 증권 시세 표시기 | 0.387 g / L | 74.55 | ||||
| CaCl2 | 0.244 g / L | 110.99 | ||||
| MgCl2 6H2O | 0.0406 g / L | 203.3 | ||||
| 나HCO3 | 0.504 g / L | 84.1 | ||||
| 헤페스 | 1.19 g / L | 238.3 | ||||
| 포도당 | 0.504 g / L | 180.16 | ||||
| 물 | ||||||
표 1: 프로토콜에 사용된 다양한 버퍼의 조성.
Discussion
뇌 질환의 치료는 약물이 뇌 실질의 세포 및 분자 표적에 도달하기 위해 BBB를 넘어 장애물을 통과하는 어려움을 고려할 때 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다.
뇌 질환에 대한 약물 개발은 전임상 모델에서 유망한 결과를 나타내는 대부분의 약물이 클리닉에서 사용될 때 어떤 이점도 보여주지 못했기 때문에 현재 낮은 성공률을 보입니다. 실험에 사용되는 동물의 수를 줄이는 것을 목표로하는 "3R 규칙"에 따라, BBB의 시험관 내 모델은 뇌 병리를 연구하고 약물29의 뇌 침투를 예측하기 위해 개발된다. BBB의 시험관내 모델은 주로 동물 세포를 사용하여 개발되었으며 얻어진 결과의 관련성을 향상시키기 위해 더욱 정교해졌습니다(16). 인간 세포 사용의 중요한 발전 중 하나는 인간 질병 메커니즘을 연구하기 위해 세포 및 분자 수준에서 부인할 수없는 새로운 통찰력과 더 많은 특이성을 제공합니다16. 그러나 관련 모델의 개발은 동물 모델 덕분에 BBB in vitro 모델 설정의 개선과 발생하는 지식을 고려해야합니다. 따라서, BBB 아키텍처의 복잡성 및 생리학적 및 병리학적 조건 하에서 BBB를 연구하기 위한 세포-세포 통신의 중요성을 고려할 필요가 있다(30).
여기에 제시된 프로토콜은 뇌 조직에 대한 접근의 제한 없이 BBB의 세 가지 주요 세포 유형을 포함하는 완전한 인간 BBB 시험 관내 모델을 설정하는 방법을 기술한다. 다중 세포 시스템으로서, BBB 특성의 유도 및 유지는, 조임 화합물의 인위적인 사용 없이, 그러나 세포-세포 통신에 의해 유도되는 대신에 BBB 특성의 생체내 유도와 일치하고 보다 생리학적으로 관련된다31. 따라서 프로토콜의 연대기에 대한 존중은 프로토콜의 성공을 위해 가장 중요합니다. 더욱이, 삼중 배양의 설정 동안의 배양 시간 및 일단 3개의 세포 유형이 조립되면 프로토콜의 주요 중요 단계를 나타낸다.
ECs에서의 BBB 특성은 공동-배양 모델24에 대해 설명된 바와 같이, 주위세포와의 공동-배양에 의해 유도된다. 따라서 삽입 필터의 뒷면에서 혈관 주위 세포의 배양이 가장 중요한 지점이며 BBB 특성의 유도를 위해 충분한 주변 세포가 없을 위험이 있으므로 프로토콜을 엄격하게 따라야합니다. 우선, 코팅 절차 및 세포 파종 중에 페트리 접시의 덮개가 코팅과 접촉하지 않도록주의해야하며 세포가 파종되면 여과기의 양호한 코팅을 보장하고 세포를 잃지 않도록 배지를 넣어야합니다 (2.2.1 및 2.2.4 단계). 또한, pericytes가 파종되면, 다른 쪽에서 EC의 코팅 및 파종을 위해 삽입 필터를 되돌리기 전에 pericytes의 부착을 위해 표시된 시간 (단계 2.2.4)을 기다리는 것이 필수적입니다 (단계 2.2.5 및 2.3). 일단 파종되면, 세포-세포 통신을 통해 BBB 특성을 유도하기 위해 6일이 필요하다(단계 2.4).
삼중 배양 모델의 EC는 검증된 공동 배양 모델과 유사한 BBB 무결성 마커에 대한 투과성 값을 표시하고 검증된 동물 또는 인간 모델 16,27,32에서도 측정되기 때문에 모델은 제한된 투과성(단단한 접합부의 설정과 관련됨) 측면에서 검증됩니다. 더욱이, 시험관내 BBB 모델의 검증은 제한된 투과성 이외에, NVU의 다른 세포 유형에 대한 반응성 및 기능적 수용체 및 수송체(16)의 발현을 요구한다. 또한 이 모델은 재현 가능하며 여러 삽입 필터와 웰을 생성하여 세포 분류 방법 없이 각 세포 유형에 대해 개별적으로 수많은 분석(유전자 및 단백질 발현, 형광 염색, 독성 테스트)을 수행합니다.
이 모델은 0.4μm 공극 크기 필터를 사용하여 개발되어 삽입 필터의 각 측면에 하나의 셀 유형이 있습니다. 삽입 필터 시스템은 생리적 조건에서 세포-세포 통신을 잘 포함된 성상세포에 전달하여 연구할 수 있었습니다. 시스템 내의 성상교세포의 존재는 초기 시험관내 공동 배양 모델24와 비교하여 플러스 값을 나타낸다. 실제로, BBB의 생리학에서 성상 세포의 중요성을 고려할 때,이 세 번째 세포 유형은 BBB 내의 세포 - 세포 통신에 대한 더 깊은 이해를 가능하게합니다. 또한, 삼중 세포 배양 시스템은 성상 세포가 필수적인 역할을하는 뇌졸중과 같은 병리학 적 상태에서도 연구 될 수있다(33,34,35). 또한, 삽입 필터의 양면에 있는 BLEC/pericytes의 디자인은 뇌암(23)과 같은 병리학적 상태를 모방하기 위해 다른 세포 유형 상에 용이하게 배치될 수 있다.
삽입 필터의 기공 크기는 BBB를 가로지르는 세포 이동과 같은 일부 실험에서 제한을 가져올 수 있습니다. 그러나, 더 큰 공극 크기를 갖는 모델의 개발은 다중 층이 아닌 ECs의 생리학적 단층의 형성을 보장하기 위한 프로토콜의 적응을 필요로 하며, 이는 BBB36을 모방하는 것과 생리학적으로 관련이 없다.
이 모델의 적용 가능성은 다세포 시스템을 사용하여 수송 실험을 수행 할 수있는 가능성을 보여주는 NG 수송 실험을 사용하여 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고 각 나노 구조가 고유한 특성 세트(분자량, 전하, 모양, 물리적 특성, 단백질 코로나 형성)를 나타내기 때문에 NG와 유사한 특성을 공유하는 수송 실험을 위한 대조 화합물 또는 분자를 갖는 데 어려움이 있음을 인식해야 합니다.
상기 모델의 하나의 한계는 전단 응력의 부재이며, 이는 ECs의 분화 및 TJ 단백질37의 발현에 영향을 미치는 것으로 입증되었다. 그러나 뇌 모세관을 모방 한 유체 시스템을 개발하는 것은 다중 세포 시스템에서 특정 장치가 필요한 유체 부분을 추가하는 복잡성을 고려할 때 어렵습니다. 더욱이, 특정 장치는 일반적으로 상업적으로 이용 가능하지 않으며 많은 복제를 허용하지 않으므로 유체 시스템이 고 처리량 사용에 적합하지 않습니다.
요약하면, 인간 세포로 구성된이 삼중 배양 시스템은 BBB의 구조를 시험관 내에서 재현합니다. 화합물의 광범위한 스크리닝에 사용할 수 있는 많은 인서트를 생성할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 NANOSTEM 프로젝트의 일환으로 Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi)의 보조금 계약 No 764958에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 부여됩니다. 이 연구는 'Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais'(Clémence Deligne에 대한 펠로우십), "Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l'Enfant et de l'adolescent"(SFCE), Association "l'étoile de Martin"및 Association"Cassandra contre la leucémie"에 의해 부여됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
| Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
| Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
| Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
| Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
| Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
| Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
| Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
| Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
| Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
| Glutamine | Merck | 1002891000 | |
| Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
| Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
| Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
| Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
| Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
| Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
| Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
| Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
| Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
| Immunocytochemistry | |||
| SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
| Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
| Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
| Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
| Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
| Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
| Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
| Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
| Gene expression | |||
| NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
| 96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
| iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
| Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
| Protein expression | |||
| 2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
| Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
| Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
| Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
| Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
| Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
| Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
| Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
| Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
| Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
| ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
| Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
| Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
| RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
| TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
| TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
| Tween | Biorad | 1706531 | |
| BBB integrity assay | |||
| Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
| Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
| FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
| Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
| SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
| Nanogel Transport | |||
| Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
| Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
| N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |
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