Summary
פרוטוקול זה נועד לבודד mRNA ריבוזומלי ספציפי לסוג התא באמצעות מודל העכבר NuTRAP.
Abstract
הטרוגניות תאית מציבה אתגרים להבנת תפקודן של רקמות מורכבות ברמת שעתוק. שימוש ב-RNA ספציפי לסוג התא מונע מלכודות פוטנציאליות הנגרמות על ידי ההטרוגניות של רקמות ומשחרר את ניתוח השעתוק העוצמתי. הפרוטוקול המתואר כאן מדגים כיצד להשתמש בשיטת טיהור זיקת ריבוזום (TRAP) לבודד רנ"א הקשורים לריבוזום מכמות קטנה של תאים המבטאים EGFP ברקמה מורכבת ללא מיון תאים. פרוטוקול זה מתאים לבידוד רנ"א ספציפיים לסוג התא באמצעות מודל עכבר NuTRAP הזמין לאחרונה, וניתן להשתמש בו גם לבידוד רנ"א מכל תא המבטא EGFP.
Introduction
גישות בעלות תפוקה גבוהה, כולל ריצוף RNA (RNA-seq) ומיקרו-מערך, אפשרו לחקור פרופילי ביטוי גנים ברמה הגנומית כולה. עבור רקמות מורכבות כמו הלב, המוח והאשכים, הנתונים הספציפיים לסוג התא יספקו פרטים נוספים המשווים את השימוש ב-RNA מכל הרקמה 1,2,3. כדי להתגבר על ההשפעה של הטרוגניות תאית, שיטת טיהור זיקת הריבוזום המתורגמת (TRAP) פותחה מאז תחילת שנות ה-20104. TRAP מסוגל לבודד רנ"א הקשורים לריבוזום מסוגי תאים ספציפיים ללא דיסוציאציה של רקמות. שיטה זו שימשה לניתוח טרנסלטום (mRNA המגויס לריבוזום לתרגום) באורגניזמים שונים, כולל התמקדות באוכלוסייה נדירה ביותר של תאי שריר בעוברי Drosophila5, חקר תאי שורש שונים בצמח המודל Arabidopsis thaliana6, וביצוע ניתוח תעתיק של תאי אנדותל ביונקים7.
TRAP דורש שינוי גנטי כדי לתייג את הריבוזום של אורגניזם מודל. אוון רוזן ועמיתיו פיתחו לאחרונה מודל עכבר בשם תיוג גרעיני ותרגום של עכברטיהור זיקה ריבוזום (NuTRAP) 8, הזמין דרך מעבדת ג'קסון מאז 2017. על ידי חצייה עם קו עכבר Cre, חוקרים יכולים להשתמש במודל עכבר NuTRAP זה כדי לבודד רנ"א הקשורים לריבוזום וגרעיני תאים מתאים המבטאים Cre ללא מיון תאים. בתאים המבטאים Cre הנושאים גם את אלל NuTRAP, הריבוזום המתויג EGFP/L10a מאפשר בידוד של תרגום mRNA באמצעות מבחני משיכה של זיקה. באותו תא, הממברנה הגרעינית המתויגת כפפטיד זיהוי ביוטין ליגאז (BLRP), שגם היא חיובית ל-mCherry, מאפשרת בידוד גרעיני באמצעות טיהור מבוסס זיקה או פלואורסצנציה. אותו צוות מחקר גם יצר קו עכברים דומה שבו קרום הגרעין מסומן רק עם mCherry ללא ביוטין8. שני קווי עכבר מהונדסים גנטית אלה נותנים גישה לאפיין פרופילים אפיגנומיים ותעתיקיים זוגיים של סוגים ספציפיים של תאים בעלי עניין.
מסלול האיתות של הקיפוד (Hh) ממלא תפקיד קריטי בהתפתחות רקמות9. GLI1, בן למשפחת GLI, פועל כמפעיל תעתוק ומתווך את איתות ה-HH. תאי Gli1+ יכולים להימצא באיברים רבים המפרישים הורמונים, כולל בלוטת יותרת הכליה והאשכים. כדי לבודד דנ"א ו-RNA ספציפיים לסוג התא מתאי Gli1+ באמצעות מודל העכבר NuTRAP, עכברי Gli1-CreERT2 הוצלבו עם עכברי NuTRAP. עכברי Shh-CreERT2 נחצו גם הם כאשר עכברי NuTRAP נועדו לבודד תאים המבטאים קיפוד קולי (Shh). הפרוטוקול הבא מראה כיצד להשתמש ב- Gli1-CreERT2; עכברי NuTRAP לבידוד רנ"א הקשורים לריבוזום מתאי Gli1+ באשכים של עכברים בוגרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים שבוצעו בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת אובורן.
הערה: הפרוטוקול הבא משתמש באשכים אחד (כ-100 מ"ג) ב-P28 מ-Gli1-CreERT2; עכברי NuTRAP (Mus musculus). ייתכן שיהיה צורך להתאים נפחים של ריאגנטים על סמך סוגי הדגימות ומספר הרקמות.
1. איסוף רקמות
- להרדים את העכברים באמצעות תא CO2 , לחטא את משטח הבטן עם 70% אתנול.
- פתח את הבטן התחתונה עם מספריים ולהסיר את האשכים. השתמש בחנקן נוזלי (LN2) כדי להקפיא את האשכים באופן מיידי.
- יש לאחסן דגימות בשלב האדים של LN2 עד לשימוש.
2. הכנת ריאגנטים וחרוזים
- הכן את תמיסת מלאי ההומוגניזציה: הוסף 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40, ו 1 מ"ג / מ"ל הפרין. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש (עד חודש).
- הכן את מאגר העבודה של ההומוגניזציה מתמיסת המלאי (שלב 2.1) לפני השימוש: הוסף DTT (ריכוז סופי: 1 מ"מ), ציקלוהקסימיד (ריכוז סופי: 100 מיקרוגרם/מ"ל), ריבונוקלאז רקומביננטי (ריכוז סופי: 200 יחידות/מ"ל), וקוקטייל מעכבי פרוטאז (ריכוז סופי: 1x) לתמיסת מלאי ההומוגניזציה כדי להפוך את הכמות הנדרשת של מאגר העבודה של ההומוגניזציה. אחסנו את חיץ העבודה הטרי על הקרח עד לשימוש.
- הכינו את מאגרי המלח הנמוכים ואת מאגרי הכביסה עתירי המלח:
- להכנת תערובת חיץ עם מלח נמוך 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl ו-1% NP-40. יש להוסיף DTT (ריכוז סופי: 1 מ"מ) וציקלוהקסימיד (ריכוז סופי: 100 מיקרוגרם/מ"ל) לפני השימוש.
- להכנת תערובת חיץ עשירה במלח 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. יש להוסיף DTT (ריכוז סופי: 2 mM) וציקלוהקסימיד (ריכוז סופי: 100 מיקרוגרם/מ"ל) לפני השימוש.
- הכינו חרוזי חלבון G (טבלת חומרים):
- כל דגימה תצטרך 50 μL של חרוזי חלבון G. מניחים את כמות החרוזים הנדרשת בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ומפרידים את החרוזים מהתמיסה באמצעות מתלה מגנטי על ידי השארת הצינור על המדף למשך 30-60 שניות.
- הסר את הסופרנטנט על ידי פיפטציה. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של חיץ שטיפה קר כקרח דל מלח בכל פעם.
3. תזה של רקמות והומוגניות
- הוסף 2 מ"ל של חיץ עבודה הומוגניזציה קר כקרח (מוכן טרי משלב 2.2) לסט מטחנת רקמת זכוכית. הכנס במהירות את הדגימה הקפואה לתוך המטחנה והומוגני את הרקמה עם 30 משיכות על קרח באמצעות מזיק רופף.
- מעבירים את ההומוגנט לצינור בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
- העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 2 מ"ל. חסוך 100 μL לצינור 1.5 מ"ל כ"קלט ".
- דגירה של הסופר-נטנט בצינור 2 מ"ל עם הנוגדן נגד GFP (5 מיקרוגרם/מ"ל; 1:400) ב-4 מעלות צלזיוס על גבי סיבוב מקצה לקצה (24 סל"ד) למשך הלילה.
4. מיצוי חיסוני
- העבירו את תערובת ההומוגנט/נוגדנים לצינור חדש בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל המכיל את חרוזי החלבון G השטופים משלב 2.4. דגירה ב-4°C על סיבוב מקצה לקצה (24 סל"ד) למשך שעתיים.
- הפרידו את החרוזים המגנטיים מהסופר-נטנט באמצעות מתלה מגנטים. שמור את הסופרנטנט כ"שבר השלילי ". השבר השלילי מכיל (1) רנ"א בתאים שליליים ל-EGFP ו-(2) רנ"א בתאים חיוביים ל-EGFP שאינם קשורים לריבוזומים.
- הוסיפו 1 מ"ל של חיץ שטיפה עתיר מלח לחרוזים ומערבבים לזמן קצר את הצינור כדי לשטוף את החרוזים. הניחו את הצינור במדף מגנט.
- מוציאים את מאגר הכביסה. חזרו על שלב הכביסה פעמיים נוספות. החרוזים מכילים כעת את קומפלקס החרוזים-ריבוזום-RNA מתאים חיוביים ל-EGFP.
5. מיצוי RNA
הערה: השלבים הבאים מותאמים מתוך ערכת בידוד RNA (טבלת חומרים). התייחסו לכל שבר (כלומר, קלט, חיובי ושלילי) כדגימה עצמאית ובודדו רנ"א באופן עצמאי.
- דגירה של החרוזים משלב 4.4 עם 50 μL של מאגר מיצוי (מתוך ערכת בידוד ה-RNA) בתרמומיקסר (42 °C, 500 סל"ד) למשך 30 דקות כדי לשחרר רנ"א מחרוזים.
- מפרידים את החרוזים בעזרת מתלה מגנטים, מעבירים את הסופר-נאטנט המכיל את קומפלקס החרוזים-ריבוזום-רנ"א לצינור של 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה את הצינור ב 3000 x גרם במשך 2 דקות, ולאחר מכן פיפטה את supernatant לצינור חדש 1.5 מ"ל. צינור זה מכיל את "החלק החיובי" של שלב TRAP.
הערה: עבור הקלט והשברים השליליים, חלץ RNA מ- 25 μL של דגימות באמצעות 1 מ"ל של מאגר מיצוי. דגירה בתרמומיקסר (42°C, 500 סל"ד) למשך 30 דקות. - תנאי מראש את עמודת טיהור ה-RNA: פיפטה 250 μL של חיץ התניה על עמודת הטיהור. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). צנטריפוגה של העמודה ב 16,000 x גרם במשך דקה אחת.
- פיפט שווה נפח של 70% EtOH לתוך supernatant משלב 5.3 (סביב 50 μL של 70% EtOH עבור השבר החיובי ו 1 מ"ל של 70% EtOH עבור הקלט ואת השברים השליליים). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.
- צמחו את התערובת לתוך העמודה משלב 5.4.
- צנטריפוגה העמודה ב 100 x g במשך 2 דקות כדי לאפשר RNA קשירה לממברנה בעמודה, ולאחר מכן להמשיך צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 30 שניות מיד. בטל את הזרימה.
הערה: עבור הקלט והשברים השליליים, הוסף 250 μL של התערובת לעמודה בכל פעם. חזור על שלבים 5.6 ו- 5.7 עד לשימוש בכל התערובות. - פיפטה 100 μL של Wash Buffer 1 (W1) לתוך העמודה וצנטריפוגה ב 8,000 x גרם למשך דקה אחת. בטל את הזרימה.
- Pipette 75 μL של תמיסת DNase מתערבבים ישירות לתוך קרום עמודת הטיהור. דגירה ב- RT במשך 15 דקות.
- פיפטה 40 μL של W1 לתוך העמודה וצנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 30 שניות. בטל את הזרימה.
- פיפטה 100 μL של Wash Buffer 2 (W2) לתוך העמודה וצנטריפוגה ב 8,000 x גרם למשך דקה אחת. בטל את הזרימה.
- פיפטה 100 μL של W2 לתוך העמוד וצנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 2 דקות. בטל את הזרימה. סובבו מחדש את אותו עמוד בגודל 16,000 x g למשך דקה אחת כדי להסיר את כל עקבות חיץ הכביסה לפני שלב ההדחה.
- העבר את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל.
- פיפטה 12 μL של מים ללא RNase ישירות על הממברנה של עמוד הטיהור. קצה הפיפט לא צריך לגעת בממברנה. דגירה ב-RT למשך דקה אחת וצנטריפוגה ב-1000 x גרם למשך דקה אחת. לאחר מכן המשיכו את הצנטריפוגה ב-16,000 x g למשך דקה אחת כדי לחדד את הרנ"א.
6. ריכוז ואיכות RNA
- השתמש בביואנליזה כדי להעריך את האיכות והכמות של ה-RNA10 המופק.
7. אחסון וניתוח נוסף
- אחסן את הרנ"א בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (עד שנה אחת) עד לניתוח נוסף (למשל, מיקרו-מערך, PCR כמותי (qPCR), ו-RNA-seq וכו').
הערה: לפרטים על ניתוח qPCR, כולל סינתזת cDNA, עיין ב- Lyu et al.11. פריימרים עבור qPCR מפורטים בטבלת החומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עכבר Gli1-CreERT2 (מספר מלאי של מעבדת ג'קסון: 007913) נחצה לראשונה עם עכבר הכתב NuTRAP (מספר מלאי של מעבדת ג'קסון: 029899) כדי ליצור עכברים בעלי מוטציה כפולה. עכברים שנשאו את שני אללי הגנים המהונדסים גנטית (כלומר, Gli1-CreERT2 ו-NuTRAP) הוזרקו טמוקסיפן פעם ביום, אחת ליומיים, במשך שלוש זריקות. דגימות רקמה נאספוביום השביעי לאחר היוםהראשון של ההזרקה. ניתוח אימונופלואורסצנטי הראה שה-EGFP בא לידי ביטוי בתאים אינטרסטיציאליים באשכים (איור 1). קפסולת בלוטת יותרת הכליה ידועה כאוכלוסיית תאים נוספת חיובית של Gli112,13. EGFP נמצא גם בתאים קפסולריים של יותרת הכליה ב-Gli1-CreERT2; עכברי NuTRAP (איור 1). המעבדה שלנו נושאת גם את Shh-CreERT2; עכברי NuTRAP. שים לב כי ב Shh-CreERT2; עכברי NuTRAP, אוכלוסיית תאי EGFP+ שוכנת בקליפת המוח החיצונית של בלוטת יותרת הכליה מתחת לקפסולה (איור 1), אותו אתר ביטוי של תאי EGFP+ באזור Shh+ בבלוטת יותרת הכליה13 המאשר את הביטוי של EGFP בתאים המבטאים Cre.
לאחר מיצוי הרנ"א הספציפי לסוג התא, הכמות והאיכות של רנ"א מבודדים בכל חלק משני מיצויים עצמאיים (אשכים אחד המשמש בכל מיצוי) הוערכו באמצעות ביואנליזה (איור 2). תוצאת הביואנליזה הצביעה על כך שפרוטוקול זה מסוגל להשיג רנ"א באיכות גבוהה מכל שלושת השברים. לכל השברים היה מספר שלמות RNA (RIN) דומה.
כדי לבחון אם הרנ"א המופק הוא ספציפי לסוג התא, הרנ"א שחולץ נשלח לניתוח מיקרו-מערך באמצעות שירות מיקרו-מערך מסחרי (ראו טבלת חומרים). תוצאת המיקרו-מערך הראתה שכ-4,000 גנים היו מועשרים בחלק החיובי בהשוואה לשבר השלילי, בעוד שכ-3,000 גנים היו מועשרים בחלק השלילי (איור 3). מבין הגנים האלה שהתבטאו באופן דיפרנציאלי, הגנים הקשורים לתאי Leydig Hsd11b1 ו-Hsd3b6 14,15 הועשרו בחלק החיובי. בחלק השלילי הועשרו הגנים הקשורים לתאי סרטולי Dhh ו-Gstm616,17. רק גנים מעטים שהתבטאו באופן דיפרנציאלי זוהו כאשר השוו את השבר השלילי עם הקלט.
RT-PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) שימש גם כדי לאשר את הביטוי של גנים מרכזיים בחלק החיובי ובשבר השלילי. בדומה למה שנמצא בבדיקת המיקרו-מערך, אנזימים סטרואידים 3β-הידרוקסיסטרואידים דהידרוגנאז (מקודדים על ידי Hsd3b) ואנזים ביקוע שרשרת צד של כולסטרול (מקודד על ידי Cyp11a1) הועשרו בחלק החיובי. ואילו סמן התא סרטולי Sox9 (מקדם שעתוק תיבת SRY 9), וסמן תא הנבט Sycp3 (חלבון קומפלקס סינפטונמלי 3), הועשרו בחלק השלילי (איור 4). יחד, נתונים אלה הראו כי התמלילים בתאי Gli1+ נמשכו בהצלחה כלפי מטה והועשרו על ידי הפרוטוקול הנ"ל.
איור 1: תמונות אימונופלואורסצנטיות של ביטוי EGFP במודלים של עכברי NuTRAP. Gli1-CreERT2; NuTRAP וה-Shh-CreERT2; עכברי NuTRAP טופלו בטמוקסיפן כדי להפעיל את ביטוי ה-EGFP. באשכים, תאי Gli1+ היו באינטרסטיטיום, ואילו בבלוטת יותרת הכליה, תאי Gli1+ היו בקפסולת יותרת הכליה. בבלוטת יותרת הכליה, תאים מתחת לקפסולה היו חיוביים ל-SHH (תאי EGFP+ ב-Shh-CreERT2; עכברי NuTRAP). SHH הוא הליגנד של מסלול האיתות SHH אשר מעורר את תפקודו בתאים קפסולריים Gli1+ 13. סרגלי קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: איכות וכמות הרנ"א ממיצוי ה-TRAP. רנ"א של השבר החיובי, השבר השלילי והקלט הוערכו באמצעות ביואנליזה. החלק החיובי מכיל רנ"א המופק מחרוזי חלבון G לאחר הדגירה עם נוגדן GFP (שלב 4.1). החלק השלילי מכיל רנ"א שנשארים בסופר-נטנט בשלב 4.2. הקלט מכיל רנ"א מההומוגנט (שלב 3.3). באלקטרופרוגרמה, מכיוון שהריכוזים של הסמן התחתון (המוצג כשיא הראשון ב 20-25 שניות של זמן הנדידה של דגימות המוצגות על ציר X) והסולם (שאינו מוצג באלקטרופרוגרמות אלה) ידועים, ניתן לחשב את הריכוז של כל דגימה. שתי הפסגות העיקריות ב-40-50 שניות מייצגות את ה-18S וה-28S rRNA. היחס הריבוזומלי (המבוסס על עוצמת הפלואורסצנציה המוצגת על ציר Y) משמש לקביעת שלמות דגימת ה-RNA. מספר שלמות הרנ"א (RIN) של כל דגימה מוצג בפינה הימנית העליונה של כל חלקה. כל נקודה בחלקת הנקודה מייצגת את כמות הרנ"א שהופקה מאשך אחד בודד. כמות הרנ"א של כל דגימה בחלק השלילי והקלט הופקו מ-25 μL של דגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניתוח מיקרו-מערך עבור דגימות TRAP. תוצאות של שתי עקירות (אשך אחד כל אחת) מוצגות. ניתוח המיקרו-מערך זיהה מספר דומה של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי משני מיצויים בלתי תלויים (Testis A ו-Testis B). כ-4,000 גנים הועשרו (נקודות אדומות) בחלק החיובי, ואילו ~3,000 גנים הועשרו (נקודות ירוקות) בחלק השלילי. Hsd11b1 ו - Hsd3b6 הועשרו בשברים חיוביים. Dhh ו - Gstm6 הועשרו בשברים שליליים. רק גנים מעטים זוהו כגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין החלק השלילי לקלט, מה שמרמז על כך שהאשכים מכילים רק מספר קטן מאוד של תאי Gli1+ . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניתוח qPCR עבור דגימות TRAP. ניתוח qPCR הראה את הביטוי היחסי של גנים ספציפיים לסוג התא בחלק החיובי ובשבר השלילי. הביטוי של כל גן היה מנורמל לראשונה עם Actb. הביטויים היחסיים של גנים בתוך השבר החיובי חושבו לאחר מכן על סמך הביטוי של Sox9 (מוגדר כ-10). עבור השבר השלילי, Cyp11a1 (מוגדר כ- 10) שימש לנרמול הביטוי היחסי. שים לב שניתן להשוות את הביטוי היחסי של גני המטרה רק בתוך כל שבר. גנים המקודדים את האנזימים הסטרואידים (Hsd3b ו - Cyp11a1) הועשרו בחלק החיובי. ואילו גן הסמן לתאי נבט (Scyp3) ולתאי סרטולי (Sox9), הועשר בחלק השלילי. הוצגו שלושה שכפולים ביולוגיים (שלושה מיצויים עצמאיים, אשכים אחד כל אחד). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התועלת של ניתוח תעתיק רקמה שלמה יכולה להיות מעומעמת, במיוחד כאשר חוקרים רקמות הטרוגניות מורכבות. כיצד להשיג רנ"א ספציפי לסוג התא הופך לצורך דחוף לשחרר את טכניקת ה-RNA-seq רבת העוצמה. הבידוד של רנ"א ספציפיים לסוג התא מסתמך בדרך כלל על איסוף של סוג מסוים של תאים באמצעות מיקרומניפולציה, מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנט (FACS), או מיקרודיסקציה של לכידת לייזר (LCM)18. שיטות ומכשירים מודרניים אחרים לאיסוף תאים בודדים בתפוקה גבוהה פותחו גםהם 19. שיטות אלה משתמשות בדרך כלל בטכניקות המיקרופלואידיקה כדי לברקוד תאים בודדים ואחריהם RNA-seq חד-תאי. דיסוציאציה של תאים היא השלב הנדרש כדי להשיג את פתרון התא המושעה, אשר לאחר מכן יעבור דרך סדרן תאים או מכשיר מיקרופלואידי כדי לברקוד כל תא. שלב הדיסוציאציה של התא מציב אתגרים לשיטות אלה עבור מחקרים ספציפיים לסוג התא, משום שהטיפול האנזימטי לא רק מפרק רקמות אלא גם משפיע על כדאיות התא ועל פרופילי השעתוק20. יתר על כן, ההוצאה עבור RNA-seq חד-תאי היא בדרך כלל גבוהה ודורשת ציוד מיוחד באתר.
לאחרונה, שני מחקרים בודדו בהצלחה RNA/DNA של סוגי תאים ספציפיים מרקמות שלמות באמצעות עכברי NuTRAP 8,21. ללא שימוש בציוד ובכלים ספציפיים, מודל העכבר NuTRAP מאפשר קבלת רנ"א ודנ"א מסוגים ספציפיים של תאים. אלל NuTRAP יכול להתמקד בתאים המבטאים Cre ללא שלב הדיסוציאציה של התא, ובכך להימנע משינוי הכדאיות של התא ופרופילי השעתוק שלו. Rol et al. השתמשו במודל העכבר NuTRAP כדי לבודד גרעינים ולתרגם mRNA בו זמנית מרקמת שומן. המחקר השני גם הראה כי מודל העכבר NuTRAP יכול לעבוד עבור תאי גליה במערכת העצבים המרכזית8.
במעבדה שלנו, אנו מעוניינים לחקור את אוכלוסיות תאי הגזע ברקמות סטרואידוגניות כגון תאי ביניים Gli1+ באשכים22 ותאי Gli1+ קפסולריים בבלוטת יותרת הכליה 1 3. האתגר בחקר תאי Gli1+ בשני האיברים האלה הוא שמספר תאי Gli1+ באשכים ובבלוטת יותרת הכליה קטן. לדוגמה, חלקם של תאי Leydig, שהם האוכלוסייה העיקרית של תאי Gli1+ באשכים, תופסים רק כ -3.8% מנפח האשכים הכולל בעכברים בוגרים23. מכיוון שטכניקת TRAP שואפת למשוך באופן ספציפי למטה תרגום רנ"א הקשור לריבוזום ברקמה מורכבת, מודל העכבר NuTRAP יכול להיות כלי רב עוצמה המתאים לחקר אוכלוסיית תאים נדירים ברקמה מורכבת. הפרוטוקולים שפורסמו בעבר באמצעות עכברי NuTRAP מתמקדים באדיפוציטים ובתאי גליה שנמצאים בשפע רב יותר במוח וברקמת השומן בהשוואה לתאי Gli1+ באשכים ובבלוטת יותרת הכליה. כדי להבטיח קבלת רנ"א נדרשים ממספר קטן של תאים ברקמה מורכבת, שינינו את הפרוטוקולים הקיימים על ידי (1) הגדלת זמן הדגירה עם נוגדן GFP משעה אחת ללילה; (2) שימוש בסוג אחר של ערכת מיצוי RNA שמטרתה לבודד כמות קטנה של RNA ברמת פיקוגרמה.
הראינו שהפרוטוקול הזה יכול לקבל רנ"א איכותיים ספציפיים לסוג התא ממספר קטן של תאים ברקמה מורכבת. האיכות והכמות של רנ"א שחולצו מסוגלות עבור qPCR ושירות מיקרו-מערך מסחרי. תוצאות של מיקרו-מערך ו-qPCR אישרו כי גנים הקשורים לתאי Leydig מועשרים בחלק החיובי המגיע מאשך אחד. הפרוטוקול כאן מספק גישה מפורטת לבידוד mRNA ריבוזום ספציפי לסוג תא באמצעות מודל העכבר NuTRAP . פרוטוקול זה עשוי לשמש גם לבידוד רנ"א מכל התאים המבטאים EGFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי NIH R00HD082686. אנו מודים למלגת מחקר הקיץ של החברה האנדוקרינית ל- H.S.Z. אנו מודים גם לד"ר יואן קאנג על הרבייה והשמירה על מושבת העכברים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
