Summary
果蝇黑色素体 成年蝇已被广泛用作模型生物，以研究宿主抗菌先天免疫反应和微生物感染策略的分子机制。为了促进 D. melanogaster 幼虫阶段作为附加或替代模型系统，描述了幼虫注射技术。
Abstract
使用非常规模型来研究先天免疫力和病原体毒力为哺乳动物模型提供了一种有价值的替代方案，哺乳动物模型可能代价高昂并引发伦理问题。众所周知，非常规模型非常便宜，易于处理和文化，并且不占用太多空间。它们在基因上是可适应的，并且拥有完整的基因组序列，并且它们的使用没有道德考虑。例如，果蝇 果蝇黑色素胃蝇为各种行为，发育，新陈代谢和免疫研究提供了很好的见解。更具体地说， D. melanogaster 成年苍蝇和幼虫具有与脊椎动物共享的几种先天防御反应。调节免疫反应的机制主要通过 D. melanogaster 模型中的遗传和分子研究揭示出来。本文提供了一种新型幼虫注射技术，将进一步促进 对黑腹 股蓝虫幼虫先天免疫过程的研究，并探索多种微生物感染的发病机制。
Introduction
几十年来，黑腹果蝇在生物学和生物医学研究中得到了极大的应用，因为一系列复杂的遗传和分子工具已经稳步发展，用于分析广泛的研究1，2，3，4。黑色素瘤蚜虫发育、稳态和先天免疫的进化保守方面使其成为研究各种人类和昆虫疾病的宝贵模式生物5，6。值得注意的是，D. melanogaster模型在研究免疫力方面的基本作用在成年苍蝇研究中得到了很大的体现。然而，D. melanogaster幼虫的研究也为目前的知识做出了贡献，并主要探索了细胞免疫反应，特别是通过昆虫角质层发生的黄蜂和线虫感染7，8，9，10。黑果蝇幼虫拥有三种不同类型的血细胞，统称为血细胞：浆细胞，晶体细胞和薄片细胞11，12，13。当黑色素体幼虫感染细菌，真菌，病毒和寄生虫等病原体时，这些细胞可以产生一系列免疫反应14，15，16。细胞免疫应答包括小分子或细菌的直接吞没（吞噬作用），黑色化，较大病原体（如寄生虫卵）的包封，以及活性氧（ROS）和一氧化氮合成酶（NOS）的产生17，18，19。
相比之下，关于使用 D. melanogaster 幼虫模型分析体液免疫反应的研究较少。这主要是由于对 D. melanogaster 幼虫的口腔感染的喂养测定的应用以及与微注射幼虫相关的一些挑战，包括幼虫的精确处理和微针的正确使用，特别是在渗透期间20，21。因此，对幼虫感染的有限知识和技术困难（即高死亡率）经常使 D. melanogaster 幼虫模型难以使用。幼虫模型将有可能确定新的分子机制，这些机制将为宿主 - 病原体相互作用以及诱导针对致病性感染的特定宿主先天免疫反应提供进一步的见解。
这里详细描述了一种简单有效的方案，可用于向 D.黑色素食虫 幼虫注射各种病原体，例如细菌。特别是， D. melanogaster 幼虫用于注射人类病原体 Photorhabdus asymbiotica 和非致病性细菌 大肠杆菌。该方法可用于操作和分析 D. melanogaster对 各种微生物感染的免疫反应。
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Protocol
1. 苍蝇饲养
注意：D. melanogaster的生命周期分为四个阶段：胚胎，幼虫，蛹和成虫。在实验室中具有最佳饲养条件（~25°C，60%湿度和足够的食物）的生成时间约为从受精卵到关闭成虫的10天。雌性每天产下约100个胚胎，胚胎发生持续约24小时22。幼虫经历三个发育阶段（幼虫;L1-L3）在~4天内（L1和L2：24小时，L3：48小时）。第一龄幼虫立即开始在培养基表面进食。第二龄幼虫钻入培养基，而三龄幼虫离开培养基并沿着小瓶壁徘徊，寻找一个蛹24-48小时的地方。
- 将含有玉米粉-大豆饮食的干粮加入窄聚苯乙烯小瓶（25 mm x 95 mm）中，以 1/5 至 2/5 的体积。然后加入9毫升水，让小瓶静置1分钟，直到饮食完全水合。
- 向小瓶中加入约10粒干面包酵母，并放置至少20只新出现的雄性和雌性成年苍蝇的混合物。
- 将小瓶在25°C下以12：12小时的光：暗光周期循环孵育。
- 为确保生命周期进展，请每天检查苍蝇瓶并记录初始开发阶段。
2. 感染的幼虫选择
- 在感染进行当天达到游荡的第三龄阶段时，用精细画笔选择幼虫（骆驼的毛发最好）（图1）。
- 从原来的小瓶中取出后，用林格的溶液（100 mM NaCl，1.8 mM KCl，2 mM CaCl2，1 mM MgCl2，5 mM HEPES pH 6.9）洗涤选定的幼虫。
- 将幼虫放在滤纸（直径150毫米）上，滤纸上用大约5毫升的林格氏溶液在培养皿（100毫米x 15毫米）中稍微润湿（图2A）。
- 根据需要每天向滤纸中加入约1 mL Ringer's溶液，以避免干燥和幼虫干燥。
3. 细菌制备
- 在28°C的Luria Bertani（LB）琼脂培养基上培养 P. asymbiotica 细菌48小时。
- 使用生物安全2级柜转移单个菌落的 P. asymbiotica ，以在10mLLB培养基中接种液体培养物。
- 将 P. asymbiotica 液体培养物在28°C下在设置为220rpm的旋转振荡器中孵育过夜。
- 以类似的方式培养 大肠杆菌 ，但在琼脂培养基和液体培养物上进行初始生长，在37°C下孵育过夜。
- 将每个过夜的细菌培养物在13，000× g 和4°C下离心3分钟。
- 弃去上清液，用10毫升无菌PBS洗涤所得细菌沉淀三次。
- 再次离心沉淀在13，000× g 和4°C下3分钟。
- 使用分光光度计，用无菌PBS稀释每个沉淀，以将细菌浓度调节到无 形对半共生孢 子菌0.25和大 肠杆菌0.015的光密度（600nm），这相当于每个细菌制剂的每个幼虫100-300个菌落形成单位。
4. 注射器准备
- 使用3.5“玻璃毛细管和微量移液器拉拔器准备毛细管。设置仪器如下：热量：580;拉力： 143;速度： 25;延迟： 1;压力：500。
- 使用直锯齿状中点镊子打开玻璃毛细管，使其允许进行实验处理，同时对幼虫造成最小的损害（图2B）。为了在练习注射时优化此过程，请使用台盼蓝溶液（用PBS稀释0.4%至0.2%），以轻松跟踪注射时的泄漏和蓝色幼虫的存活。
- 使用塑料一次性20 mL注射器用皮下注射针（22 G，25 mm长）填充毛细血管。
- 设置纳升喷油器，将油从毛细管中喷出（图2C）。
- 用注射所需的细菌制剂填充毛细血管。从放置在副胶片上的液滴（约20μL）中取出溶液。在该协议中，注射了50.2 nL的两种细菌储备。
5. 幼虫注射
- 在手术前使用二氧化碳麻醉 D.黑色素加斯特 幼虫约2分钟。
- 将麻醉的幼虫轻轻转移到润湿在Ringer溶液中的滤纸上，准备在立体显微镜下注射。此时幼虫会昏昏欲睡或被动。
- 要注射幼虫，使用镊子在后端背侧施加用力（气管在后端明显，而在前端有黑色口器）（图2D）。
- 将针头水平插入幼虫的后端，靠近角质层。成功的注射不会导致从幼虫中泄漏注射溶液（图3）。
- 在拔出针头之前，取出用于对幼虫尾巴施加压力的镊子。如果不先取出，镊子可以迫使血液和/或肠道从伤口部位从幼虫中排出。
- 感染适当数量的幼虫以进行研究。在这个特定的方案中，为每个实验条件注射20个幼虫。
- 使用镊子，将注射的幼虫轻轻转移到培养皿（每个培养皿10个幼虫）或食物瓶（取决于实验目的）中的单独潮湿滤纸中，以便恢复。
- 将培养皿或食品瓶置于25°C的培养箱中。 如果幼虫保存在培养皿中，请根据需要添加林格溶液以防止干燥。
6. 记录生存/死亡率
- 根据设定的实验时间点记录死亡和活 的D. melanogaster 幼虫的数量。活幼虫将继续发育成蛹和成虫。
- 使用统计程序（如 Prism）输入原始生存/死亡率数据，使用对数秩（Mantel-Cox）检验对其进行分析，并以数字表示结果。
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Representative Results
如果操作正确，注射 D. melanogaster 幼虫显示出细菌特异性作用。在感染 无菌疟原 虫（ATCC43943株）、 大肠杆菌 （菌株K12）和PBS（图4）后的几个时间点收集生存数据。虽然 D. melanogaster 幼虫对 P. asymbiotica敏感，这会迅速损害生存，但注射 大肠杆菌 或PBS对照的幼虫表现出更长的存活率24，25，26。特别是，与感染了P . asymbiotica的幼虫相比，它们在注射后24小时表现出57%的存活率，而注射 大肠杆菌 的幼虫在同一时间点显示出85%的存活率。
图1：选择用于注射的 果蝇黑色素胃幼 虫。 黑 腹果蝇的生命周期，从卵子受精到成年，大约需要10天。在幼虫生长过程中，幼虫进食，直到准备好化蛹并变成成虫。为了注射实验的目的，选择离开培养基并在小瓶壁上游荡的三龄幼虫。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：果 蝇黑色素食虫 幼虫注射过程的描述。 （A）选择游荡的三龄幼虫，用林格氏溶液洗涤，并放置在培养皿中的滤纸上准备注射。（B）使用镊子，玻璃毛细管破裂以允许进行实验处理。（C）设置可编程纳升注射器，准备在立体显微镜下注射。（D）为了注射幼虫，使用镊子在幼虫尾巴的背侧施加压力。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：通过显微注射将细菌细胞递送到 果蝇黑色素胃幼 虫幼虫中的图示。 后端的背侧使用镊子稳定。然后，将毛细血管水平插入到幼虫的后端，靠近角质层。注射后，在小心地拔出毛细血管之前取出镊子，以防止血淋巴从伤口部位泄漏。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：注射致病性和非致病性细菌后果蝇幼虫的存活率。 向D. melanogaster的Oregon R幼虫注射了50.2 nL的Photorhabdus asymbiotica（ATCC43943），大肠杆菌（K12）或PBS。虽然PBS和大肠杆菌对照在生存率方面没有显着性，但P. asymbiotica注射迅速损害了苍蝇的存活。每条生存曲线由三项独立试验的测量结果组成，每项试验包括20只幼虫（*** p <0.001）。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
黑腹果蝇 是最有价值的实验操纵模型之一，用于研究各种微生物感染的先天免疫和发病机制。这是由于其简单而快速的生命周期，实验室中的简单维护，完善的进化遗传学和多样化的遗传工具箱。以前的 D. melanogaster 幼虫注射方法，例如使用混合微流体装置或Narishige显微操纵器，需要高度专业化的设备，并且可能很昂贵21，27。在目前的方案中，为了扩大 D. melanogaster的使用，概述了一种简单的注射技术，代表了一种将细菌输送到 D. melanogaster 幼虫的血小体内的有效和快速的方法。这里描述的技术的基本部分是使用显微注射器实际注射所需的病原体或其他液体物质。除了描述这种基本操作外，我们还描述了辅助方法，例如生长和培养细菌以及处理材料。
这种方法的主要优点是针头与幼虫大致平行，并且保持对幼虫的压力很小，从而减少了血栓泄漏，致命伤害或所需物质输送不足的可能性。然后将针头插入幼虫的后端以完成注射。握住幼虫的精确方式，插入针头的方式，注射所需物质的速度以及针头的抽取方向都是可以通过实践最好地改善的问题。要克服的最具挑战性的步骤是从幼虫中取出针头，而不会导致任何基本器官泄漏。但是，随着精确性和经验的提高，此步骤中遇到的困难会变小。
该技术也是多种应用中的出色工具，用于以统一的方式引入各种物质，可以重复多次，从而获得一致的结果。在 感染的P. asymbiotica幼虫中观察到的快速死亡率反映了这种细菌菌株对昆虫的高毒力24，25，26。 P. asymbiotica 在感染期间表达毒力基因有据可查，通过抑制血细胞迁移和吞噬作用来增加细菌对昆虫宿主的存活和致病性24，25。此外，幼虫对 大肠杆菌 的非致病性细菌菌株的注射以及PBS的注射具有抗性，从而证实了该研究领域的先前结果26。因此，显微注射不会对动物生存能力产生任何不利影响，从而允许其在分子和免疫学研究中用于探索各种微生物感染的发病机制。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢乔治华盛顿大学（GWU）生物科学系的成员对手稿的批判性阅读。GT通过GWU的Harlan夏季奖学金获得支持。所有图形图形都是使用BioRender制作的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes - plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
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