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Immunology and Infection

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा इंजेक्शन प्रोटोकॉल

Published: October 19, 2021 doi: 10.3791/63144
Automatic Translation
1, 1, 1
1Infection and Innate Immunity Laboratory, Department of Biological Sciences, Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University

Summary

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर वयस्क मक्खियों को बड़े पैमाने पर मॉडल जीवों के रूप में उपयोग किया गया है ताकि मेजबान रोगाणुरोधी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और माइक्रोबियल संक्रमण रणनीतियों के अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच की जा सके। एक अतिरिक्त या वैकल्पिक मॉडल प्रणाली के रूप में डी मेलानोगास्टर लार्वा चरण को बढ़ावा देने के लिए, एक लार्वा इंजेक्शन तकनीक का वर्णन किया गया है।

Abstract

जन्मजात प्रतिरक्षा और रोगज़नक़ विषाणु का अध्ययन करने के लिए अपरंपरागत मॉडल का उपयोग स्तनधारी मॉडल के लिए एक मूल्यवान विकल्प प्रदान करता है, जो महंगा हो सकता है और नैतिक मुद्दों को उठा सकता है। अपरंपरागत मॉडल कुख्यात रूप से सस्ते, संभालने और संस्कृति में आसान हैं, और बहुत अधिक जगह नहीं लेते हैं। वे आनुवंशिक रूप से अनुकूल हैं और पूर्ण जीनोम अनुक्रमों के अधिकारी हैं, और उनका उपयोग कोई नैतिक विचार प्रस्तुत नहीं करता है। फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, उदाहरण के लिए, व्यवहार, विकास, चयापचय और प्रतिरक्षा अनुसंधान की एक किस्म में महान अंतर्दृष्टि प्रदान की है। अधिक विशेष रूप से, डी मेलानोगास्टर वयस्क मक्खियों और लार्वा में कई जन्मजात रक्षा प्रतिक्रियाएं होती हैं जो कशेरुकी जानवरों के साथ साझा की जाती हैं। प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने वाले तंत्र ज्यादातर डी मेलानोगास्टर मॉडल में आनुवंशिक और आणविक अध्ययन के माध्यम से प्रकट हुए हैं। यहां एक उपन्यास लार्वा इंजेक्शन तकनीक प्रदान की जाती है, जो डी मेलानोगास्टर लार्वा में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं की जांच को बढ़ावा देगी और माइक्रोबियल संक्रमणों की एक विस्तृत श्रृंखला के रोगजनन का पता लगाएगी।

Introduction

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का कई दशकों से जैविक और जैव चिकित्सा अनुसंधान में अत्यधिक उपयोग किया गया है, क्योंकि आनुवंशिक और आणविक उपकरणों की परिष्कृत सरणी लगातार अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला के विश्लेषण के लिए विकसित हुई है1,2,3,4। विकास, होमियोस्टैसिस और डी मेलानोगास्टर में जन्मजात प्रतिरक्षा के विकासवादी रूप से संरक्षित पहलुओं ने इसे विभिन्न मानव और कीट रोगों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव बना दिया है5,6। विशेष रूप से, प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए डी मेलानोगास्टर मॉडल की मौलिक भूमिका को वयस्क मक्खियों के अध्ययन में काफी हद तक उदाहरण दिया गया है। हालांकि, डी मेलानोगास्टर लार्वा अध्ययनों ने वर्तमान ज्ञान में भी योगदान दिया है और मुख्य रूप से सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का पता लगाया है, विशेष रूप से ततैया और नेमाटोड संक्रमण के लिए जो कीट छल्ली 7,8,9,10 के माध्यम से होते हैं। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा में तीन अलग-अलग प्रकार की रक्त कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें सामूहिक रूप से हेमोसाइट्स कहा जाता है: प्लाज्माटोसाइट्स, क्रिस्टल कोशिकाएं और लैमेलोसाइट्स 11,12,13। ये कोशिकाएं प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की एक सरणी को माउंट कर सकती हैं जब डी मेलानोगास्टर लार्वा बैक्टीरिया, कवक, वायरस और परजीवी जैसे रोगजनकों से संक्रमित होते हैं14,15,16। सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में छोटे अणुओं या बैक्टीरिया के प्रत्यक्ष निगलने (फागोसाइटोसिस), मेलेनाइजेशन, परजीवी अंडे जैसे बड़े रोगजनकों के encapsulation, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (एनओएस) का उत्पादन 17,18,19 शामिल हैं।

इसके विपरीत, ह्यूमरस प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए डी मेलानोगास्टर लार्वा मॉडल के उपयोग पर कम अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं। यह मुख्य रूप से डी मेलानोगास्टर लार्वा के मौखिक संक्रमण के लिए फीडिंग एसेस के आवेदन के कारण है और लार्वा के सटीक हैंडलिंग और माइक्रोनीडल के उचित उपयोग सहित माइक्रोइंजेक्शन लार्वा से जुड़ी कई चुनौतियों के कारण है, विशेष रूप से प्रवेश के दौरान 20,21। इस प्रकार, लार्वा संक्रमण और तकनीकी कठिनाइयों (यानी, उच्च मृत्यु दर) के सीमित ज्ञान ने अक्सर डी मेलानोगास्टर लार्वा मॉडल का उपयोग करना मुश्किल बना दिया है। एक लार्वा मॉडल में उपन्यास आणविक तंत्र की पहचान करने की क्षमता होगी जो मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा और रोगजनक संक्रमणों के खिलाफ विशिष्ट मेजबान जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को शामिल करेगा।

यहां एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल जिसका उपयोग विभिन्न रोगजनकों, जैसे बैक्टीरिया के साथ डी मेलानोगास्टर लार्वा को इंजेक्ट करने के लिए किया जा सकता है, का विस्तार से वर्णन किया गया है। विशेष रूप से, डी मेलानोगास्टर लार्वा का उपयोग मानव रोगज़नक़ फोटोरहाब्डस सहजीवी और गैर-रोगजनक बैक्टीरिया एस्चेरिचिया कोलाई के साथ इंजेक्शन के लिए किया जाता है। इस विधि का उपयोग विभिन्न माइक्रोबियल संक्रमणों के लिए डी मेलानोगास्टर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के हेरफेर और विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. मक्खी पालन

नोट: डी मेलानोगास्टर जीवन चक्र को चार चरणों में विभाजित किया गया है: भ्रूण, लार्वा, प्यूपा और वयस्क। प्रयोगशाला में इष्टतम पालन की स्थिति के साथ पीढ़ी का समय (~ 25 डिग्री सेल्सियस, 60% आर्द्रता, और पर्याप्त भोजन) निषेचित अंडे से eclosed वयस्क तक लगभग 10 दिन है। मादाएं प्रति दिन ~ 100 भ्रूण रखती हैं, और भ्रूणजनन लगभग 24 h22 तक रहता है। लार्वा तीन विकासात्मक चरणों (instars) से गुजरते हैं; L1-L3) ~ 4 दिनों में (L1 और L2: 24 h, और L3: 48 h)। पहला इंस्टार लार्वा माध्यम की सतह पर तुरंत फ़ीड करना शुरू कर देता है। दूसरा इनस्टार लार्वा माध्यम में घुस जाता है, जबकि तीसरा इनस्टार लार्वा माध्यम को छोड़ देता है और शीशी की दीवारों को भटकता है, 24-48 घंटे के लिए प्यूपेरिएट करने के लिए एक जगह की तलाश में है। इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग की जाने वाली डी मेलानोगास्टर लाइन ओरेगन आर (FBsn0000276) है।

  1. एक संकीर्ण polystyrene शीशी (25 मिमी x 95 मिमी) के लिए एक cornmeal-सोया-आधारित आहार युक्त सूखे भोजन जोड़ें aboue करने के लिए 1/5 से 2/5 मात्रा. फिर 9 मिलीलीटर पानी जोड़ें और शीशी को 1 मिनट तक बैठने की अनुमति दें जब तक कि आहार पूरी तरह से हाइड्रेट न हो जाए।
  2. शीशी में सूखे बेकर के खमीर के लगभग 10 दानों को जोड़ें और कम से कम 20 नए उभरे हुए नर और मादा वयस्क मक्खियों का मिश्रण रखें।
  3. एक 12:12-h प्रकाश पर 25 डिग्री सेल्सियस पर शीशी incubate: अंधेरे photoperiodic चक्र.
  4. जीवन चक्र की प्रगति सुनिश्चित करने के लिए, दैनिक फ्लाई शीशियों की जांच करें और प्रारंभिक विकास चरणों को रिकॉर्ड करें।

2. संक्रमण के लिए लार्वा चयन

  1. एक ठीक पेंटब्रश (ऊंट के बाल सबसे अच्छे हैं) के साथ लार्वा का चयन करें एक बार जब वे उस दिन भटकने वाले तीसरे इनस्टार चरण तक पहुंच जाते हैं जिस दिन संक्रमण किया जाएगा (चित्रा 1)।
  2. रिंगर के समाधान (100 mM NaCl, 1.8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6.9) के साथ चयनित लार्वा को एक छोटे से पेट्री डिश (60 मिमी x 15 मिमी) में उनके मूल शीशी से हटाने पर धोएं।
  3. फिल्टर पेपर (150 मिमी व्यास) पर लार्वा रखें जो पेट्री डिश (100 मिमी x 15 मिमी) (चित्रा 2 ए) में रिंगर के समाधान के लगभग 5 मिलीलीटर के साथ थोड़ा नम है।
  4. ड्रायनेस और लार्वा desication से बचने के लिए आवश्यक के रूप में फिल्टर पेपर के लिए दैनिक रिंगर के समाधान के ~ 1 एमएल जोड़ें।

3. बैक्टीरियल तैयारी

  1. संस्कृति पी. Asymbiotica बैक्टीरिया पर लुरिया Bertani (एलबी) आगर मीडिया पर 28 डिग्री सेल्सियस पर 48 ज के लिए.
  2. एलबी मीडिया के 10 मिलीलीटर में एक तरल संस्कृति को टीका लगाने के लिए पी एसिम्बायोटिका की एक एकल कॉलोनी को स्थानांतरित करने के लिए एक जैव सुरक्षा स्तर 2 कैबिनेट का उपयोग करें।
  3. एक रोटरी शेकर 220 आरपीएम पर सेट में 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पी एसिम्बायोटिका तरल संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  4. संस्कृति ई कोलाई बैक्टीरिया एक समान फैशन में, लेकिन आगर मीडिया और तरल संस्कृति पर प्रारंभिक विकास को अंजाम देते हैं इनक्यूबेशन रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  5. 13,000 x g और 4 °C पर 3 मिनट के लिए प्रत्येक रात भर की जीवाणु संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. supernatant त्यागें और बाँझ PBS के 10 मिलीलीटर के साथ तीन बार परिणामी जीवाणु छर्रों धो.
  7. 13,000 x g और 4 °C पर 3 मिनट के लिए फिर से छर्रों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. पी. एसिम्बायोटिका के लिए 0.25 के ऑप्टिकल घनत्व (600 एनएम) और ई कोलाई के लिए 0.015 के ऑप्टिकल घनत्व (600 एनएम) में जीवाणु सांद्रता को समायोजित करने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ प्रत्येक गोली को पतला करें, जो एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक जीवाणु तैयारी के प्रति लार्वा 100-300 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों के अनुरूप है।

4. इंजेक्टर तैयारी

  1. 3.5 "ग्लास केशिका ट्यूबों और एक माइक्रोपिपेट खींचने का उपयोग करके केशिकाओं को तैयार करें। उपकरण को निम्नानुसार सेट करें: गर्मी: 580; पुल: 143; वेग: 25; देरी: 1; दबाव: 500.
  2. कांच केशिका को उस डिग्री तक खोलने के लिए सीधे दांतेदार मध्यम बिंदु संदंश का उपयोग करें जो लार्वा को कम से कम नुकसान पहुंचाते हुए प्रयोगात्मक उपचारों के वितरण की अनुमति देगा (चित्रा 2 बी)। इंजेक्शन का अभ्यास करते समय इस प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए, ट्रिपैन ब्लू समाधान का उपयोग करें (पीबीएस के साथ स्टॉक 0.4% को 0.2% तक पतला करें) इंजेक्ट करते समय आसानी से रिसाव को ट्रैक करने के लिए और नीले लार्वा के अस्तित्व को ट्रैक करने के लिए।
  3. एक प्लास्टिक का उपयोग करके खनिज तेल के साथ केशिका को भरें, एक हाइपोडर्मिक सुई (22 जी, 25 मिमी लंबाई) के साथ डिस्पोजेबल 20 एमएल सिरिंज।
  4. नैनोलीटर इंजेक्टर सेट करें और तेल को केशिका से बाहर निकालें (चित्रा 2 सी)।
  5. इंजेक्शन के लिए वांछित जीवाणु तैयारी के साथ केशिका भरें। एक बूंद (~ 20 μL) है कि parafilm पर रखा जाता है से समाधान ले लो. इस प्रोटोकॉल में, दो जीवाणु स्टॉक के 50.2 एनएल को इंजेक्ट किया गया था।

5. लार्वा इंजेक्शन

  1. प्रक्रिया से पहले ~ 2 मिनट के लिए कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग करके डी मेलानोगास्टर लार्वा को एनेस्थेटिक करें।
  2. धीरे से एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत इंजेक्शन की तैयारी में रिंगर के समाधान में नम एक फिल्टर पेपर के लिए anesthetized लार्वा हस्तांतरण। लार्वा इस बिंदु पर सुस्त या निष्क्रिय होगा।
  3. लार्वा इंजेक्ट करने के लिए, पीछे के छोर के पृष्ठीय पक्ष पर फर्म दबाव लागू करें (श्वासनली के स्पिरकल पूर्वकाल के अंत में पीछे के छोर बनाम काले मुंह के हिस्सों में स्पष्ट होते हैं) संदंश (चित्रा 2 डी) का उपयोग करके।
  4. सुई को क्षैतिज रूप से लार्वा के पीछे के छोर की ओर, छल्ली के पास डालें। एक सफल इंजेक्शन लार्वा से इंजेक्ट किए गए समाधान के रिसाव में परिणाम नहीं होगा (चित्रा 3)।
  5. सुई को वापस लेने से पहले लार्वा की पूंछ पर दबाव लागू करने के लिए उपयोग किए जाने वाले संदंश को हटा दें। यदि पहले नहीं हटाया जाता है, तो संदंश हेमोलिम्फ और / या आंत को घाव स्थल से लार्वा से बाहर करने के लिए मजबूर कर सकते हैं।
  6. किए जा रहे अध्ययन के लिए लार्वा की उचित संख्या को संक्रमित करें। इस विशेष प्रोटोकॉल में, प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए 20 लार्वा इंजेक्ट किए गए थे।
  7. संदंश का उपयोग करते हुए, धीरे से इंजेक्शन लार्वा को पेट्री डिश (प्रति डिश 10 लार्वा) या एक खाद्य शीशी (प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर) में एक अलग नम फिल्टर पेपर में स्थानांतरित करें ताकि वसूली की अनुमति मिल सके।
  8. पेट्री व्यंजन या भोजन शीशियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें। यदि लार्वा को पेट्री डिश में रखा जाता है, तो निर्जलीकरण को रोकने के लिए आवश्यक के रूप में रिंगर के समाधान को जोड़ें।

6. रिकॉर्डिंग उत्तरजीविता /

  1. निर्धारित प्रयोगात्मक समय बिंदुओं के अनुसार मृत और जीवित डी मेलानोगास्टर लार्वा की संख्या रिकॉर्ड करें। जीवित लार्वा प्यूपे और वयस्कों में विकसित करना जारी रखेगा।
  2. कच्चे उत्तरजीविता / मृत्यु दर डेटा दर्ज करने के लिए प्रिज्म जैसे सांख्यिकीय कार्यक्रमों का उपयोग करें, लॉग-रैंक (मैंटेल-कॉक्स) परीक्षण के साथ उनका विश्लेषण करें, और आंकड़ों में परिणामों का प्रतिनिधित्व करें।

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Representative Results

जब सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, तो डी मेलानोगास्टर लार्वा के इंजेक्शन एक जीवाणु-विशिष्ट प्रभाव दिखाते हैं। उत्तरजीविता डेटा पी. एसिम्बायोबायोटिका (तनाव ATCC43943), ई. कोलाई (तनाव K12), और PBS (चित्रा 4) के संक्रमण के बाद कई समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए थे। जबकि डी मेलानोगास्टर लार्वा पी एसिम्बायोटिका के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, जो तेजी से अस्तित्व से समझौता करता है, ई कोलाई या पीबीएस नियंत्रण के साथ इंजेक्ट किए गए लार्वा लंबे समय तक जीवित रहने का प्रदर्शन करते हैं24,25,26। विशेष रूप से, पी एसिम्बायोटिका से संक्रमित लार्वा की तुलना में, जो इंजेक्शन के बाद 24 घंटे में 57% जीवित रहने की दर प्रदर्शित करता है, ई कोलाई के साथ इंजेक्ट किए गए लार्वा एक ही समय में 85% जीवित रहने की दर दिखाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: इंजेक्शन के लिए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा का चयन। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का जीवन चक्र, अंडे के निषेचन से लेकर वयस्क जीवन तक, लगभग 10 दिनों तक लेता है। लार्वा विकास के दौरान, लार्वा तब तक फ़ीड करते हैं जब तक कि वयस्कों को प्यूपेट करने और बदलने के लिए तैयार न हो जाए। इंजेक्शन प्रयोगों के उद्देश्य के लिए, तीसरे इंस्टार लार्वा, जो संस्कृति माध्यम को छोड़ देते हैं और शीशी की दीवारों को भटकते हैं, का चयन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा इंजेक्शन प्रक्रिया का चित्रण। (ए) भटकने वाले तीसरे इनस्टार लार्वा का चयन किया जाता है, रिंगर के समाधान के साथ धोया जाता है, और इंजेक्शन की तैयारी में पेट्री डिश में फिल्टर पेपर पर रखा जाता है। (बी) संदंश का उपयोग करके, प्रयोगात्मक उपचारों के वितरण की अनुमति देने के लिए कांच की केशिका को तोड़ दिया जाता है। (C) प्रोग्रामेबल नैनोलीटर इंजेक्टर को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत इंजेक्शन की तैयारी में स्थापित किया जाता है। (डी) लार्वा इंजेक्ट करने के लिए, संदंश का उपयोग करके लार्वा की पूंछ के पृष्ठीय पक्ष पर दबाव लागू किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा में जीवाणु कोशिकाओं को वितरित करने का चित्रण। पश्चवर्ती छोर के पृष्ठीय पक्ष को संदंश का उपयोग करके स्थिर किया जाता है। फिर, केशिका को क्षैतिज रूप से लार्वा के पीछे के छोर की ओर, छल्ली के पास डाला जाता है। इंजेक्शन के बाद, घाव स्थल से हेमोलिम्फ रिसाव को रोकने के लिए केशिका को सावधानीपूर्वक वापस लेने से पहले संदंश को हटा दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: रोगजनक और गैर-रोगजनक बैक्टीरिया के इंजेक्शन के बाद ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा का अस्तित्व। डी मेलानोगास्टर के ओरेगन आर लार्वा को फोटोरहाब्डस सहजीवी (ATCC43943), एस्चेरिचिया कोलाई (K12), या पीबीएस के 50.2 एनएल के साथ इंजेक्ट किया गया था। जबकि पीबीएस और ई कोलाई नियंत्रण ने अस्तित्व के अनुपात में कोई महत्व नहीं दिखाया, पी एसिम्बायोटिका इंजेक्शन ने तेजी से मक्खी के अस्तित्व से समझौता किया। प्रत्येक उत्तरजीविता वक्र में तीन स्वतंत्र परीक्षणों से माप शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक में 20 लार्वा (*** पी < 0.001) शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर सबसे मूल्यवान, प्रयोगात्मक रूप से हेरफेर किए गए मॉडलों में से एक है जो विभिन्न माइक्रोबियल संक्रमणों के जन्मजात प्रतिरक्षा और रोगजनन की जांच के लिए उपयोग किया जाता है। यह अपने सरल और तेज जीवन चक्र, एक प्रयोगशाला में सरल रखरखाव, अच्छी तरह से स्थापित विकासवादी आनुवांशिकी और विविध आनुवंशिक टूलबॉक्स के कारण है। डी मेलानोगास्टर लार्वा इंजेक्शन के पिछले तरीके, जैसे कि हाइब्रिड माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस या एक Narishige माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करना, अत्यधिक विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता होती है और महंगा हो सकता है21,27। वर्तमान प्रोटोकॉल में, डी मेलानोगास्टर के उपयोग का विस्तार करने के लिए, एक सरल इंजेक्शन तकनीक जो डी मेलानोगास्टर लार्वा के हेमोकोइल में बैक्टीरिया को वितरित करने के लिए एक कुशल और तेजी से विधि का प्रतिनिधित्व करती है, को रेखांकित किया गया है। यहां वर्णित तकनीक का आवश्यक हिस्सा एक माइक्रोइंजेक्टर का उपयोग करके वांछित रोगज़नक़ या अन्य तरल पदार्थों का वास्तविक इंजेक्शन है। इस आवश्यक ऑपरेशन का वर्णन करने के अलावा, हम बैक्टीरिया को उगाने और संवर्धित करने और सामग्री से निपटने जैसे सहायक तरीकों का भी वर्णन करते हैं।

इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि सुई को लार्वा के लगभग समानांतर रखा जाता है, और होल्डिंग को लार्वा पर बहुत कम दबाव के साथ किया जाता है, इस प्रकार हेमोलिम्फ रिसाव, घातक चोट, या वांछित पदार्थ के अपर्याप्त वितरण की संभावना को कम किया जाता है। फिर इंजेक्शन को पूरा करने के लिए सुई को लार्वा के पीछे के छोर की ओर डाला जाता है। लार्वा को पकड़ने का सटीक तरीका, सुई डालने का तरीका, जिस गति से वांछित पदार्थ इंजेक्ट किया जाता है, और सुई की वापसी की दिशा सभी ऐसे मामले हैं जिन्हें अभ्यास द्वारा सबसे अच्छा सुधारा जा सकता है। दूर करने के लिए सबसे चुनौतीपूर्ण कदम आवश्यक अंगों के किसी भी परिणामी रिसाव के बिना लार्वा से सुई को वापस लेना है। हालांकि, सटीकता और अनुभव के साथ, इस चरण के दौरान आने वाली कठिनाई कम हो जाती है।

यह तकनीक एक समान तरीके से विभिन्न प्रकार के पदार्थों को पेश करने के लिए कई अनुप्रयोगों में एक उत्कृष्ट उपकरण भी है जिसे कई बार दोहराया जा सकता है, इस प्रकार लगातार परिणामों की अनुमति देता है। पी. सहजीवी-संक्रमित लार्वा में देखी गई तेजी से मृत्यु दर कीटों के लिए इस जीवाणु तनाव के उच्च विषाणु को दर्शाती है24,25,26। पी. एसिम्बायोटिका संक्रमण के दौरान वायरस जीन को व्यक्त करने के लिए अच्छी तरह से प्रलेखित है जो हेमोसाइट माइग्रेशन और फागोसाइटोसिस 24,25 को रोककर कीट मेजबानों के खिलाफ जीवाणु अस्तित्व और रोगजनकता को बढ़ाता है। इसके अलावा, लार्वा ई कोलाई के गैर-रोगजनक जीवाणु उपभेदों के साथ-साथ पीबीएस के साथ इंजेक्शन के लिए प्रतिरोधी हैं, इस प्रकार इस शोध क्षेत्र 26 में पिछले परिणामों की पुष्टि करते हैं। इसलिए, माइक्रोइंजेक्शन पशु व्यवहार्यता पर किसी भी प्रतिकूल प्रभाव के बिना प्राप्त किया जाता है, जिससे आणविक और प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययनों में इसके उपयोग को माइक्रोबियल संक्रमणों की एक विस्तृत श्रृंखला के रोगजनन का पता लगाने की अनुमति मिलती है।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय (GWU) में जैविक विज्ञान विभाग के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। जीटी को जीडब्ल्यूयू से हारलान ग्रीष्मकालीन फैलोशिप के माध्यम से समर्थित किया गया था। सभी ग्राफिकल आंकड़े BioRender का उपयोग करके बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fly Food B (Bloomington Recipe) LabExpress 7001-NV Food B, in narrow vials, 100 vials/tray
100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable VWR 25384-342 Diameter 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable VWR 25384-092 Diameter 60 x 15 mm
Glass capillaries VWR 53440-186
Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle VWR 28450-150 Diameter 150 mm
Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet ESCO LA2-4A2-E
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500 LB agar miller powder 500 g
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500 LB broth miller powder 500 g
Mineral oil Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific 31911-A1
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000C
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond 3-000-207
Narrow Drosophila Vials, Polystyrene Genesee Scientific 32-109
Needles, hypodermic VWR 89219-316 22 G, 25 mm
Next Generation Micropipette Puller World Precision Instruments SU-P1000
PBS VWR 97062-732 Buffer PBS tablets biotech grade 200tab
Prism GraphPad Version 8
Syringes - plastic, disposable VWR 76124-652 20 mL
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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