Summary
Drosophila melanogaster voksne fluer er blevet flittigt brugt som modelorganismer til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger til grund for værts antimikrobielle medfødte immunresponser og mikrobielle infektionsstrategier. For at fremme D. melanogaster larvestadiet som et yderligere eller alternativt modelsystem beskrives en larveinjektionsteknik.
Abstract
Brugen af ukonventionelle modeller til at studere medfødt immunitet og patogen virulens giver et værdifuldt alternativ til pattedyrsmodeller, som kan være dyre og rejse etiske spørgsmål. Ukonventionelle modeller er notorisk billige, nemme at håndtere og kultur og tager ikke meget plads. De er genetisk modtagelige og besidder komplette genomsekvenser, og deres anvendelse giver ingen etiske overvejelser. Bananfluen Drosophila melanogaster har for eksempel givet stor indsigt i en række adfærd, udvikling, stofskifte og immunitetsforskning. Mere specifikt har D. melanogaster voksne fluer og larver flere medfødte forsvarsreaktioner, der deles med hvirveldyr. De mekanismer, der regulerer immunresponser, er for det meste blevet afsløret gennem genetiske og molekylære undersøgelser i D. melanogaster-modellen . Her tilvejebringes en ny larveinjektionsteknik, som yderligere vil fremme undersøgelser af medfødte immunprocesser i D. melanogasterlarver og udforske patogenesen af en lang række mikrobielle infektioner.
Introduction
Drosophila melanogaster er blevet enormt udnyttet i biologisk og biomedicinsk forskning i flere årtier, da det sofistikerede udvalg af genetiske og molekylære værktøjer støt har udviklet sig til analyse af en bred vifte af undersøgelser1,2,3,4. De evolutionært bevarede aspekter af udvikling, homeostase og medfødt immunitet i D. melanogaster har gjort det til en værdifuld modelorganisme til at studere forskellige sygdomme hos mennesker og insekter5,6. Især er den grundlæggende rolle, som D. melanogaster-modellen spiller for at studere immunitet, stort set blevet eksemplificeret i voksne fluestudier. D. melanogaster larver undersøgelser har imidlertid også bidraget til den nuværende viden og hovedsageligt udforsket cellulære immunresponser, specifikt for hvepse- og nematodeinfektioner, der forekommer gennem insektets kutikle7,8,9,10. Drosophila melanogaster larver besidder tre forskellige typer blodlegemer, samlet kaldet hæmocytter: plasmatocytter, krystalceller og lamellocytter11,12,13. Disse celler kan montere en række immunresponser, når D. melanogaster larver er inficeret med patogener som bakterier, svampe, vira og parasitter14,15,16. Cellulære immunresponser omfatter direkte opslugning (fagocytose) af små molekyler eller bakterier, melanisering, indkapsling af større patogener såsom parasitoide æg og produktion af reaktive iltarter (ROS) og nitrogenoxidsyntaser (NOS) 17,18,19.
I modsætning hertil er der offentliggjort færre undersøgelser om brugen af D. melanogaster larvemodellen til at analysere humorale immunresponser. Dette skyldes hovedsagelig anvendelsen af fodringsassays til oral infektion af D. melanogasterlarver og flere udfordringer forbundet med mikroinjektion af larver, herunder præcis håndtering af larver og korrekt brug af mikronålen, især under penetration20,21. Således har den begrænsede viden om larveinfektion og tekniske vanskeligheder (dvs. høj dødelighed) ofte gjort D. melanogaster larvemodellen vanskelig at bruge. En larvemodel vil have potentiale til at identificere nye molekylære mekanismer, der vil give yderligere indsigt i værtspatogeninteraktioner og induktion af specifikke værts medfødte immunresponser mod patogene infektioner.
Her beskrives en enkel og effektiv protokol, der kan bruges til at injicere D. melanogaster larver med forskellige patogener, såsom bakterier, detaljeret. Især anvendes D. melanogaster larver til injektioner med det humane patogen Photorhabdus asymbiotica og de ikke-patogene bakterier Escherichia coli. Denne metode kan anvendes til manipulation og analyse af D. melanogasters immunrespons på forskellige mikrobielle infektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Flueopdræt
BEMÆRK: D. melanogaster livscyklus er opdelt i fire faser: embryo, larve, puppe og voksen. Produktionstiden med optimale opdrætsforhold i laboratoriet (~ 25 ° C, 60% fugtighed og tilstrækkelig mad) er ca. 10 dage fra befrugtet æg til lukket voksen. Kvinder lægger ~ 100 embryoner om dagen, og embryogenese varer ca. 24 h22. Larverne gennemgår tre udviklingsstadier (instars; L1-L3) på ~4 dage (L1 og L2: 24 timer og L3: 48 timer). De første instar larver begynder at fodre straks på overfladen af mediet. Anden instar larver graver ind i mediet, mens tredje instar larver forlader mediet og vandrer op ad hætteglasvæggene og leder efter et sted at pupariere i 24-48 timer. D. melanogaster-linjen , der bruges til denne protokol, er Oregon R (FBsn0000276).
- Tilsæt tørfoder indeholdende en majsmel-sojabaseret diæt til et smalt polystyrenhætteglas (25 mm x 95 mm) til aboue 1/5 til 2/5 volumen. Tilsæt derefter 9 ml vand og lad hætteglasset sidde i 1 minut, indtil kosten er helt hydreret.
- Tilsæt ca. 10 granulater tør bagergær til hætteglasset og læg en blanding af mindst 20 nyligt fremkomne mandlige og kvindelige voksne fluer.
- Inkuber hætteglasset ved 25 °C på et lys på 12:12 timer: mørk fotoperiodisk cyklus.
- For at sikre livscyklusprogression skal du kontrollere fluehætteglassene dagligt og registrere de indledende udviklingsfaser.
2. Larver udvælgelse til infektion
- Vælg larver med en fin pensel (kamelhår er bedst), når de når det vandrende tredje instar-stadium den dag, infektionen udføres (figur 1).
- De udvalgte larver vaskes med Ringers opløsning (100 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6,9) i en lille petriskål (60 mm x 15 mm) ved fjernelse fra deres oprindelige hætteglas23.
- Læg larverne på filterpapir (150 mm i diameter), der er let fugtet med ca. 5 ml Ringers opløsning i en petriskål (100 mm x 15 mm) (figur 2A).
- Tilsæt ~ 1 ml Ringers opløsning dagligt til filterpapiret efter behov for at undgå tørhed og larveaftørring.
3. Bakteriel forberedelse
- Kultur P. asymbiotica bakterier på Luria Bertani (LB) agar media ved 28 °C i 48 timer.
- Brug et biosikkerhedsniveau 2-kabinet til at overføre en enkelt koloni af P. asymbiotica til at inokulere en flydende kultur i 10 ml LB-medier.
- Inkuber P. asymbiotica væskekulturen natten over ved 28 °C i en roterende ryster, der er indstillet til 220 o / min.
- Kultur E. coli-bakterier på en lignende måde, men udfører den indledende vækst på agarmedier og inkubation af flydende kultur ved 37 ° C natten over.
- Centrifugering af hver bakteriekultur natten over i 3 minutter ved 13.000 x g og 4 °C.
- Kassér supernatanten og vask de resulterende bakteriepiller tre gange med 10 ml steril PBS.
- Centrifugering af pellets igen i 3 minutter ved 13.000 x g og 4 °C.
- Fortynd hver pellet med steril PBS for at justere bakteriekoncentrationerne til den optiske densitet (600 nm) på 0,25 for P. asymbiotica og 0,015 for E. coli, hvilket svarer til 100-300 kolonidannende enheder pr. larve af hvert bakteriepræparat ved hjælp af et spektrofotometer.
4. Forberedelse af injektor
- Forbered kapillærer ved hjælp af 3,5" kapillarrør i glas og en mikropipettetrækker. Indstil instrumentet som følger: varme: 580; træk: 143; hastighed: 25; forsinkelse: 1; tryk: 500.
- Brug lige savtakkede mellempunktstrang til at åbne glaskapillæren i en grad, der gør det muligt at levere de eksperimentelle behandlinger, samtidig med at larverne forårsager minimal skade (figur 2B). For at optimere denne procedure, mens du praktiserer injektioner, skal du bruge Trypan Blue-opløsning (fortynd bestanden 0,4% med PBS til 0,2%) for let at spore lækage under injektion og overlevelsen af de blå larver.
- Fyld kapillæren med mineralolie ved hjælp af en plastik, engangs sprøjte på 20 ml med en hypodermisk nål (22 G, 25 mm længde).
- Sæt nanoliterinjektoren op, og skub olien ud af kapillæren (figur 2C).
- Fyld kapillæren med det ønskede bakteriepræparat til injektion. Tag opløsningen fra en dråbe (~ 20 μL), der er anbragt på parafilm. I denne protokol blev 50,2 nL af to bakteriebestande injiceret.
5. Injektion af larver
- Anæstesi D. melanogaster larver ved hjælp af kuldioxid i ~ 2 minutter før proceduren.
- Overfør forsigtigt de bedæstede larver til et filterpapir fugtet i Ringers opløsning som forberedelse til injektion under et stereomikroskop. Larverne vil være sløve eller passive på dette tidspunkt.
- For at injicere larver skal du anvende et fast tryk på den dorsale side af den bageste ende (trakeale spirakler er tydelige i den bageste ende versus sorte munddele i den forreste ende) ved hjælp af tang (figur 2D).
- Indsæt nålen vandret mod larvernes bageste ende nær neglebåndet. En vellykket injektion vil ikke resultere i en lækage af den injicerede opløsning fra larverne (figur 3).
- Fjern tangen, der blev brugt til at lægge pres på larvernes hale, før nålen trækkes tilbage. Hvis tangen ikke fjernes først, kan den tvinge hæmolymfe og/eller tarmen ud af larverne fra sårstedet.
- Inficere det passende antal larver til den undersøgelse, der udføres. I denne særlige protokol blev 20 larver for hver eksperimentel tilstand injiceret.
- Brug tang til forsigtigt at overføre de injicerede larver til et separat fugtigt filterpapir i en petriskål (10 larver pr. Skål) eller et madhætteglas (afhængigt af formålet med eksperimentet) for at muliggøre genopretning.
- Anbring petriskålene eller madhætteglassene i en inkubator ved 25 °C. Hvis larver opbevares i en petriskål, tilsættes Ringers opløsning efter behov for at forhindre udtørring.
6. Registrering af overlevelse / dødelighed
- Optag antallet af døde og levende D. melanogaster larver i henhold til de indstillede eksperimentelle tidspunkter. Levende larver vil fortsætte med at udvikle sig til pupper og voksne.
- Brug statistiske programmer, såsom Prisme, til at indtaste de rå overlevelses- / dødelighedsdata, analysere dem med log-rank (Mantel-Cox) -testen og repræsentere resultaterne i tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når de udføres korrekt, viser injektioner af D. melanogaster larver en bakteriespecifik virkning. Overlevelsesdataene blev indsamlet på flere tidspunkter efter infektioner af P. asymbiotica (stamme ATCC43943), E. coli (stamme K12) og PBS (figur 4). Mens D. melanogaster larver er modtagelige for P. asymbiotica, hvilket kompromitterer overlevelsen hurtigt, udviser larver injiceret med E. coli eller PBS-kontroller langvarige overlevelser24,25,26. Især i sammenligning med larver inficeret med P. asymbiotica, som udviser en overlevelsesrate på 57% 24 timer efter injektion, viser larver injiceret med E. coli en overlevelsesrate på 85% på samme tidspunkt.
Figur 1: Udvælgelse af Drosophila melanogaster larver til injektion. Livscyklussen for Drosophila melanogaster, fra ægbefrugtning til voksenlivet, tager cirka 10 dage. Under larvevækst fodrer larver, indtil de er klar til at forpuppe sig og skifte til voksne. Med henblik på injektionsforsøg vælges tredje instar larver, der forlader kulturmediet og vandrer op ad hætteglassets vægge. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Afbildning af Drosophila melanogaster larveinjektionsprocedure. (A) Vandrende tredje instar larver udvælges, vaskes med Ringers opløsning og anbringes på filterpapir i en petriskål som forberedelse til injektion. (B) Ved hjælp af tang brydes glaskapillæren for at muliggøre levering af de eksperimentelle behandlinger. (C) Den programmerbare nanoliterinjektor er opstillet som forberedelse til injektion under et stereomikroskop. (D) For at injicere larver påføres tryk på den dorsale side af larvernes hale ved hjælp af tang. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Illustration af levering af bakterieceller til Drosophila melanogaster larver gennem mikroinjektion. Den dorsale side af den bageste ende stabiliseres ved hjælp af tang. Derefter indsættes kapillæren vandret mod larvernes bageste ende nær neglebåndet. Efter injektionen fjernes tangen, inden kapillæren forsigtigt trækkes tilbage for at forhindre hæmolymfelækage fra sårstedet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Overlevelse af Drosophila melanogaster larver efter injektion af patogene og ikke-patogene bakterier. Oregon R larver af D. melanogaster blev injiceret med 50,2 nL Photorhabdus asymbiotica (ATCC43943), Escherichia coli (K12) eller PBS. Mens PBS- og E. coli-kontroller ikke viste nogen betydning i overlevelsesforhold, kompromitterede P. asymbiotica-injektioner flueoverlevelsen hurtigt. Hver overlevelseskurve består af målinger fra tre uafhængige forsøg, der hver omfatter 20 larver (*** p < 0,001). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila melanogaster er blandt de mest værdifulde, eksperimentelt manipulerede modeller, der anvendes til undersøgelser af medfødt immunitet og patogenese af forskellige mikrobielle infektioner. Dette skyldes dets enkle og hurtige livscyklus, enkel vedligeholdelse i et laboratorium, veletableret evolutionær genetik og forskelligartet genetisk værktøjskasse. Tidligere metoder til D. melanogaster larver injektioner, såsom at bruge en hybrid mikrofluidisk enhed eller en Narishige micromanipulator, kræver højt specialiseret udstyr og kan være dyrt21,27. I den nuværende protokol, for at udvide brugen af D. melanogaster, er en simpel injektionsteknik, der repræsenterer en effektiv og hurtig metode til at levere bakterier i hæmocoel af D. melanogaster larver skitseret. Den væsentlige del af teknikken beskrevet her er den faktiske injektion af det ønskede patogen eller andre flydende stoffer ved anvendelse af en mikroinjektor. Ud over at beskrive denne essentielle operation beskriver vi også tilbehørsmetoder som dyrkning og dyrkning af bakterier og håndtering af materialer.
Den væsentligste fordel ved denne metode er, at nålen holdes omtrent parallelt med larven, og bedriften udføres med meget lidt tryk på larven, hvilket reducerer muligheden for hæmolymfelækage, dødelig skade eller utilstrækkelig levering af det ønskede stof. Nålen indsættes derefter mod den bageste ende af larven for at fuldføre injektionen. Den præcise måde at holde larven på, måden at indsætte nålen på, den hastighed, hvormed det ønskede stof injiceres, og nålens tilbagetrækningsretning er alle forhold, der bedst kan forbedres ved praksis. Det mest udfordrende skridt at overvinde er at trække nålen ud af larven uden nogen resulterende lækage af essentielle organer. Men med præcision og erfaring bliver vanskeligheden ved at støde på under dette trin mindre.
Denne teknik er også et fremragende værktøj i flere applikationer til at indføre en række stoffer på en ensartet måde, der kan gentages flere gange, hvilket giver mulighed for konsistente resultater. Den hurtige dødelighed, der observeres hos P. asymbiotica-inficerede larver, afspejler den høje virulens af denne bakteriestamme til insekter24,25,26. P. asymbiotica er veldokumenteret til at udtrykke virulensgener under infektion, der øger bakteriel overlevelse og patogenicitet mod insektværter ved at hæmme hæmocytmigration og fagocytose24,25. Det forventes også, at larverne er resistente over for injektioner med de ikke-patogene bakteriestammer af E. coli samt injektioner med PBS, hvilket bekræfter tidligere resultater på dette forskningsområde26. Derfor opnås mikroinjektion uden nogen negativ indvirkning på dyrs levedygtighed, hvilket gør det muligt at anvende det i molekylære og immunologiske undersøgelser til at undersøge patogenesen af en lang række mikrobielle infektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer af Institut for Biologiske Videnskaber ved George Washington University (GWU) for kritisk læsning af manuskriptet. GT blev støttet gennem et Harlan sommerstipendium fra GWU. Alle grafiske figurer blev lavet ved hjælp af BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes - plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host's blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, É, Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
