Summary
Le mosche adulte Drosophila melanogaster sono state ampiamente utilizzate come organismi modello per studiare i meccanismi molecolari alla base delle risposte immunitarie innate antimicrobiche dell'ospite e delle strategie di infezione microbica. Per promuovere lo stadio larvale di D. melanogaster come sistema modello aggiuntivo o alternativo, viene descritta una tecnica di iniezione larvale.
Abstract
L'uso di modelli non convenzionali per studiare l'immunità innata e la virulenza dei patogeni fornisce una valida alternativa ai modelli di mammiferi, che possono essere costosi e sollevare questioni etiche. I modelli non convenzionali sono notoriamente economici, facili da maneggiare e cultura e non occupano molto spazio. Sono geneticamente suscettibili e possiedono sequenze genomiche complete e il loro uso non presenta considerazioni etiche. Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster, ad esempio, ha fornito grandi intuizioni su una varietà di comportamento, sviluppo, metabolismo e ricerca sull'immunità. Più specificamente, le mosche e le larve adulte di D. melanogaster possiedono diverse reazioni di difesa innate che sono condivise con gli animali vertebrati. I meccanismi che regolano le risposte immunitarie sono stati per lo più rivelati attraverso studi genetici e molecolari nel modello D. melanogaster . Qui viene fornita una nuova tecnica di iniezione larvale, che promuoverà ulteriormente le indagini sui processi immunitari innati nelle larve di D. melanogaster ed esplorerà la patogenesi di una vasta gamma di infezioni microbiche.
Introduction
Drosophila melanogaster è stata immensamente utilizzata nella ricerca biologica e biomedica per diversi decenni, poiché la sofisticata gamma di strumenti genetici e molecolari si è costantemente evoluta per l'analisi di una vasta gamma di studi1,2,3,4. Gli aspetti evolutivamente conservati dello sviluppo, dell'omeostasi e dell'immunità innata in D. melanogaster lo hanno reso un prezioso organismo modello per lo studio di varie malattie umane e degli insetti5,6. In particolare, il ruolo fondamentale del modello di D. melanogaster per lo studio dell'immunità è stato ampiamente esemplificato negli studi sulle mosche adulte. Tuttavia, gli studi sulle larve di D. melanogaster hanno anche contribuito alle conoscenze attuali e hanno esplorato principalmente le risposte immunitarie cellulari, in particolare per le infezioni da vespe e nematodi che si verificano attraverso la cuticola degli insetti7,8,9,10. Le larve di Drosophila melanogaster possiedono tre diversi tipi di cellule del sangue, collettivamente chiamate emociti: plasmatociti, cellule cristalline e lamellociti11,12,13. Queste cellule possono montare una serie di risposte immunitarie quando le larve di D. melanogaster sono infettate da agenti patogeni come batteri, funghi, virus e parassiti14,15,16. Le risposte immunitarie cellulari includono l'inghiottimento diretto (fagocitosi) di piccole molecole o batteri, la melanizzazione, l'incapsulamento di agenti patogeni più grandi come le uova parassitoidi e la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e ossido nitrico sintasi (NOS)17,18,19.
Al contrario, sono stati pubblicati meno studi sull'uso del modello larvale D. melanogaster per analizzare le risposte immunitarie umorali. Ciò è dovuto principalmente all'applicazione di saggi di alimentazione per l'infezione orale delle larve di D. melanogaster e a diverse sfide associate alla microiniezione di larve, tra cui la manipolazione precisa delle larve e l'uso corretto del microaghi, specialmente durante la penetrazione20,21. Pertanto, la limitata conoscenza dell'infezione larvale e le difficoltà tecniche (cioè l'alta mortalità) hanno spesso reso difficile l'uso del modello larvale di D. melanogaster. Un modello larvale avrà il potenziale per identificare nuovi meccanismi molecolari che forniranno ulteriori approfondimenti sulle interazioni ospite-patogeno e sull'induzione di specifiche risposte immunitarie innate dell'ospite contro le infezioni patogene.
Qui viene descritto in dettaglio un protocollo semplice ed efficiente che può essere utilizzato per iniettare larve di D. melanogaster con vari agenti patogeni, come i batteri. In particolare, le larve di D. melanogaster sono utilizzate per iniezioni con il patogeno umano Photorhabdus asymbiotica e il batterio non patogeno Escherichia coli. Questo metodo può essere utilizzato per la manipolazione e l'analisi delle risposte immunitarie di D. melanogaster a varie infezioni microbiche.
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Protocol
1. Allevamento di mosche
NOTA: Il ciclo di vita di D. melanogaster è diviso in quattro fasi: embrione, larva, pupa e adulto. Il tempo di generazione con condizioni di allevamento ottimali in laboratorio (~ 25 ° C, 60% di umidità e cibo sufficiente) è di circa 10 giorni dall'uovo fecondato all'adulto echiuso. Le femmine depongono circa 100 embrioni al giorno e l'embriogenesi dura circa 24 ore su 22. Le larve subiscono tre fasi di sviluppo (instars; L1-L3) in ~4 giorni (L1 e L2: 24 h, e L3: 48 h). Le prime larve instar iniziano a nutrirsi immediatamente sulla superficie del mezzo. Le larve di seconde instar scavano nel mezzo, mentre le larve di third instar lasciano il medium e vagano lungo le pareti della fiala, alla ricerca di un posto dove pupariate per 24-48 h. La linea D. melanogaster utilizzata per questo protocollo è Oregon R (FBsn0000276).
- Aggiungere cibo secco contenente una dieta a base di farina di mais a base di soia a un flaconcino stretto di polistirene (25 mm x 95 mm) per un volume da 1/5 a 2/5. Quindi aggiungere 9 ml di acqua e lasciare riposare la fiala per 1 minuto fino a quando la dieta non è completamente idratata.
- Aggiungere circa 10 granuli di lievito di birra secco alla fiala e posizionare una miscela di almeno 20 mosche adulte maschio e femmina appena emerse.
- Incubare il flaconcino a 25 °C su un ciclo fotoperiodico scuro di luce e luce 12:12 ore.
- Per garantire la progressione del ciclo di vita, controllare quotidianamente le fiale volanti e registrare le fasi iniziali di sviluppo.
2. Selezione delle larve per l'infezione
- Seleziona le larve con un pennello fine (i capelli di cammello sono i migliori) una volta raggiunto il terzo stadio instar errante il giorno in cui verrà eseguita l'infezione (Figura 1).
- Lavare le larve selezionate con la soluzione di Ringer (100 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6,9) in una piccola capsula di Petri (60 mm x 15 mm) al momento della rimozione dal flaconcino originale23.
- Posizionare le larve su carta da filtro (diametro 150 mm) leggermente inumidita con circa 5 ml di soluzione di Ringer in una capsula di Petri (100 mm x 15 mm) (Figura 2A).
- Aggiungere ~ 1 mL di soluzione di Ringer al giorno alla carta da filtro secondo necessità per evitare secchezza e essiccazione larvale.
3. Preparazione batterica
- Coltura di batteri P. asymbiotica su terreno di agar Luria Bertani (LB) a 28 °C per 48 h.
- Utilizzare un armadio di livello di biosicurezza 2 per trasferire una singola colonia di P. asymbiotica per inoculare una coltura liquida in 10 ml di terreni LB.
- Incubare la coltura liquida di P. asymbiotica durante la notte a 28 °C in uno shaker rotativo impostato a 220 giri/min.
- Coltura di batteri E. coli in modo simile, ma effettua la crescita iniziale su terreni di agar e l'incubazione di colture liquide a 37 °C durante la notte.
- Centrifugare ogni coltura batterica notturna per 3 min a 13.000 x g e 4 °C.
- Scartare il surnatante e lavare i pellet batterici risultanti tre volte con 10 ml di PBS sterile.
- Centrifugare nuovamente il pellet per 3 min a 13.000 x g e 4 °C.
- Diluire ogni pellet con PBS sterile per regolare le concentrazioni batteriche alla densità ottica (600 nm) di 0,25 per P. asymbiotica e 0,015 per E. coli, che corrispondono a 100-300 unità formanti colonie per larva di ciascun preparato batterico, utilizzando uno spettrofotometro.
4. Preparazione dell'iniettore
- Preparare i capillari utilizzando tubi capillari in vetro da 3,5" e un estrattore di micropipette. Impostare lo strumento come segue: calore: 580; tirare: 143; velocità: 25; ritardo: 1; pressione: 500.
- Utilizzare pinze dritte a punto medio seghettato per aprire il capillare di vetro nella misura che consentirà l'erogazione dei trattamenti sperimentali causando danni minimi alle larve (Figura 2B). Per ottimizzare questa procedura durante la pratica delle iniezioni, utilizzare la soluzione di Trypan Blue (diluire lo stock allo 0,4% con PBS allo 0,2%) per monitorare facilmente le perdite durante l'iniezione e la sopravvivenza delle larve blu.
- Riempire il capillare con olio minerale utilizzando una siringa di plastica monouso da 20 ml con un ago ipodermico (22 G, lunghezza 25 mm).
- Impostare l'iniettore nanoliter ed espellere l'olio dal capillare (Figura 2C).
- Riempire il capillare con la preparazione batterica desiderata per l'iniezione. Prendere la soluzione da una goccia (~20 μL) che viene posta su parafilm. In questo protocollo, sono stati iniettati 50,2 nL di due stock batterici.
5. Iniezione di larve
- Anestetizzare le larve di D. melanogaster usando anidride carbonica per ~ 2 minuti prima della procedura.
- Trasferire delicatamente le larve anestetizzate su una carta da filtro inumidita nella soluzione di Ringer in preparazione per l'iniezione sotto uno stereomicroscopio. Le larve saranno letargiche o passive a questo punto.
- Per iniettare le larve, applicare una forte pressione sul lato dorsale dell'estremità posteriore (gli spiracoli tracheali sono evidenti all'estremità posteriore rispetto alle parti della bocca nere all'estremità anteriore) usando una pinza (Figura 2D).
- Inserire l'ago orizzontalmente verso l'estremità posteriore delle larve, vicino alla cuticola. Un'iniezione riuscita non comporterà una fuoriuscita della soluzione iniettata dalle larve (Figura 3).
- Rimuovere la pinza che è stata utilizzata per esercitare pressione sulla coda delle larve prima di ritirare l'ago. Se non rimosso prima, la pinza può forzare l'emolinfa e / o l'intestino fuori dalle larve dal sito della ferita.
- Infettare il numero appropriato di larve per lo studio in corso. In questo particolare protocollo, sono state iniettate 20 larve per ogni condizione sperimentale.
- Usando una pinza, trasferire delicatamente le larve iniettate in una carta da filtro umida separata in una capsula di Petri (10 larve per piatto) o una fiala di cibo (a seconda dello scopo dell'esperimento) per consentire il recupero.
- Mettere le piastre di Petri o i flaconcini di cibo in un'incubatrice a 25 °C. Se le larve sono conservate in una capsula di Petri, aggiungere la soluzione di Ringer se necessario per evitare l'essiccazione.
6. Registrazione della sopravvivenza/mortalità
- Registrare il numero di larve di D. melanogaster morte e vive in base ai punti temporali sperimentali impostati. Le larve vive continueranno a svilupparsi in pupe e adulti.
- Utilizzare programmi statistici, come Prism, per inserire i dati grezzi di sopravvivenza / mortalità, analizzarli con il test log-rank (Mantel-Cox) e rappresentare i risultati in cifre.
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Representative Results
Se eseguite correttamente, le iniezioni di larve di D. melanogaster mostrano un effetto specifico del batterio. I dati di sopravvivenza sono stati raccolti in diversi punti temporali a seguito di infezioni da P. asymbiotica (ceppo ATCC43943), E. coli (ceppo K12) e PBS (Figura 4). Mentre le larve di D. melanogaster sono sensibili a P. asymbiotica, che compromette rapidamente la sopravvivenza, le larve iniettate con controlli E. coli o PBS mostrano sopravvivenze prolungate24,25,26. In particolare, rispetto alle larve infette da P. asymbiotica, che presentano un tasso di sopravvivenza del 57% 24 ore dopo l'iniezione, le larve iniettate con E. coli mostrano un tasso di sopravvivenza dell'85% allo stesso tempo.
Figura 1: Selezione delle larve di Drosophila melanogaster per l'iniezione. Il ciclo di vita di Drosophila melanogaster, dalla fecondazione dell'uovo alla vita adulta, dura circa 10 giorni. Durante la crescita larvale, le larve si nutrono fino a quando non sono pronte per impuparsi e cambiare in adulti. Ai fini degli esperimenti di iniezione, vengono selezionate le larve di terza stella, che lasciano il terreno di coltura e vagano lungo le pareti della fiala. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione della procedura di iniezione larvale di Drosophila melanogaster . (A) Le larve di terza stella vaganti vengono selezionate, lavate con la soluzione di Ringer e poste su carta da filtro in una capsula di Petri in preparazione per l'iniezione. (B) Utilizzando una pinza, il capillare di vetro viene rotto per consentire l'erogazione dei trattamenti sperimentali. (C) L'iniettore nanoliter programmabile è installato in preparazione per l'iniezione sotto uno stereomicroscopio. (D) Per iniettare le larve, la pressione viene applicata sul lato dorsale della coda delle larve usando una pinza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Illustrazione della consegna di cellule batteriche nelle larve di Drosophila melanogaster attraverso la microiniezione. Il lato dorsale dell'estremità posteriore è stabilizzato usando una pinza. Quindi, il capillare viene inserito orizzontalmente verso l'estremità posteriore delle larve, vicino alla cuticola. Dopo l'iniezione, le pinze vengono rimosse prima di prelevare con cura il capillare per prevenire la fuoriuscita di emolinfa dal sito della ferita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Sopravvivenza delle larve di Drosophila melanogaster a seguito dell'iniezione di batteri patogeni e non patogeni. Le larve di D. melanogaster dell'Oregon R sono state iniettate con 50,2 nL di Photorhabdus asymbiotica (ATCC43943), Escherichia coli (K12) o PBS. Mentre i controlli PBS ed E. coli non hanno mostrato alcun significato nei rapporti di sopravvivenza, le iniezioni di P. asymbiotica hanno compromesso rapidamente la sopravvivenza della mosca. Ogni curva di sopravvivenza è composta da misurazioni di tre studi indipendenti, ciascuno dei quali comprende 20 larve (*** p < 0,001). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Drosophila melanogaster è tra i modelli più preziosi e manipolati sperimentalmente utilizzati per le indagini sull'immunità innata e sulla patogenesi di varie infezioni microbiche. Ciò è dovuto al suo ciclo di vita semplice e veloce, alla semplice manutenzione in laboratorio, alla genetica evolutiva ben consolidata e alla diversa cassetta degli attrezzi genetica. I precedenti metodi di iniezioni di larve di D. melanogaster, come l'utilizzo di un dispositivo microfluidico ibrido o di un micromanipolatore Narishige, richiedono attrezzature altamente specializzate e possono essere costosi21,27. Nell'attuale protocollo, per espandere l'uso di D. melanogaster, viene delineata una semplice tecnica di iniezione che rappresenta un metodo efficiente e rapido per trasportare batteri nell'emocoel delle larve di D. melanogaster. La parte essenziale della tecnica qui descritta è l'iniezione effettiva dell'agente patogeno desiderato o di altre sostanze liquide utilizzando un microiniettore. Oltre a descrivere questa operazione essenziale, descriviamo anche metodi accessori come la coltivazione e la coltura di batteri e la manipolazione di materiali.
Il vantaggio principale di questo metodo è che l'ago viene tenuto approssimativamente parallelo alla larva e la tenuta viene eseguita con pochissima pressione sulla larva, riducendo così la possibilità di perdite di emolinfa, lesioni mortali o consegna inadeguata della sostanza desiderata. L'ago viene quindi inserito verso l'estremità posteriore della larva per completare l'iniezione. Il modo preciso di tenere la larva, il modo di inserire l'ago, la velocità con cui viene iniettata la sostanza desiderata e la direzione di ritiro dell'ago sono tutte questioni che possono essere migliorate al meglio dalla pratica. Il passo più impegnativo da superare è estrarre l'ago dalla larva senza alcuna perdita risultante di organi essenziali. Tuttavia, con la precisione e l'esperienza, la difficoltà incontrata durante questo passaggio diventa minore.
Questa tecnica è anche uno strumento eccellente in molteplici applicazioni per introdurre una varietà di sostanze in modo uniforme che può essere ripetuto più volte, consentendo così risultati coerenti. La rapida mortalità osservata nelle larve infette da P. asymbiotica riflette l'elevata virulenza di questo ceppo batterico agli insetti24,25,26. P. asymbiotica è ben documentato per esprimere geni di virulenza durante l'infezione che aumentano la sopravvivenza batterica e la patogenicità contro gli ospiti degli insetti inibendo la migrazione degli emociti e la fagocitosi24,25. Inoltre, le larve sono resistenti alle iniezioni con i ceppi batterici non patogeni di E. coli e alle iniezioni con PBS, confermando così i risultati precedenti in questo campo di ricerca26. Pertanto, la microiniezione si ottiene senza alcun effetto negativo sulla vitalità animale, consentendone l'uso in studi molecolari e immunologici per esplorare la patogenesi di una vasta gamma di infezioni microbiche.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del Dipartimento di Scienze Biologiche della George Washington University (GWU) per la lettura critica del manoscritto. GT è stato supportato attraverso una borsa di studio estiva Harlan da GWU. Tutte le figure grafiche sono state realizzate utilizzando BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes - plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
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