Summary
ショウジョウバエのメラノガスター 成虫ハエは、宿主の抗菌自然免疫応答および微生物感染戦略の根底にある分子メカニズムを調べるためのモデル生物として広く利用されてきた。追加的または代替的なモデル系として D.メラノガスター 幼虫期を促進するための、幼虫注入技術が記載されている。
Abstract
自然免疫と病原体の毒性を研究するための型破りなモデルの使用は、哺乳類モデルに代わる貴重な代替手段を提供し、費用がかかり、倫理的問題を提起する可能性があります。型破りなモデルは、安価で扱いやすく、文化が容易で、スペースを取らないことで有名です。彼らは遺伝的に従順であり、完全なゲノム配列を有し、それらの使用は倫理的考慮を提示しない。例えば、ショウ ジョウバエのメラノガスターは、さまざまな行動、発達、代謝、免疫研究に大きな洞察を与えてきました。より具体的には、 D. melanogaster 成虫のハエおよび幼虫は、脊椎動物と共有されるいくつかの先天的な防御反応を有する。免疫応答を調節するメカニズムは、 D. melanogaster モデルにおける遺伝的および分子的研究によって主に明らかにされている。ここでは、 D. melanogaster 幼虫における自然免疫プロセスの調査をさらに促進し、広範囲の微生物感染の病因を探る新規幼虫注入技術が提供される。
Introduction
ショウジョウバエのメラノガスターは、幅広い研究の分析のために洗練された遺伝的および分子的ツールの配列が着実に進化してきたため、数十年にわたって生物学的および生物医学的研究に大いに利用されてきました1,2,3,4。D. melanogasterの発達、恒常性、自然免疫の進化的に保存された側面は、さまざまなヒトおよび昆虫の病気を研究するための貴重なモデル生物となっています5,6。特に、免疫を研究するためのD.メラノガスターモデルの基本的な役割は、成虫のハエ研究において大きく例示されている。しかし、D. melanogaster幼虫の研究も現在の知識に貢献し、主に昆虫のキューティクルを介して起こるワタおよび線虫感染に対する細胞性免疫応答を探求した7,8,9,10。ショウジョウバエのメラノガスター幼虫は、血球細胞、結晶細胞、および層状細胞の3つの異なるタイプの血液細胞、総称して血球を有する11,12,13。これらの細胞は、D.メラノガスターの幼虫が細菌、真菌、ウイルス、寄生虫などの病原体に感染している場合に、一連の免疫応答をマウントすることができます14,15,16。細胞性免疫応答には、小分子または細菌の直接巻き込み(貪食作用)、メラニン化、寄生卵などのより大きな病原体のカプセル化、活性酸素種(ROS)および一酸化窒素合成酵素(NOS)の産生が含まれる17,18,19。
対照的に、体液性免疫応答を分析するためのD. melanogaster幼虫モデルの使用に関する研究は少ない。これは主に、D. melanogaster幼虫の経口感染に対する摂食アッセイの適用と、特に浸透中の幼虫の正確な取り扱いおよびマイクロニードルの適切な使用を含む、幼虫の微量注入に関連するいくつかの課題によるものである20,21。したがって、幼虫感染に関する限られた知識および技術的困難(すなわち、高い死亡率)は、しばしばD.メラノガスター幼虫モデルの使用を困難にしている。幼虫モデルは、宿主-病原体相互作用および病原性感染に対する特定の宿主自然免疫応答の誘導に関するさらなる洞察を提供する新規分子機構を同定する可能性を秘めている。
ここでは、 D.メラノガスター 幼虫に細菌などの様々な病原体を注入するために使用できるシンプルで効率的なプロトコルが詳細に説明されています。特に、 D.メラノガスター 幼虫は、ヒト病原体 Photorhabdus asymbiotica および非病原性細菌 Escherichia coliとの注射に使用される。この方法は、様々な微生物感染に対する D.メラノガスター の免疫応答の操作および分析に使用することができる。
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Protocol
1. フライ飼育
注:D.メラノガスターのライフサイクルは、胚、幼虫、蛹、成虫の4つの段階に分かれています。実験室での最適な飼育条件(〜25°C、湿度60%、十分な食物)での生成時間は、受精卵から密閉成体まで約10日間です。雌は1日あたり約100個の胚を産み、胚発生は約24時間22続きます。幼虫は3つの発達段階(instars;L1-L3)で〜4日間(L1およびL2:24時間、およびL3:48時間)。最初の齢幼虫は、培地の表面上で直ちに摂食し始める。第2齢幼虫は培地に穴を掘り、第3齢幼虫は培地を離れ、バイアル壁をさまよい、24〜48時間蛹化する場所を探す。
- コーンミール - 大豆ベースの食事を含むドライフードを狭いポリスチレンバイアル(25 mm x 95 mm)に加え、1/5〜2/5容量のアブエにします。その後、9mLの水を加え、食事が完全に水和するまでバイアルを1分間座らせます。
- 約10個の乾燥パン酵母の顆粒をバイアルに加え、少なくとも20匹の新しく出現した雄および雌の成虫ハエの混合物を置く。
- バイアルを12:12-hの光:暗い光周期サイクル上で25°Cでインキュベートする。
- ライフサイクルの進行を確実にするために、フライバイアルを毎日チェックし、初期の開発段階を記録してください。
2.感染のための幼虫の選択
- 幼虫は、感染が行われる日にさまよう第3齢期に達したら、細かい絵筆(ラクダの毛が最適)で選択します(図1)。
- 元のバイアルから取り出したら、選択した幼虫をリンゲル溶液(100 mM NaCl、1.8 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、5 mM HEPES pH 6.9)で小さなペトリ皿(60 mm x 15 mm)で洗浄します23。
- ペトリ皿(100 mm x 15 mm)内の約5 mLのリンゲル溶液でわずかに湿らせたろ紙(直径150 mm)に幼虫を置きます(図2A)。
- 乾燥や幼虫の乾燥を避けるために、必要に応じて毎日約1mLのリンゲル溶液をろ紙に加えます。
3. 細菌製剤
- P. asymbiotica属細菌をルリア・ベルタニ(LB)寒天培地上で28°Cで48時間培養する。
- バイオセーフティレベル2キャビネットを使用して 、非対称性のP. の単一コロニーを移し、液体培養物を10mLのLB培地に接種する。
- 非シンビオティカ液体培養液を220rpmに設定したロータリーシェーカー中で28°Cで一晩培養する。
- 大腸菌を同様の方法で培養するが、寒天培地上で初期増殖を行うが、37°Cで一晩培養して液体培養した。
- 細菌培養物を毎晩遠心分離機で、13,000 x g および4°Cで3分間培養する。
- 上清を捨て、得られた細菌ペレットを10mLの滅菌PBSで3回洗浄する。
- ペレットを再び13,000 x g および4°Cで3分間遠心分離する。
- 分光光度計を用いて、各ペレットを滅菌PBSで希釈し、細菌濃度を、非 対称菌 の場合は0.25、 大腸菌の場合は0.015の光学濃度(600nm)に調整し、これは分光光度計を用いて各細菌調製物の幼虫当たり100〜300コロニー形成単位に対応する。
4. インジェクターの準備
- 3.5インチガラスキャピラリーチューブとマイクロピペットプーラーを使用して毛細血管を準備します。次のように機器を設定します:熱:580。プル:143。速度: 25;遅延: 1;圧力:500。
- まっすぐな鋸歯状の中点鉗子を使用して、幼虫への損傷を最小限に抑えながら実験的処置の実施を可能にする程度までガラス毛細血管を開きます(図2B)。注射の練習中にこの手順を最適化するには、トリパンブルー溶液(PBSでストックを0.4%から0.2%に希釈)を使用して、注射中の漏れと青い幼虫の生存を簡単に追跡します。
- 皮下注射針(22G、長さ25mm)を備えたプラスチック製の使い捨て20mLシリンジを使用して、毛細血管に鉱物油を充填する。
- ナノリットルのインジェクタをセットアップし、キャピラリーからオイルを排出します(図2C)。
- 毛細血管を注射用の所望の細菌製剤で満たす。パラフィルム上に置かれた滴(〜20μL)から溶液を取ります。このプロトコールでは、2つの細菌ストックの50.2nLが注入された。
5.幼虫注射
- 処置の前に二酸化炭素を用いて D.メラノガスター 幼虫を約2分間麻酔する。
- 麻酔した幼虫をリンゲル溶液で湿らせたろ紙に静かに移し、実体顕微鏡下での注射に備えさせる。幼虫はこの時点で嗜眠性または受動的になります。
- 幼虫を注入するには、鉗子を使用して後端の背側にしっかりと圧力をかけます(気管のスパイラルは後端で明らかですが、前端の黒い口の部分)。
- キューティクルの近く、幼虫の後端に向かって針を水平に挿入する。注射が成功しても、幼虫から注入された溶液が漏れることはありません(図3)。
- 針を抜く前に幼虫の尾に圧力をかけるために使用された鉗子を取り除きます。最初に除去されない場合、鉗子は、血リンパおよび/または腸を創傷部位から幼虫から強制的に取り出すことができる。
- 実施されている研究に適した数の幼虫に感染する。この特定のプロトコールでは、各実験条件について20匹の幼虫が注入された。
- 鉗子を使用して、注入された幼虫をペトリ皿(1皿あたり10匹の幼虫)または食物バイアル(実験の目的に応じて)内の別の湿ったろ紙に静かに移し、回収を可能にする。
- ペトリ皿または食品バイアルを25°Cのインキュベーターに入れる。 幼虫がペトリ皿に保管されている場合は、乾燥を防ぐために必要に応じてリンゲル溶液を加えてください。
6. 生存/死亡率の記録
- 設定された実験時点に従って、D .メラノガスター 幼虫の死体および生きた数を記録する。生きた幼虫は蛹と成虫に発達し続けます。
- プリズムなどの統計プログラムを使用して、生の生存/死亡率データを入力し、ログランク(マンテルコックス)検定で分析し、結果を数値で表します。
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Representative Results
正しく行われると、D.メラノガスター幼虫の注射は細菌特異的な効果を示す。生存データは、非対称性菌(ATCC43943株)、大腸菌(K12株)、およびPBSの感染後のいくつかの時点で収集された(図4)。D. melanogaster幼虫はP. asymbioticaに罹患しやすく、生存を急速に損ないのに対し、大腸菌またはPBS対照を注射した幼虫は長期生存を示す24,25,26。特に、注射後24時間で57%の生存率を示す非シンビオティカ菌に感染した幼虫と比較して、大腸菌を注射した幼虫は、同時点で85%の生存率を示す。
図1:注射用ショウジョウバエメラノガスター幼虫の選択。 ショウジョウバエのメラノガスターのライフサイクルは、卵の受精から成虫の生活まで、約10日かかります。幼虫の成長の間、幼虫は蛹化する準備ができるまで餌を与え、成虫に変わる。注射実験の目的のために、培養培地を離れ、バイアルの壁をさまよう第3齢幼虫が選択される。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: ショウジョウバエメラノガスター 幼虫注射手順の描写。 (A)放浪する第3齢幼虫を選択し、リンゲル溶液で洗浄し、注射の準備のためにペトリ皿のろ紙の上に置く。(b)鉗子を使用して、ガラス毛細血管を破断し、実験的処置の送達を可能にする。(C)プログラム可能なナノリットルインジェクターは、実体顕微鏡下での注射の準備としてセットアップされる。(D)幼虫を注入するには、鉗子を用いて幼虫の尾部の背側に圧力をかける。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マイクロインジェクションを介してショウジョウバエのメラノガスター幼虫に細菌細胞を送達する図。後端の背側は鉗子を用いて安定化される。次に、毛細血管を幼虫の後端、キューティクルの近くに向かって水平に挿入する。注射に続いて、鉗子は、創傷部位からの血リンパ漏れを防ぐために毛細血管を慎重に引き抜く前に除去される。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:病原性および非病原性細菌の注射後のショウジョウバエメラノガスター幼虫の生存。 D. melanogasterのオレゴンR幼虫に、50.2nLのPhotorhabdus asymbiotica(ATCC43943)、大腸菌(K12)、またはPBSを注射した。PBSおよび大腸菌対照は生存率において有意性を示さなかったが、非対称性菌注射はハエの生存を急速に危うくした。各生存曲線は、それぞれが20匹の幼虫(*** p < 0.001)を含む3つの独立した試験からの測定値からなる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ショウジョウバエのメラノガスターは、自然免疫と様々な微生物感染症の病因の調査に使用される最も価値のある、実験的に操作されたモデルの一つです。これは、そのシンプルで速いライフサイクル、実験室での簡単な維持、十分に確立された進化遺伝学、および多様な遺伝的ツールボックスによるものです。ハイブリッドマイクロ流体装置またはナリシゲマイクロマニピュレーターを使用するなど、D.メラノガスター幼虫注射の以前の方法は、高度に専門化された装置を必要とし、費用がかかる可能性がある21,27。現在のプロトコルでは、D.メラノガスターの使用を拡大するために、D.メラノガスター幼虫のヘモコエルに細菌を送達する効率的かつ迅速な方法を表す単純な注入技術が概説されている。ここで説明する技術の本質的な部分は、マイクロインジェクターを用いた所望の病原体または他の液体物質の実際の注射である。この本質的な操作を説明するだけでなく、細菌の増殖と培養、材料の取り扱いなどの補助的な方法についても説明します。
この方法の主な利点は、針が幼虫とほぼ平行に保持され、保持が幼虫への圧力をほとんど伴わずに行われるため、血リンパ漏れ、致死的傷害、または所望の物質の不十分な送達の可能性を低減することである。次いで、注射を完了するために、針を幼虫の後端に向かって挿入する。幼虫の正確な保持方法、針を挿入する方法、所望の物質が注入される速度、および針の引き抜きの方向はすべて、実践によって最もよく改善され得る事項である。克服すべき最も困難なステップは、重要な器官の漏れなしに幼虫から針を抜くことです。ただし、正確さと経験があれば、このステップで遭遇する難易度は少なくなります。
この技術は、さまざまな物質を複数回繰り返すことができる均一な方法で導入するための複数の用途においても優れたツールであり、一貫した結果を可能にします。P. asymbioticaに感染した幼虫で観察された急速な死亡率は、昆虫に対するこの細菌株の高い毒性を反映しています24,25,26。P. asymbioticaは、血球移動および貪食作用を阻害することによって昆虫宿主に対する細菌の生存および病原性を増加させる感染中に病原性遺伝子を発現させることについて十分に文書化されている24,25。また、幼虫は大腸菌の非病原性細菌株を用いた注射やPBSの注射に対して耐性があることが予想され、本研究分野でのこれまでの成果を裏付けるものです26。したがって、マイクロインジェクションは動物の生存率に悪影響を及ぼすことなく達成され、広範囲の微生物感染の病因を探るための分子的および免疫学的研究におけるその使用を可能にする。
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Disclosures
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
Acknowledgments
ジョージワシントン大学(GWU)の生物科学科のメンバーに、原稿を批判的に読んでくれたことに感謝します。GTはGWUのハーラン・サマー・フェローシップを通じて支援を受けました。すべてのグラフィカルな図はBioRenderを使用して作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes - plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host's blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, É, Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
