Summary
초파리 멜라노가스터 성인 파리는 숙주 항미생물 선천적 면역 반응 및 미생물 감염 전략의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조사하기 위한 모델 유기체로서 광범위하게 활용되고 있다. D. melanogaster 유충 단계를 추가 또는 대안 모델 시스템으로서 촉진하기 위해, 애벌레 주입 기술이 기술된다.
Abstract
선천적 면역과 병원균 독성을 연구하기 위해 비전통적인 모델을 사용하는 것은 포유류 모델에 대한 귀중한 대안을 제공하며, 이는 비용이 많이 들고 윤리적 인 문제를 제기 할 수 있습니다. 틀에 얽매이지 않는 모델은 악명 높게도 저렴하고 취급하기 쉽고 문화가 쉬우며 많은 공간을 차지하지 않습니다. 그들은 유전적으로 순응성이 있고 완전한 게놈 서열을 가지고 있으며, 그들의 사용은 윤리적 인 고려 사항을 제시하지 않습니다. 예를 들어, 초파리 초파리 멜라노가스터는 다양한 행동, 발달, 신진 대사 및 면역 연구에 대한 훌륭한 통찰력을 제공했습니다. 보다 구체적으로, D. melanogaster 성인 파리와 애벌레는 척추 동물과 공유되는 몇 가지 선천적 인 방어 반응을 가지고 있습니다. 면역 반응을 조절하는 메커니즘은 대부분 D. melanogaster 모델의 유전 및 분자 연구를 통해 밝혀졌습니다. 여기에 새로운 애벌레 주입 기술이 제공되어 D. melanogaster 유충의 선천적 면역 과정에 대한 조사를 더욱 촉진하고 광범위한 미생물 감염의 발병 기전을 탐구합니다.
Introduction
초파리 멜라노가스터는 광범위한 연구의 분석을 위해 정교한 유전 및 분자 도구 배열이 꾸준히 진화함에 따라 수십 년 동안 생물학적 및 생물 의학 연구에 엄청나게 활용되어 왔습니다1,2,3,4. D. melanogaster의 발달, 항상성 및 선천적 면역의 진화적으로 보존 된 측면은 다양한 인간 및 곤충 질병을 연구하는 데 귀중한 모델 유기체가되었습니다5,6. 특히, 면역을 연구하기위한 D. melanogaster 모델의 근본적인 역할은 성인 파리 연구에서 크게 예시되었습니다. 그러나 D. melanogaster 유충 연구는 또한 현재의 지식에 기여했으며 주로 곤충 큐티클을 통해 발생하는 말벌 및 선충류 감염에 대한 세포 면역 반응을 탐구했습니다7,8,9,10. 초파리 멜라노가스터 유충은 혈구라고 불리는 세 가지 유형의 혈액 세포를 가지고 있습니다 : 혈장 세포, 결정 세포 및 lamellocytes11,12,13. 이 세포들은 D. melanogaster 애벌레가 박테리아, 곰팡이, 바이러스 및 기생충과 같은 병원균에 감염 될 때 일련의 면역 반응을 일으킬 수 있습니다14,15,16. 세포 면역 반응에는 소분자 또는 박테리아의 직접적인 삼킴 (식균증), 멜라닌화, 기생충 알과 같은 더 큰 병원체의 캡슐화, 반응성 산소 종 (ROS) 및 산화 질소 합성 효소 (NOS) 17,18,19의 생산이 포함됩니다.
대조적으로, 체액성 면역 반응을 분석하기 위해 D. melanogaster 애벌레 모델의 사용에 관한 연구는 거의 발표되지 않았습니다. 이것은 주로 D. melanogaster 유충의 구강 감염에 대한 먹이 분석의 적용과 유충의 정확한 취급 및 미세 바늘의 적절한 사용, 특히 침투 중 20,21을 포함하여 미세 주입 유충과 관련된 몇 가지 과제 때문입니다. 따라서, 유충 감염에 대한 제한된 지식과 기술적 어려움 (즉, 높은 사망률)은 종종 D. melanogaster 유충 모델을 사용하기 어렵게 만들었습니다. 애벌레 모델은 숙주-병원체 상호작용 및 병원성 감염에 대한 특정 숙주 선천적 면역 반응의 유도에 대한 추가적인 통찰을 제공할 새로운 분자 메카니즘을 식별할 수 있는 잠재력을 가질 것이다.
여기에 D. melanogaster 유충을 박테리아와 같은 다양한 병원균과 함께 주입하는 데 사용할 수있는 간단하고 효율적인 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다. 특히, D. melanogaster 유충은 인간 병원균 Photorhabdus asymbiotica 및 비병원성 박테리아 대장균과의 주사에 사용됩니다. 이 방법은 다양한 미생물 감염에 대한 D. melanogaster 의 면역 반응의 조작 및 분석에 사용될 수 있습니다.
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Protocol
1. 플라이 키어링
참고 : D. melanogaster 수명주기는 배아, 애벌레, 번데기 및 성인의 네 단계로 나뉩니다. 실험실에서 최적의 양육 조건 (~ 25 °C, 60 % 습도 및 충분한 음식)을 가진 생성 시간은 수정 된 난자에서 밀폐 된 성인까지 약 10 일입니다. 암컷은 하루에 ~ 100 개의 배아를 낳고 배아 발생은 약 24 h22 지속됩니다. 유충은 세 가지 발달 단계 (별; L1-L3)에서 ~4일 (L1 및 L2: 24 h, 및 L3: 48 h). 첫 번째 인스타 유충은 배지 표면에서 즉시 먹이를 먹기 시작합니다. 두 번째 인스타 유충은 배지에 파묻히는 반면, 세 번째 인스타 유충은 배지를 떠나 바이알 벽을 돌아 다니며 24-48 시간 동안 번데기를 먹을 곳을 찾습니다.이 프로토콜에 사용 된 D. melanogaster 라인은 Oregon R (FBsn0000276)입니다.
- 옥수수 가루 콩 기반 식단을 함유 한 건조 식품을 좁은 폴리스티렌 바이알 (25mm x 95mm)에 추가하여 1/5 ~ 2/5 부피의 아부에 넣으십시오. 그런 다음 9 mL의 물을 첨가하고식이 요법이 완전히 수화 될 때까지 바이알을 1 분 동안 그대로 두십시오.
- 바이알에 건조 베이커 효모 약 10 과립을 넣고 새로 출현 한 남성과 여성 성인 파리 20 마리 이상을 혼합하십시오.
- 바이알을 12:12-h 광 상에서 25°C에서 인큐베이션한다: 어두운 광주기적 사이클.
- 라이프 사이클 진행을 보장하려면 매일 플라이 바이알을 확인하고 초기 개발 단계를 기록하십시오.
2. 감염에 대한 유충 선택
- 미세한 페인트 브러시 (낙타의 머리카락이 가장 좋습니다)를 가진 유충을 선택하면 감염이 수행되는 날에 방황하는 세 번째 instar 단계에 도달합니다 (그림 1).
- 선택된 유충을 원래의 바이알23으로부터 제거시 작은 페트리 접시 (60 mm x 15 mm)에서 링거 용액 (100 mM NaCl, 1.8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6.9)으로 세척한다.
- 유충을 페트리 접시 (100mm x 15mm)에 약 5mL의 링거 용액으로 약간 적신 여과지 (직경 150mm)에 놓습니다 (그림 2A).
- 건조와 애벌레 건조를 피하기 위해 필요에 따라 매일 ~ 1 mL의 링거 용액을 여과지에 첨가하십시오.
3. 세균 준비
- P. asymbiotica 박테리아를 루리아 베르타니(LB) 한천 배지에서 28°C에서 48시간 동안 배양하였다.
- 생물안전 레벨 2 캐비닛을 사용하여 P. asymbiotica 의 단일 콜로니를 전달하여 LB 배지 10 mL에 액체 배양물을 접종한다.
- 배양된 P. asymbiotica 액체 배양물을 220 rpm으로 설정된 회전식 진탕기에서 28°C에서 밤새 인큐베이션한다.
- 대장균 균 을 유사한 방식으로 배양하되, 한천 배지 상에서 초기 성장을 수행하고 하룻밤 동안 37°C에서 액체 배양을 수행하였다.
- 박테리아 배양물을 13,000 x g 및 4°C에서 3분 동안 각각 밤새 원심분리한다.
- 상청액을 버리고 생성된 박테리아 펠렛을 10 mL의 멸균 PBS로 세 번 세척한다.
- 펠렛을 다시 13,000 x g 및 4°C에서 3분 동안 원심분리한다.
- 각 펠렛을 멸균 PBS로 희석하여 분광광도계를 사용하여 각 박테리아 제제의 유충 당 100-300 콜로니 형성 단위에 해당하는 P. asymbiotica 에 대해 0.25 및 대장균에 대해 0.015의 광학 밀도 (600 nm)로 박테리아 농도를 조정한다.
4. 인젝터 준비
- 3.5 "유리 모세관 튜브와 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 모세 혈관을 준비하십시오. 다음과 같이 계측기를 설정하십시오 : 열 : 580; 당김: 143; 속도 : 25; 지연: 1; 압력: 500.
- 직선 톱니 모양의 중간 점 포셉을 사용하여 유리 모세관을 열어 유충에 최소한의 손상을 입히면서 실험 치료법을 제공 할 수 있도록합니다 (그림 2B). 주사를 연습하는 동안이 절차를 최적화하려면 Trypan Blue 용액 (PBS로 0.4 %를 0.2 %로 희석)을 사용하여 주입하는 동안 누출과 푸른 유충의 생존을 쉽게 추적하십시오.
- 플라스틱 일회용 20 mL 주사기를 사용하여 피하 주사 바늘 (22 G, 25 mm 길이)을 사용하여 모세관을 미네랄 오일로 채 웁니다.
- 나노리터 인젝터를 설치하고 오일을 모세관 밖으로 배출합니다(그림 2C).
- 주사를위한 원하는 박테리아 제제로 모세관을 채 웁니다. 파라 필름 위에 놓인 방울 (~ 20 μL)에서 용액을 취하십시오. 이 프로토콜에서, 50.2 nL의 2개의 박테리아 스톡이 주입되었다.
5. 유충 주입
- 절차 전에 ~ 2 분 동안 이산화탄소를 사용하여 D. melanogaster 유충을 마취하십시오.
- 마취 된 유충을 입체 현미경으로 주사 할 준비를하기 위해 링거 용액에 적신 여과지로 부드럽게 옮깁니다. 유충은이 시점에서 무기력하거나 수동적입니다.
- 유충을 주입하려면 포셉을 사용하여 후부 끝의 등쪽 쪽에 확고한 압력을 가하십시오 (기관 스파이라클은 후부 끝에서 뚜렷하고 앞쪽 끝의 검은 구강 부분에서는 분명 함) (그림 2D).
- 바늘을 큐티클 근처의 유충의 후부 끝쪽으로 수평으로 삽입하십시오. 성공적인 주사는 유충으로부터 주입 된 용액의 누출을 초래하지 않습니다 (그림 3).
- 바늘을 꺼내기 전에 애벌레의 꼬리에 압력을 가하는 데 사용 된 포셉을 제거하십시오. 먼저 제거하지 않으면 포셉은 용혈림프 및 / 또는 창자를 상처 부위에서 유충에서 강제로 꺼낼 수 있습니다.
- 수행중인 연구를 위해 적절한 수의 유충을 감염시킵니다. 이 특정 프로토콜에서, 각 실험 조건에 대해 20 마리의 애벌레가 주입되었다.
- 포셉을 사용하여 주입 된 유충을 페트리 접시 (접시 당 10 마리의 유충) 또는 음식 바이알 (실험 목적에 따라 다름)의 별도의 촉촉한 여과지로 부드럽게 옮겨 회복을 허용합니다.
- 페트리 접시 또는 음식 바이알을 25°C의 인큐베이터에 놓는다. 유충이 페트리 접시에 보관되면 필요에 따라 링거의 용액을 첨가하여 건조를 방지하십시오.
6. 생존/사망률 기록
- 설정된 실험 시점에 따라 죽은 D. melanogaster 유충의 수를 기록하십시오. 살아있는 애벌레는 번데기와 성인으로 계속 발전 할 것입니다.
- Prism과 같은 통계 프로그램을 사용하여 원시 생존/사망률 데이터를 입력하고, 로그 순위(Mantel-Cox) 테스트를 통해 분석하고, 결과를 수치로 표현합니다.
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Representative Results
올바르게 수행되면 D. melanogaster 유충의 주사는 박테리아 특이적 효과를 나타냅니다. 생존 데이터는 P. asymbiotica (균주 ATCC43943), 대장균 (균주 K12) 및 PBS (도 4)의 감염 후 여러 시점에서 수집되었다. D. melanogaster 유충은 생존을 빠르게 손상시키는 P. asymbiotica에 취약하지만, 대장균 또는 PBS 대조군을 주입 한 유충은 장기간 생존을 보입니다.24,25,26. 특히, 주사 후 24시간 후 57%의 생존율을 보이는 P. asymbiotica에 감염된 유충과 비교하여, 대장균을 주입한 유충은 동시에 85%의 생존율을 보인다.
그림 1 : 주사를위한 초파리 멜라노가스터 유충의 선택. 초파리 멜라노가스터의 수명주기는 난자 수정에서 성인 생활에 이르기까지 약 10 일이 걸립니다. 애벌레가 자라는 동안, 애벌레는 번데기가 될 때까지 먹이를 먹고 성인으로 바뀝니다. 주입 실험의 목적을 위해, 배양 배지를 떠나 바이알의 벽을 방황하는 세 번째 인스타 애벌레가 선택됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 초파리 멜라노가스터 유충 주입 절차의 묘사. (A) 방황하는 세 번째 인스타 유충을 선택하여 링거의 용액으로 세척하고 주사 준비를 위해 페트리 접시의 여과지에 놓습니다. (b) 포셉을 사용하여, 유리 모세관이 파괴되어 실험적 처리의 전달을 허용한다. (C) 프로그램 가능한 나노리터 인젝터는 입체 현미경으로 주입을 준비하기 위해 설치된다. (D) 애벌레를 주입하기 위해 포셉을 사용하여 애벌레 꼬리의 등쪽에 압력을 가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미세주사를 통해 박테리아 세포를 초파리 멜라노가스터 유충으로 전달하는 그림. 후부 끝의 등쪽 쪽은 포셉을 사용하여 안정화됩니다. 그런 다음 모세 혈관은 큐티클 근처의 유충의 후부 끝을 향해 수평으로 삽입됩니다. 주사 후, 포셉은 상처 부위에서 용혈림프 누출을 방지하기 위해 모세관을 조심스럽게 철수하기 전에 제거됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 병원성 및 비병원성 박테리아의 주사 후 초파리 멜라노가스터 유충의 생존. D. melanogaster의 오레곤 R 유충은 50.2 nL의 Photorhabdus asymbiotica (ATCC43943), Escherichia coli (K12), 또는 PBS를 주사하였다. PBS 및 대장균 대조군은 생존율에서 유의성을 나타내지 않은 반면, P. asymbiotica 주사는 파리 생존을 빠르게 손상시켰다. 각 생존 곡선은 각각 20 마리의 유충을 포함하는 세 가지 독립적 인 시험의 측정으로 구성됩니다 ( *** p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
초파리 멜라노가스터는 다양한 미생물 감염의 선천적 면역 및 발병기전을 조사하는 데 사용되는 가장 가치 있고 실험적으로 조작된 모델 중 하나입니다. 이것은 간단하고 빠른 수명주기, 실험실에서의 간단한 유지, 잘 정립 된 진화 유전학 및 다양한 유전 도구 상자 때문입니다. D. melanogaster 유충 주사의 이전 방법, 예를 들어 하이브리드 미세 유체 장치 또는 Narishige 미세 조작기를 사용하는 것과 같은 고도로 전문화 된 장비가 필요하며 비용이 많이 들 수 있습니다.21,27. 현재의 프로토콜에서, D. melanogaster의 사용을 확장하기 위해, D. melanogaster 유충의 헤모코엘에 박테리아를 전달하는 효율적이고 신속한 방법을 나타내는 간단한 주입 기술이 요약되어 있습니다. 여기에 설명 된 기술의 필수적인 부분은 마이크로 인젝터를 사용하여 원하는 병원체 또는 기타 액체 물질의 실제 주입입니다. 이 필수 작업을 설명하는 것 외에도 박테리아를 재배 및 배양하고 재료를 취급하는 것과 같은 액세서리 방법을 설명합니다.
이 방법의 주요 장점은 바늘이 유충과 대략 평행하게 유지되고 유충에 대한 압력이 거의 없기 때문에 용혈림프 누출, 치명적인 부상 또는 원하는 물질의 부적절한 전달의 가능성을 줄일 수 있다는 것입니다. 그런 다음 바늘을 유충의 후부 끝쪽으로 삽입하여 주사를 완료합니다. 유충을 잡는 정확한 방법, 바늘을 삽입하는 방법, 원하는 물질이 주입되는 속도 및 바늘의 철수 방향은 모두 연습을 통해 가장 잘 개선 될 수있는 문제입니다. 극복해야 할 가장 어려운 단계는 필수 장기의 누출없이 유충에서 바늘을 꺼내는 것입니다. 그러나 정밀함과 경험으로이 단계에서 직면 한 어려움은 줄어들 것입니다.
이 기술은 또한 여러 번 반복 될 수있는 균일 한 방식으로 다양한 물질을 도입하여 일관된 결과를 가능하게하는 여러 응용 분야에서 탁월한 도구입니다. P. asymbiotica에 감염된 유충에서 관찰 된 급속한 사망률은 곤충에 대한이 박테리아 균주의 높은 독성을 반영합니다.24,25,26. P. asymbiotica는 혈구 이동 및 식작용을 억제함으로써 곤충 숙주에 대한 박테리아 생존 및 병원성을 증가시키는 감염 중에 독성 유전자를 발현하는 것에 대해 잘 문서화되어 있습니다.24,25. 또한 예상대로, 유충은 대장균의 비병원성 박테리아 균주와의 주사뿐만 아니라 PBS를 사용한 주사에 내성이 있으며, 따라서 이 연구 분야26에서 이전의 결과를 확인할 수 있다. 따라서 미세 주사는 동물의 생존력에 악영향을 미치지 않고 달성되므로 분자 및 면역 학적 연구에 사용하여 광범위한 미생물 감염의 발병 기전을 탐구 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 원고의 비판적 읽기에 대한 조지 워싱턴 대학 (GWU)의 생물 과학과의 구성원에게 감사드립니다. GT는 GWU의 Harlan 여름 펠로우십을 통해 지원되었습니다. 모든 그래픽 수치는 BioRender를 사용하여 제작되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes - plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
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