Summary
Las moscas adultas de Drosophila melanogaster se han utilizado ampliamente como organismos modelo para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a las respuestas inmunes innatas antimicrobianas del huésped y las estrategias de infección microbiana. Para promover la etapa de larva de D. melanogaster como un sistema modelo adicional o alternativo, se describe una técnica de inyección larvaria.
Abstract
El uso de modelos no convencionales para estudiar la inmunidad innata y la virulencia de los patógenos proporciona una alternativa valiosa a los modelos de mamíferos, que puede ser costosa y plantear problemas éticos. Los modelos no convencionales son notoriamente baratos, fáciles de manejar y cultivar, y no ocupan mucho espacio. Son genéticamente susceptibles y poseen secuencias completas del genoma, y su uso no presenta consideraciones éticas. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster, por ejemplo, ha proporcionado grandes conocimientos sobre una variedad de investigaciones sobre el comportamiento, el desarrollo, el metabolismo y la inmunidad. Más específicamente, las moscas y larvas adultas de D. melanogaster poseen varias reacciones de defensa innatas que se comparten con los animales vertebrados. Los mecanismos que regulan las respuestas inmunes se han revelado principalmente a través de estudios genéticos y moleculares en el modelo de D. melanogaster . Aquí se proporciona una nueva técnica de inyección larvaria, que promoverá aún más las investigaciones de los procesos inmunes innatos en larvas de D. melanogaster y explorará la patogénesis de una amplia gama de infecciones microbianas.
Introduction
Drosophila melanogaster ha sido inmensamente utilizado en la investigación biológica y biomédica durante varias décadas, ya que la sofisticada gama de herramientas genéticas y moleculares han evolucionado constantemente para el análisis de una amplia gama de estudios1,2,3,4. Los aspectos evolutivamente conservados del desarrollo, la homeostasis y la inmunidad innata en D. melanogaster lo han convertido en un valioso organismo modelo para el estudio de diversas enfermedades humanas e insectos5,6. En particular, el papel fundamental del modelo de D. melanogaster para estudiar la inmunidad se ha ejemplificado en gran medida en estudios de moscas adultas. Sin embargo, los estudios de larvas de D. melanogaster también han contribuido al conocimiento actual y han explorado principalmente las respuestas inmunes celulares, específicamente para las infecciones por avispas y nematodos que ocurren a través de la cutícula de insectos7,8,9,10. Las larvas de Drosophila melanogaster poseen tres tipos diferentes de células sanguíneas, llamadas colectivamente hemocitos: plasmatocitos, células cristalinas y lamelocitos11,12,13. Estas células pueden montar una serie de respuestas inmunes cuando las larvas de D. melanogaster están infectadas con patógenos como bacterias, hongos, virus y parásitos14,15,16. Las respuestas inmunes celulares incluyen envolvimiento directo (fagocitosis) de moléculas pequeñas o bacterias, melanización, encapsulación de patógenos más grandes como los huevos parasitoides y producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y sintasas de óxido nítrico (NOS)17,18,19.
En contraste, se han publicado menos estudios sobre el uso del modelo larvario de D. melanogaster para analizar las respuestas inmunes humorales. Esto se debe principalmente a la aplicación de ensayos de alimentación para la infección oral de larvas de D. melanogaster y a varios desafíos asociados con las larvas de microinyección, incluido el manejo preciso de las larvas y el uso adecuado de la microaguja, especialmente durante la penetración20,21. Por lo tanto, el conocimiento limitado de la infección larvaria y las dificultades técnicas (es decir, la alta mortalidad) han hecho que el modelo larvario de D. melanogaster sea difícil de usar. Un modelo larvario tendrá el potencial de identificar nuevos mecanismos moleculares que proporcionarán más información sobre las interacciones huésped-patógeno y la inducción de respuestas inmunes innatas específicas del huésped contra infecciones patógenas.
Aquí se describe en detalle un protocolo simple y eficiente que se puede usar para inyectar larvas de D. melanogaster con varios patógenos, como bacterias. En particular, las larvas de D. melanogaster se utilizan para inyecciones con el patógeno humano Photorhabdus asymbiotica y la bacteria no patógena Escherichia coli. Este método se puede utilizar para la manipulación y el análisis de las respuestas inmunes de D. melanogaster a diversas infecciones microbianas.
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Protocol
1. Cría de moscas
NOTA: El ciclo de vida de D. melanogaster se divide en cuatro etapas: embrión, larva, pupa y adulto. El tiempo de generación con condiciones óptimas de cría en el laboratorio (~ 25 ° C, 60% de humedad y suficiente comida) es de aproximadamente 10 días desde el óvulo fertilizado hasta el adulto eclosionado. Las hembras ponen ~ 100 embriones por día, y la embriogénesis dura aproximadamente 24 h22. Las larvas se someten a tres etapas de desarrollo (instars; L1-L3) en ~4 días (L1 y L2: 24 h, y L3: 48 h). Las primeras larvas de instar comienzan a alimentarse inmediatamente en la superficie del medio. Las larvas del segundo instar excavan en el medio, mientras que las larvas del tercer instar abandonan el medio y deambulan por las paredes del vial, buscando un lugar para pupar durante 24-48 h. La línea D. melanogaster utilizada para este protocolo es Oregon R (FBsn0000276).
- Agregue los alimentos secos que contengan una dieta a base de harina de maíz y soja a un vial estrecho de poliestireno (25 mm x 95 mm) para aumentar un volumen de 1/5 a 2/5. Luego agregue 9 ml de agua y deje que el vial repose durante 1 minuto hasta que la dieta esté completamente hidratada.
- Agregue aproximadamente 10 gránulos de levadura de panadería seca al vial y coloque una mezcla de al menos 20 moscas adultas macho y hembra recién emergidas.
- Incubar el vial a 25 °C sobre una luz de 12:12 h: ciclo fotoperiódico oscuro.
- Para garantizar la progresión del ciclo de vida, revise los viales de mosca diariamente y registre las etapas iniciales de desarrollo.
2. Selección de larvas para la infección
- Seleccione las larvas con un pincel fino (el pelo de camello es el mejor) una vez que alcancen la tercera etapa errante en el día en que se llevará a cabo la infección (Figura 1).
- Lavar las larvas seleccionadas con la solución de Ringer (100 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6,9) en una pequeña placa de Petri (60 mm x 15 mm) al retirarlas de su vial original23.
- Coloque las larvas en papel de filtro (150 mm de diámetro) que esté ligeramente humedecido con alrededor de 5 ml de solución de Ringer en una placa de Petri (100 mm x 15 mm) (Figura 2A).
- Agregue ~ 1 ml de solución de Ringer diariamente al papel de filtro según sea necesario para evitar la sequedad y la desecación larvaria.
3. Preparación bacteriana
- Cultivo de la bacteria P. asymbiotica en medios de agar Luria Bertani (LB) a 28 °C durante 48 h.
- Utilice un gabinete de nivel 2 de bioseguridad para transferir una sola colonia de P. asymbiotica para inocular un cultivo líquido en 10 ml de lb medios.
- Incubar el cultivo líquido de P. asymbiotica durante la noche a 28 °C en un agitador rotativo a 220 rpm.
- Cultiva la bacteria E. coli de manera similar, pero lleva a cabo el crecimiento inicial en medios de agar e incubación de cultivo líquido a 37 °C durante la noche.
- Centrifugar cada cultivo bacteriano durante la noche durante 3 min a 13.000 x g y 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y lave los gránulos bacterianos resultantes tres veces con 10 ml de PBS estéril.
- Centrifugar los pellets de nuevo durante 3 min a 13.000 x g y 4 °C.
- Diluir cada pellet con PBS estéril para ajustar las concentraciones bacterianas a la densidad óptica (600 nm) de 0,25 para P. asimbiótica y 0,015 para E. coli, que corresponden a 100-300 unidades formadoras de colonias por larva de cada preparación bacteriana, utilizando un espectrofotómetro.
4. Preparación del inyector
- Prepare los capilares utilizando tubos capilares de vidrio de 3.5 "y un extractor de micropipetas. Ajuste el instrumento de la siguiente manera: calor: 580; tirón: 143; velocidad: 25; retraso: 1; presión: 500.
- Use pinzas de punto medio dentadas rectas para abrir el capilar de vidrio en el grado que permita la entrega de los tratamientos experimentales mientras causa un daño mínimo a las larvas (Figura 2B). Para optimizar este procedimiento mientras se practican las inyecciones, use la solución de Trypan Blue (diluya el stock 0.4% con PBS a 0.2%) para rastrear fácilmente las fugas durante la inyección y la supervivencia de las larvas azules.
- Llene el capilar con aceite mineral con una jeringa plástica desechable de 20 ml con una aguja hipodérmica (22 G, 25 mm de longitud).
- Configure el inyector de nanolitros y expulse el aceite fuera del capilar (Figura 2C).
- Llene el capilar con la preparación bacteriana deseada para inyección. Tome la solución de una gota (~ 20 μL) que se coloca en la película para. En este protocolo, se inyectaron 50,2 nL de dos reservas bacterianas.
5. Inyección de larvas
- Anestesiar las larvas de D. melanogaster usando dióxido de carbono durante ~ 2 minutos antes del procedimiento.
- Transfiera suavemente las larvas anestesiadas a un papel de filtro humedecido en la solución de Ringer en preparación para la inyección bajo un estereomicroscopio. Las larvas estarán letárgicas o pasivas en este punto.
- Para inyectar larvas, aplique una presión firme en el lado dorsal del extremo posterior (los espiráculos traqueales son evidentes en el extremo posterior frente a las piezas bucales negras en el extremo anterior) usando fórceps (Figura 2D).
- Inserte la aguja horizontalmente hacia el extremo posterior de las larvas, cerca de la cutícula. Una inyección exitosa no resultará en una fuga de la solución inyectada de las larvas (Figura 3).
- Retire los fórceps que se utilizaron para aplicar presión sobre la cola de las larvas antes de retirar la aguja. Si no se retiran primero, los fórceps pueden forzar la hemolinfa y / o el intestino fuera de las larvas del sitio de la herida.
- Infectar el número apropiado de larvas para el estudio que se está realizando. En este protocolo en particular, se inyectaron 20 larvas para cada condición experimental.
- Usando fórceps, transfiera suavemente las larvas inyectadas a un papel de filtro húmedo separado en una placa de Petri (10 larvas por plato) o un vial de alimentos (dependiendo del propósito del experimento) para permitir la recuperación.
- Coloque las placas de Petri o los viales de alimentos en una incubadora a 25 °C. Si las larvas se mantienen en una placa de Petri, agregue la solución de Ringer según sea necesario para evitar la desecación.
6. Registro de la supervivencia/mortalidad
- Registre el número de larvas de D. melanogaster muertas y vivas de acuerdo con los puntos de tiempo experimentales establecidos. Las larvas vivas continuarán desarrollándose en pupas y adultos.
- Utilice programas estadísticos, como Prism, para ingresar los datos brutos de supervivencia / mortalidad, analizarlos con la prueba log-rank (Mantel-Cox) y representar los resultados en cifras.
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Representative Results
Cuando se realizan correctamente, las inyecciones de larvas de D. melanogaster muestran un efecto específico de la bacteria. Los datos de supervivencia se recogieron en varios puntos temporales tras las infecciones por P. asymbiotica (cepa ATCC43943), E. coli (cepa K12) y PBS (Figura 4). Mientras que las larvas de D. melanogaster son susceptibles a P. asymbiotica, que compromete la supervivencia rápidamente, las larvas inyectadas con controles de E. coli o PBS exhiben supervivencias prolongadas24,25,26. En particular, en comparación con las larvas infectadas con P. asymbiotica, que exhiben una tasa de supervivencia del 57% 24 h después de la inyección, las larvas inyectadas con E. coli muestran una tasa de supervivencia del 85% en el mismo punto de tiempo.
Figura 1: Selección de larvas de Drosophila melanogaster para inyección. El ciclo de vida de Drosophila melanogaster, desde la fertilización del óvulo hasta la vida adulta, dura aproximadamente 10 días. Durante el crecimiento larvario, las larvas se alimentan hasta que están listas para pupar y cambiar a adultos. Para los experimentos de inyección, se seleccionan las larvas de tercera instar, que abandonan el medio de cultivo y deambulan por las paredes del vial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representación del procedimiento de inyección larvaria de Drosophila melanogaster . (A) Las larvas errantes del tercer instar se seleccionan, se lavan con la solución de Ringer y se colocan en papel de filtro en una placa de Petri en preparación para la inyección. (B) Usando fórceps, el capilar de vidrio se rompe para permitir la entrega de los tratamientos experimentales. (C) El inyector de nanolitro programable se configura en preparación para la inyección bajo un estereomicroscopio. (D) Para inyectar larvas, se aplica presión en el lado dorsal de la cola de las larvas usando fórceps. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ilustración de la entrega de células bacterianas en larvas de Drosophila melanogaster a través de microinyección. El lado dorsal del extremo posterior se estabiliza con fórceps. Luego, el capilar se inserta horizontalmente hacia el extremo posterior de las larvas, cerca de la cutícula. Después de la inyección, los fórceps se retiran antes de retirar cuidadosamente el capilar para evitar la fuga de hemolinfa del sitio de la herida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Supervivencia de larvas de Drosophila melanogaster después de la inyección de bacterias patógenas y no patógenas. A las larvas de Oregon R de D. melanogaster se les inyectó 50,2 nL de Photorhabdus asymbiotica (ATCC43943), Escherichia coli (K12) o PBS. Mientras que los controles de PBS y E. coli no mostraron importancia en las proporciones de supervivencia, las inyecciones de P. asymbiotica comprometieron rápidamente la supervivencia de las moscas. Cada curva de supervivencia se compone de mediciones de tres ensayos independientes, cada uno de los cuales incluye 20 larvas (*** p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Drosophila melanogaster es uno de los modelos manipulados experimentalmente más valiosos utilizados para las investigaciones de la inmunidad innata y la patogénesis de diversas infecciones microbianas. Esto se debe a su ciclo de vida simple y rápido, mantenimiento simple en un laboratorio, genética evolutiva bien establecida y diversa caja de herramientas genéticas. Los métodos anteriores de inyecciones de larvas de D. melanogaster, como el uso de un dispositivo microfluídico híbrido o un micromanipulador de Narishige, requieren equipos altamente especializados y pueden ser costosos21,27. En el protocolo actual, para ampliar el uso de D. melanogaster, se describe una técnica de inyección simple que representa un método eficiente y rápido para entregar bacterias en el hemocoel de las larvas de D. melanogaster. La parte esencial de la técnica descrita aquí es la inyección real del patógeno deseado u otras sustancias líquidas utilizando un microinyector. Además de describir esta operación esencial, también describimos métodos accesorios como el cultivo y cultivo de bacterias y el manejo de materiales.
La principal ventaja de este método es que la aguja se mantiene aproximadamente paralela a la larva, y la retención se realiza con muy poca presión sobre la larva, lo que reduce la posibilidad de fuga de hemolinfa, lesiones fatales o entrega inadecuada de la sustancia deseada. Luego, la aguja se inserta hacia el extremo posterior de la larva para completar la inyección. La forma precisa de sostener la larva, la forma de insertar la aguja, la velocidad a la que se inyecta la sustancia deseada y la dirección de extracción de la aguja son cuestiones que se pueden mejorar mejor con la práctica. El paso más difícil de superar es retirar la aguja de la larva sin ninguna fuga resultante de órganos esenciales. Sin embargo, con precisión y experiencia, la dificultad encontrada durante este paso se vuelve menor.
Esta técnica también es una excelente herramienta en múltiples aplicaciones para introducir una variedad de sustancias de manera uniforme que se pueden repetir varias veces, lo que permite resultados consistentes. La rápida mortalidad observada en larvas infectadas por P. asymbiotica refleja la alta virulencia de esta cepa bacteriana a insectos24,25,26. P. asymbiotica está bien documentada para expresar genes de virulencia durante la infección que aumentan la supervivencia bacteriana y la patogenicidad contra los huéspedes de insectos al inhibir la migración de hemocitos y la fagocitosis24,25. También se espera que las larvas sean resistentes a las inyecciones con las cepas bacterianas no patógenas de E. coli, así como a las inyecciones con PBS, confirmando así los resultados previos en este campo de investigación26. Por lo tanto, la microinyección se logra sin ningún efecto adverso sobre la viabilidad animal, lo que permite su uso en estudios moleculares e inmunológicos para explorar la patogénesis de una amplia gama de infecciones microbianas.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad George Washington (GWU) por la lectura crítica del manuscrito. GT fue apoyado a través de una beca de verano Harlan de GWU. Todas las figuras gráficas se hicieron utilizando BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes - plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
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