Summary
As moscas adultas de Drosophila melanogaster têm sido amplamente utilizadas como organismos modelo para investigar os mecanismos moleculares subjacentes às respostas imunes inatas antimicrobianas e estratégias de infecção microbiana. Para promover o estágio da larva D. melanogaster como um sistema modelo adicional ou alternativo, uma técnica de injeção larval é descrita.
Abstract
O uso de modelos não convencionais para estudar imunidade inata e virulência patógena fornece uma alternativa valiosa aos modelos mamíferos, que podem ser caros e levantar questões éticas. Modelos não convencionais são notoriamente baratos, fáceis de manusear e cultura, e não tomam muito espaço. Eles são geneticamente favoráveis e possuem sequências completas de genoma, e seu uso não apresenta considerações éticas. A mosca-das-frutas Drosophila melanogaster, por exemplo, forneceu grandes insights sobre uma variedade de pesquisas de comportamento, desenvolvimento, metabolismo e imunidade. Mais especificamente, d. melanogaster moscas adultas e larvas possuem várias reações de defesa inatas que são compartilhadas com animais vertebrados. Os mecanismos que regulam as respostas imunológicas têm sido revelados principalmente através de estudos genéticos e moleculares no modelo D. melanogaster . Aqui é fornecida uma nova técnica de injeção larval, que promoverá ainda mais investigações de processos imunológicos inatos em larvas de D. melanogaster e explorará a patogênese de uma ampla gama de infecções microbianas.
Introduction
O melanogaster de Drosophila tem sido imensamente utilizado em pesquisas biológicas e biomédicas por várias décadas, uma vez que o sofisticado conjunto de ferramentas genéticas e moleculares tem evoluído constantemente para análise de uma ampla gama de estudos1,2,3,4. Os aspectos evolutivamente conservados do desenvolvimento, da homeostase e da imunidade inata em D. melanogaster tornaram-no um valioso organismo modelo para estudar várias doenças humanas e insetos5,6. Notavelmente, o papel fundamental do modelo D. melanogaster para estudar imunidade tem sido em grande parte exemplificado em estudos de moscas adultas. No entanto, estudos de larvas de D. melanogaster também contribuíram para o conhecimento atual e exploraram principalmente as respostas imunes celulares, especificamente para infecções por vespas e nematoides que ocorrem através da cutícula de inseto7,8, 9,10. As larvas de melanogaster de Drosophila possuem três tipos diferentes de células sanguíneas, coletivamente chamadas de hemócitos: plasmatócitos, células cristalinas e lamellocitos11,12,13. Essas células podem montar uma série de respostas imunes quando as larvas de D. melanogaster são infectadas com patógenos como bactérias, fungos, vírus e parasitas14,15,16. As respostas imunes celulares incluem o engolamento direto (fagocitose) de pequenas moléculas ou bactérias, melanização, encapsulamento de patógenos maiores, como ovos parasitoides, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e sintetizadores de óxido nítrico (NOS)17,18,19.
Em contraste, menos estudos foram publicados sobre o uso do modelo larval D. melanogaster para analisar respostas imunes humorais. Isso se deve principalmente à aplicação de ensaios alimentares para infecção oral de larvas D. melanogaster e vários desafios associados a larvas de microinjeção, incluindo o manuseio preciso de larvas e o uso adequado do microacle, especialmente durante a penetração20,21. Assim, o conhecimento limitado da infecção larval e das dificuldades técnicas (ou seja, alta mortalidade) têm dificultado o uso do modelo larval de D. melanogaster. Um modelo larval terá o potencial de identificar novos mecanismos moleculares que fornecerão mais insights sobre as interações hospedeiro-patógeno e a indução de respostas imunes inatas específicas de hospedeiro contra infecções patogênicas.
Aqui um protocolo simples e eficiente que pode ser usado para injetar larvas D. melanogaster com vários patógenos, como bactérias, é descrito em detalhes. Em particular, as larvas de D. melanogaster são usadas para injeções com o patógeno humano Photorhabdus asymbiotica e as bactérias não patogênicas Escherichia coli. Este método pode ser usado para a manipulação e análise das respostas imunes de D. melanogaster a várias infecções microbianas.
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Protocol
1. Criação de moscas
NOTA: O ciclo de vida de D. melanogaster é dividido em quatro estágios: embrião, larva, pupa e adulto. O tempo de geração com condições ideais de criação em laboratório (~25 °C, 60% de umidade e alimento suficiente) é de aproximadamente 10 dias de óvulo fertilizado a adulto fechado. As fêmeas colocam ~100 embriões por dia, e a embriogênese dura cerca de 24 h22. As larvas passam por três estágios de desenvolvimento (instars; L1-L3) em ~4 dias (L1 e L2: 24 h, e L3: 48 h). As primeiras larvas instar começam a se alimentar imediatamente na superfície do meio. Segunda escavação de larvas instar no meio, enquanto a terceira larva instar deixa o meio e vagueia pelas paredes do frasco, procurando um lugar para pupariar por 24-48 h. A linha D. melanogaster usada para este protocolo é Oregon R (FBsn0000276).
- Adicione alimentos secos contendo uma dieta à base de farinha de milho a um frasco estreito de poliestireno (25 mm x 95 mm) a volume aboue de 1/5 a 2/5. Em seguida, adicione 9 mL de água e deixe o frasco descansar por 1 min até que a dieta esteja completamente hidratada.
- Adicione cerca de 10 grânulos de levedura seca ao frasco e coloque uma mistura de pelo menos 20 moscas adultas machos e fêmeas recém-emergidas.
- Incubar o frasco a 25 °C em uma luz de 12:12 h: ciclo fotoperiódico escuro.
- Para garantir a progressão do ciclo de vida, verifique os frascos de mosca diariamente e regise os estágios iniciais de desenvolvimento.
2. Seleção de larvas para infecção
- Selecione larvas com uma escova de tinta fina (o cabelo do camelo é melhor) uma vez que eles chegam ao terceiro estágio instar errante no dia em que a infecção será realizada (Figura 1).
- Lave as larvas selecionadas com a solução de Ringer (100 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6.9) em uma pequena placa de Petri (60 mm x 15 mm) após a remoção de seu frasco original23.
- Coloque as larvas no papel filtro (150 mm de diâmetro) que seja ligeiramente umedecido com cerca de 5 mL de solução de Ringer em uma placa de Petri (100 mm x 15 mm) (Figura 2A).
- Adicione ~1 mL da solução de Ringer diariamente ao papel filtro, conforme necessário, para evitar o ressecamento e a dessecação larval.
3. Preparação bacteriana
- Cultura P. assbiotica bactérias em Luria Bertani (LB) agar media a 28 °C por 48 h.
- Use um gabinete de biossegurança nível 2 para transferir uma única colônia de P. assbiotica para inocular uma cultura líquida em 10 mL de mídia LB.
- Incubar a cultura líquida P. asymbiotica durante a noite a 28 °C em um agitador rotativo definido para 220 rpm.
- Cultura E. coli bactérias de forma semelhante, mas realizam o crescimento inicial em mídia de ágar e incubação de cultura líquida a 37 °C durante a noite.
- Centrifugar cada cultura bacteriana durante a noite por 3 min a 13.000 x g e 4 °C.
- Descarte o sobrenante e lave as pelotas bacterianas resultantes três vezes com 10 mL de PBS estéril.
- Centrifugar as pelotas novamente por 3 min a 13.000 x g e 4 °C.
- Diluir cada pelota com PBS estéril para ajustar concentrações bacterianas à densidade óptica (600 nm) de 0,25 para P. assbiotica e 0,015 para E. coli, que correspondem a 100-300 unidades formando colônias por larva de cada preparação bacteriana, utilizando um espectrofotômetro.
4. Preparação do injetor
- Prepare os capilares usando tubos capilares de vidro de 3,5" e um puxador de micropipette. Defina o instrumento da seguinte forma: calor: 580; puxar: 143; velocidade: 25; atraso: 1; pressão: 500.
- Use fórceps de ponto médio serrilhados retos para abrir o capilar de vidro ao grau que permitirá a entrega dos tratamentos experimentais, causando danos mínimos às larvas (Figura 2B). Para otimizar esse procedimento durante a prática de injeções, use a solução Trypan Blue (diluir o estoque de 0,4% com PBS para 0,2%) para rastrear facilmente o vazamento durante a injeção e a sobrevivência das larvas azuis.
- Encha o capilar com óleo mineral usando uma seringa de plástico, descartável de 20 mL com uma agulha hipodérmica (22 G, 25 mm de comprimento).
- Configure o injetor de nanoliter e ejete o óleo para fora do capilar (Figura 2C).
- Encha o capilar com a preparação bacteriana desejada para injeção. Retire a solução a partir de uma gota (~20 μL) que é colocada no parafilme. Neste protocolo, foram injetados 50,2 nL de dois estoques bacterianos.
5. Injeção de larvas
- Anestesiar as larvas de melanogaster usando dióxido de carbono por ~2 minutos antes do procedimento.
- Transfira suavemente as larvas anestesiadas para um papel filtro umedecido na solução de Ringer em preparação para injeção sob um estereomicroscope. As larvas serão letárgicas ou passivas neste momento.
- Para injetar larvas, aplique pressão firme no lado dorsal da extremidade posterior (os espirros traqueais são aparentes na extremidade posterior versus partes da boca preta na extremidade anterior) usando fórceps (Figura 2D).
- Insira a agulha horizontalmente na extremidade posterior das larvas, perto da cutícula. Uma injeção bem sucedida não resultará em um vazamento da solução injetada a partir das larvas (Figura 3).
- Remova os fórceps que foram usados para aplicar pressão na cauda das larvas antes de retirar a agulha. Se não forem removidos primeiro, os fórceps podem forçar hemoglifos e/ou o intestino para fora das larvas do local da ferida.
- Infecte o número adequado de larvas para o estudo que está sendo realizado. Neste protocolo em particular, foram injetadas 20 larvas para cada condição experimental.
- Usando fórceps, transfira suavemente as larvas injetadas para um papel filtro úmido separado em uma placa de Petri (10 larvas por prato) ou um frasco de alimentos (dependendo do propósito do experimento) para permitir a recuperação.
- Coloque as placas de Petri ou frascos de alimentos em uma incubadora a 25 °C. Se as larvas forem mantidas em uma placa de Petri, adicione a solução de Ringer conforme necessário para evitar a dessacação.
6. Registro de sobrevivência/mortalidade
- Registre o número de larvas mortas e vivas de D. melanogaster de acordo com os pontos de tempo experimentais definidos. Larvas vivas continuarão a se desenvolver em pupas e adultos.
- Utilizar programas estatísticos, como o Prism, para inserir os dados brutos de sobrevivência/mortalidade, analisá-los com o teste de log-rank (Mantel-Cox) e representar os resultados em números.
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Representative Results
Quando realizadas corretamente, as injeções de larvas de D. melanogaster mostram um efeito específico da bactéria. Os dados de sobrevivência foram coletados em vários pontos de tempo após infecções de P. asmbiotica (cepa ATCC43943), E. coli (cepa K12) e PBS (Figura 4). Considerando que as larvas de D. melanogaster são suscetíveis à P. assbiotica, o que compromete a sobrevivência rapidamente, as larvas injetadas com controles E. coli ou PBS apresentam sobrevidas prolongadas24,25,26. Particularmente, em comparação com as larvas infectadas com P. assbiotica, que apresentam uma taxa de sobrevivência de 57% 24 horas após a injeção, as larvas injetadas com E. coli mostram uma taxa de sobrevivência de 85% ao mesmo tempo.
Figura 1: Seleção de larvas de melanogaster de Drosophila para injeção. O ciclo de vida de Drosophila melanogaster, da fertilização de óvulos à vida adulta, leva aproximadamente 10 dias. Durante o crescimento larval, as larvas se alimentam até ficarem prontas para filhotes e mudar para adultos. Para efeitos de experimentos de injeção, são selecionadas as terceiras larvas instar, que deixam o meio da cultura e vagueiam pelas paredes do frasco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação do procedimento de injeção larval de melanogaster de Drosophila . (A) As terceiras larvas instar errantes são selecionadas, lavadas com a solução de Ringer e colocadas em papel filtro em uma placa de Petri em preparação para injeção. (B) Utilizando fórceps, o capilar de vidro é quebrado para permitir a entrega dos tratamentos experimentais. (C) O injetor de nanoliter programável está configurado em preparação para injeção sob um estereótipo. (D) Para injetar larvas, a pressão é aplicada no lado dorsal da cauda das larvas usando fórceps. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ilustração da entrega de células bacterianas em larvas de melanogaster Drosophila através da microinjeção. O lado dorsal da extremidade posterior está estabilizado usando fórceps. Em seguida, o capilar é inserido horizontalmente na extremidade posterior das larvas, perto da cutícula. Após a injeção, os fórceps são removidos antes de retirar cuidadosamente o capilar para evitar o vazamento hemoglifo do local da ferida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Sobrevivência das larvas de melanogaster Drosophila após a injeção de bactérias patogênicas e não patogênicas. As larvas de Oregon R de D. melanogaster foram injetadas com 50,2 nL de Fotorhabdus asymbiotica (ATCC43943), Escherichia coli (K12), ou PBS. Considerando que os controles PBS e E. coli não mostraram significado nas razões de sobrevivência, as injeções de aymbiotica comprometeram rapidamente a sobrevivência das moscas. Cada curva de sobrevivência é composta por medições de três ensaios independentes, cada um incluindo 20 larvas (*** p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Drosophila melanogaster está entre os modelos mais valiosos e experimentalmente manipulados usados para investigações de imunidade inata e patogênese de várias infecções microbianas. Isso se deve ao seu ciclo de vida simples e rápido, simples manutenção em um laboratório, genética evolutiva bem estabelecida e diversa caixa de ferramentas genéticas. Métodos anteriores de injeções de larvas D. melanogaster, como o uso de um dispositivo microfluido híbrido ou um micromanipulador narishige, requerem equipamentos altamente especializados e podem ser caros21,27. No protocolo atual, para expandir o uso de D. melanogaster, uma técnica simples de injeção que representa um método eficiente e rápido para fornecer bactérias no hemocoel das larvas D. melanogaster é delineada. A parte essencial da técnica descrita aqui é a injeção real do patógeno desejado ou outras substâncias líquidas usando um microinjetor. Além de descrever essa operação essencial, também descrevemos métodos acessórios como cultivar e cultivar bactérias e manusear materiais.
A principal vantagem deste método é que a agulha é mantida aproximadamente paralela à larva, e a retenção é feita com muito pouca pressão sobre a larva, reduzindo assim a possibilidade de vazamento de hemoglifo, ferimento fatal ou entrega inadequada da substância desejada. A agulha é então inserida na extremidade posterior da larva para completar a injeção. A maneira precisa de segurar a larva, a forma de inserir a agulha, a velocidade com que a substância desejada é injetada e a direção da retirada da agulha são todos os assuntos que podem ser melhor melhorados pela prática. O passo mais desafiador a ser superado é retirar a agulha da larva sem qualquer vazamento resultante de órgãos essenciais. No entanto, com precisão e experiência, a dificuldade encontrada durante esta etapa torna-se menor.
Esta técnica também é uma excelente ferramenta em múltiplas aplicações para introduzir uma variedade de substâncias de forma uniforme que pode ser repetida várias vezes, permitindo assim resultados consistentes. A rápida mortalidade observada em larvas infectadas por P. asymbiotica reflete a alta virulência dessa cepa bacteriana aos insetos24,25,26. P. assbiotica é bem documentado para expressar genes de virulência durante a infecção que aumentam a sobrevivência bacteriana e patogenicidade contra os hospedeiros de insetos, inibindo a migração de hemócitos e a fagocitose24,25. Também esperado, as larvas são resistentes a injeções com as cepas bacterianas não patogênicas de E. coli, bem como injeções com PBS, confirmando assim resultados prévios neste campo de pesquisa26. Assim, a microinjeção é alcançada sem qualquer efeito adverso sobre a viabilidade animal, permitindo seu uso em estudos moleculares e imunológicos para explorar a patogênese de uma ampla gama de infecções microbianas.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade George Washington (GWU) pela leitura crítica do manuscrito. GT foi apoiado através de uma bolsa de verão Harlan da GWU. Todas as figuras gráficas foram feitas usando BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes - plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
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