Denne protokol beskriver en metode til at generere reproducerbare, småskala konstruerede lungevæv ved at genbefolke decellulariserede præcisionsskårne lungeskiver med alveolære epiteltype 2-celler, fibroblaster og endotelceller.
Der er behov for forbedrede 3-dimensionelle (3D) lungemodeller, der rekapitulerer den arkitektoniske og cellulære kompleksitet af den indfødte lungealveolus ex vivo. Nyligt udviklede organoidmodeller har lettet udvidelsen og undersøgelsen af lungeepitel-forfædre in vitro, men disse platforme er typisk afhængige af musetumorafledt matrix og / eller serum og inkorporerer kun en eller to cellulære slægter. Her beskriver vi en protokol til generering af manipulerede lungevæv (ELT’er) baseret på multi-lineage recellularisering af decellulariserede præcisionsskårne lungeskiver (PCLS). ELT’er indeholder alveolære strukturer bestående af alveolær epitel, mesenchym og endotel inden for et ekstracellulært matrix (ECM) substrat, der ligner meget for den indfødte lunge. For at generere vævene oppustes rottelunger med agarose, skæres i 450 μm tykke skiver, skæres i strimler og decellulariseres. De resulterende acellulære ECM-stilladser gensås derefter med primære endotelceller, fibroblaster og alveolære epitelceller type 2-celler (AEC2’er). AEC2’er kan opretholdes i ELT-kultur i mindst 7 dage med et serumfrit, kemisk defineret vækstmedium. Gennem vævsforberedelses- og dyrkningsprocessen klippes skiverne i et kassettesystem, der letter håndtering og standardiseret cellesåning af flere ELT’er parallelt. Disse ELT’er repræsenterer en organotypisk kulturplatform, der skal lette undersøgelser af celle-celle- og cellematrixinteraktioner inden for alveolus såvel som biokemiske signaler, der regulerer AEC2’er og deres niche.
Alveoler er de funktionelle enheder i den distale lunge, der omfatter et net af gasudvekslingsluftrum foret med alveolære epitelceller af type 1 (AEC1’er) og type 2-celler (AEC2’er). Bag epitelet er et tæt netværk af kapillærer samt understøttende mesenchym, alt understøttet af et ekstracellulært matrix (ECM) stillads, der giver både styrke og fleksibilitet til disse sarte luftsække1. Alveolerne er også skadestedet i adskillige lungepatologier, herunder idiopatisk lungefibrose2, akut respiratorisk nødsyndrom3 og alvorlig coronavirus sygdom-19 (COVID-19)4. Selvom arbejdet i løbet af det sidste årti har afdækket en bemærkelsesværdig plasticitet inden for lungeepitelet, forbliver de mekanismer, der muliggør distal lungereparation i nogle indstillinger – og som udelukker reparation i andre – et område med intens undersøgelse5. Udviklingen af forbedrede in vitro-platforme til modellering af alveolus ville lette studier af alveolær biologi, regenerering og terapi.
AEC2’er fornyer og differentierer sig til AEC1’er og betragtes således som den primære stamcelle i den distale lunge 6,7,8. Disse celler udgør imidlertid en særlig udfordring for in vitro-studier i betragtning af de vanskeligheder, der er forbundet med dyrkning af primære AEC2’er uden tab af fænotype9. I konventionel 2-dimensionel (2D) kultur flader AEC2’er ud og vedtager nogle funktioner i AEC1-lignende celler10. I modsætning hertil understøtter 3D-kulturstrategier, oftest organoider, opretholdelsen af differentierede træk i primære AEC2s 6,11,12 og tillader langvarig dyrkning af pluripotente stamceller (PSC)-afledtE AEC2s13,14. Organoider er blevet brugt til at modellere distal lungeudvikling15, virusinfektion11,15 og AEC2-relateret genetisk sygdom 13,16,17, hvilket muliggør vigtig indsigt i AEC2-biologi og regenerering. Imidlertid omfatter disse kulturmodeller typisk kun en eller to cellulære afstamninger og indlejrer cellerne i gel-type matricer, der ikke rekapitulerer enten arkitekturen eller ECM-substratet for den indfødte lungealveolus.
ECM er en kritisk regulator af cellefænotype og adfærd via molekylære, topologiske og mekaniske signaler; omfatter en nøglekomponent i vævsspecifikke nicher, der regulerer stamcelleskæbne og fungerer som et reservoir, der modulerer tilgængeligheden af lokalt udskilte vækstfaktorer 18,19,20,21. Dyrkning af celler på native ECM kan således øge in vitro-systemers prædiktive kapacitet til at modellere in vivo-vævenes biologi. Decellularisering, en proces, der fjerner cellulært materiale fra væv via vaskemidler, enzymer eller fysiske eller andre metoder, kan i vid udstrækning bevare ECM-stilladset af et indfødt organ, når det udføres omhyggeligt 22,23. Sådanne stilladser kan genbefolkes med celler til 3D biomimetisk kultur. Men mens decellulariserede stilladser i vid udstrækning anvendes til vævstekniske applikationer, har deres anvendelse til rutinemæssig cellekultur været begrænset. Flere tidligere undersøgelser har rapporteret decellularisering og recellularisering af lungeskiver eller små lungevævssegmenter. Ud over proof-of-concept-undersøgelser er 24,25,26, genbefolkede lungeskiver blevet brugt til at studere fibroblast-matrixadhæsion 27,28 og til at undersøge effekten af syge lungematricer på fibroblastfænotype27,29. Med forbedrede teknologier til rådighed til generering af præcisionsskårne vævsskiver kunne decellulariserede lungeskiver tilbyde en bekvem og lille platform til dyrkning af celler, samtidig med at alveolære, luftvejs- og vaskulære understrukturer bevares. Inkorporering af flere celletyper ville muliggøre undersøgelser af celle-celle-interaktioner inden for et fysiologisk relevant 3D-miljø. Der er imidlertid behov for forbedrede strategier for at lette håndteringen af væv gennem hele dyrkningsprocessen og for at sikre kontrolleret og reproducerbar såning af væv med et kendt antal celler.
Her præsenterer vi en protokol til at generere manipuleret lungevæv (ELT’er) ved at genbefolke decellulariserede præcisionsskårne lungeskiver (PCLS) med primære endotelceller, AEC2’er og fibroblaster. I en tilpasning af vores tidligere beskrevne konstruerede hjertevævssystem30 og hele lungedecellulariseringsstrategier 22,31 beskriver vi procedurer til at skære PCLS fra rottelunger og klippe skiverne i genanvendelige vævskulturkassetter, der forenkler og standardiserer nedstrøms manipulationer. Klippede skiver decellulariseres til dannelse af acellulære ECM-stilladser, som genbefolkes i tilpassede frøbade. Lungeskivestilladser bevarer kritiske ECM-komponenter og arkitektur og understøtter væksten af AEC2’er inden for multi-lineage alveolære strukturer i mindst 7 dage. ELT’er repræsenterer et nyt alveolært cokultursystem inden for en fysiologisk relevant 3D-matrix, som skal understøtte udviklingen af lungevævstekniske strategier, samtidig med at de letter grundlæggende biologiske undersøgelser af AEC2’er og alveolus.
Dette papir beskriver brugen af decellulariserede præcisionsskårne lungeskiver som en platform til at generere manipulerede lungevæv in vitro, som indeholder multi-lineage alveolære strukturer. Ved at kombinere strategier, som vi tidligere har udviklet til at genbefolke acellulære ECM-lungestilladser med høj nøjagtighed til hele lungeteknik22,31, med vores robuste system til dyrkning af småskala manipulerede hjertevæv30, muliggør denne protokol brugen af fysiologisk relevant lunge-ECM som et vævskultursubstrat på en repeterbar og moderat gennemstrømningsmåde.
De metoder, der præsenteres her, beskriver ELT-stilladsforberedelse fra rottelunger, som er let opnåelige, kan ekstraheres en bloc med direkte adgang til intakte luftveje for agaroseinflation og er af større størrelse end muselunge. Imidlertid kan lungevæv, der kan oppustes med agarose og udbytteskiver på mindst 9 mm i længden, anvendes inden for dette system. Uanset vævskilde er ensartet inflation af lungevævet med agarose det mest kritiske trin for at sikre succes med nedstrøms vævsskæring, klipning og vævshåndtering. Underinflateret lungevæv har tendens til ikke at skære rent, mens overinflateret væv kan rive under klipning. Efter agarosegelering er passende oppustede vævsområder faste, men giver lidt give, når de forsigtigt presses med tang. For intakte rottelunger fandt vi, at præ-oppustning af de ekstraherede lunger med luft flere gange efterfulgt af agaroseinflation så hurtigt som muligt efter ekstraktion resulterer i de bedste udskæringsresultater og den bedste kvalitet af resulterende vævsstilladser. Det passende volumen agarose skal optimeres empirisk; for en rottelunge er det volumen, der kræves for at puste lungen op til den samlede lungekapacitet, ca. 30 ml/kg dyremasse (f.eks. 10,5 ml agarose til lunger fra en 350 g rotte). For større resekteret lungevæv med mindre ligetil luftvejsadgang (såsom dem fra humane donorer) kan det være nødvendigt med yderligere fejlfinding for at puste vævet op via en bronchus32. Under efterfølgende lungeskæring er udvælgelsen og orienteringen af vævet på stemplet et andet vigtigt skridt til 1) sikre, at skiverne er store nok til at generere vævsstrimler, der kan klippes i vævskulturkassetter og 2) maksimere parenkymalt (alveolær) vævsområde, undtagen store luftveje eller kar.
Klipning af PCLS i vævskulturkassetter kan være et udfordrende trin i starten, men kassetterne forenkler i høj grad vævshåndtering under decellularisering og såning. To potentielle problemer, der kan opstå, er vævsrivning (enten under klipningsprocessen eller under decellularisering) eller vævspositionering i klippene, der resulterer i dårlig nedstrøms såning (f.eks. Ingen såning eller såning lige i enderne). Rivning kan være resultatet af overinflation af agarose, overstrækning af vævet under indsættelse af faner eller efterlader for lidt udhæng til at give tilstrækkeligt vævsgreb, når tapperne indsættes. Bemærk, at skiver, der rives i den ene klipende, kan podes med succes, men de er vanskelige at visualisere under mikroskopet under kultur, da vævet ikke er fladt. Dårlig vævssåning (som den i figur 6C) er sandsynligvis resultatet af, at skiven ikke ligger fladt mellem de to klip og dermed får dårlig kontakt med bunden af såbadet godt, når den vendes på hovedet. En anden mulig årsag er forkert placering af kassetten i bunden af såbadbrønden. Med hensyn til klipning skal du anvende lidt mere spænding i vævet, når du placerer det andet klip for at hjælpe det med at ligge fladt. Nogle skiver har en lille konkavitet; i disse tilfælde klips skiven med den konvekse side opad. Med øvelse oplever vi typisk mislykket såning med færre end 2% skiver.
En begrænsning af denne protokol er kravet om noget specialudstyr – en laserskærer og en 3D-printer – for at generere de indledende materialer til ELT-forberedelse. Men når vævskulturkassetterne og frøbadene er oprettet, kræves der ingen yderligere specielle materialer. Lungeskærings- og decellulariseringstrinnene i ELT-stilladsforberedelse er moderat tidskrævende; Disse trin kan dog udføres på forhånd eller i et antal, der er tilstrækkeligt til at forberede flere forsøg på samme tid. Mange PCLS (>100 hvis optimering til parenkymale regioner) kan skæres fra en enkelt lunge og snap-frosne til senere brug. Mens en enkelt fryse-optøningscyklus kan forårsage mindre ultrastrukturel skade på ECM46, har selv flere fryse-optøningscyklusser vist sig ikke at forårsage et betydeligt tab i ECM23,47. PCLS kan også klippes og decellulariseres forud for et forsøg, der skal bruges inden for en måned. (Især kan den beskrevne decellulariseringsprotokol opnås på cirka 6 timer, hvilket repræsenterer en betydelig fordel i forhold til tidligere beskrevne metoder, der kræver en dag eller mere27,28.) Når stilladserne er forberedt, er cellesåningsprocessen enkel og hurtig, og kulturen af ELT’er kræver ikke specialiserede teknikker.
En advarsel ved den beskrevne ELT-metode er manglen på regionsspecifik såning, dvs. levering af AEC2’er specifikt til det alveolære rum eller endotelceller specifikt til det vaskulære rum. Ikke desto mindre, selvom celler simpelthen er podet oven på vævsstilladserne, er recellulariseringsmønsteret ikke tilfældigt, med en vis form for alveolær organisation, herunder epitelringe. Vi formoder, at celle-celle-interaktioner samt lokale forskelle i ECM-sammensætning og geometri 20,21 sandsynligvis bidrager til de observerede recellulariseringsmønstre. Til støtte for denne hypotese viste en tidligere offentliggjort undersøgelse, hvor fibroblaster blev podet ikke-specifikt på decellulariserede lungeskiver, at mønsteret af vævsrepopulation og tilknyttede cellulære fænotyper varierede signifikant efter mikroskopisk vævsregion og ECM-stilladskilde (f.eks. Sund versus syg)27. Fibroblaster blev også observeret at invadere ind i interstitium – det sted, hvor de bor i naturligt lungevæv 1,27. Den primære alternative metode, som vi kan forestille os at dyrke celler på lungeskiver på en virkelig regionsspecifik måde, ville indebære såning af intakte decellulariserede lunger via luftvejene 31,48 og vaskulære rum49,50 og derefter udskæring af det recellulariserede væv. Dette alternativ 1) er imidlertid betydeligt mere omkostnings-, tids- og ressourcekrævende; 2) er lavere gennemstrømning; 3) kræver et øget antal dyr og 4) er forbundet med en øget risiko for kontaminering på grund af udfordringerne ved hele lungekulturen og efterfølgende udskæring af den podede lunge. Selvom elt-platformen ikke rekapitulerer alle aspekter af native cellulær organisation, muliggør den lungecellekultur på et fysiologisk relevant ECM-substrat på en måde, der er tilgængelig for mange flere laboratorier.
Fleksibiliteten i ELT-systemet er en stor fordel ved denne platform og bør tillade mindre lungevævskultur med et hvilket som helst antal vævsstilladser, celler eller kulturmedier af interesse. Anvendelse af stilladser afledt af sygt væv eller fra skademodeller kan gøre det muligt at undersøge celle-celle- eller cellematrixinteraktioner i forbindelse med sygdomsændret ECM 27,29,51. Bemærk dog, at decellulariseringsprotokollen muligvis skal tilpasses for at tage højde for matrixforskelle mellem art52. Den beskrevne såningsstrategi kan bruges til enhver celletype, og kulturtidslinjen tilpasses forskerens behov. Som udgangspunkt skulle 1 x 106 celler pr. stillads give et stærkt cellulært væv inden for 7 dages dyrkning, mens 1 x 105 celler i alt resulterer i dårlig cellularitet. Ved enhver tilpasning af tidslinjen skal vævskulturkassetterne fjernes fra såbadet 24 timer efter den sidste vævssåning. Her, med det formål at modellere noget af den cellulære kompleksitet af lungealveolus, beskriver vi en tri-kultur recellulariseringsstrategi, der understøtter vedligeholdelsen af veldifferentierede neonatale AEC2’er i alveolære strukturer i mindst 7 dage. Vores resultater viser også den vellykkede indpodning af både fibroblaster og endotelceller inden for ELT’er, hvilket understreger den brede anvendelighed af kultursubstratet og dets egnethed til co-kulturstudier. Såning af voksne celler i ELT’er kan lette modelleringen af mere hvilende alveolære strukturer, mens såning af humane PSC-afledte AEC2’er, herunder dem med genetiske modifikationer, kan lette translationelle undersøgelser af human sygdom13,53. Generelt giver bottom-up-tilgangen, der muliggøres af ELT-platformen, mulighed for at undersøge bestemte celletypers bidrag til aflæsninger af interesse – såsom AEC2-spredning eller differentieringstilstand.
Sammenfattende skitserer denne protokol et robust system til generering af konstrueret lungevæv til samkulturstudier af AEC2’er, fibroblaster og endotelceller i acellulære ECM-lungeskivestilladser. ELT’er repræsenterer en ny 3D-kulturstrategi for primære AEC2’er, som til dato typisk har været afhængige af mindre fysiologiske gel-type matricer for at opretholde en veldifferentieret fænotype 6,11,12. Den nuværende platform bygger på tidligere arbejde i genpopulationen af decellulariserede lungeskiver 24,25,26,27,28,29, men tilbyder flere fordele: 1) et vævskulturkassettesystem for at lette ELT-håndtering under decellularisering, såning og kultur; 2) et tilpasset såbad til præcist at så et kendt antal celler på hvert skivestillads; og 3) en tri-kultur reseeding strategi, der muliggør alveolær væv repopulation med epitel-, mesenkymale og endotelceller. ELT’er repræsenterer således et vigtigt skridt fremad i retning af at skabe reproducerbare in vitro-modeller, der fanger den cellulære og substratkompleksitet af den oprindelige alveolus og AEC2-stamcelleniche.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Lorenzo Sewanan og Jorge Nunez for deres arbejde med at udvikle vævskulturkassettedesignet, der anvendes i denne protokol, Kaminski-laboratoriet til brug af deres vibratom, Maurizio Chioccioli og Jessica Nouws for hjælp med lungeskæring, Allie LaRocco for hjælp med indledende pilotforsøg og Hong Qian for omhyggelig læsning af protokollen. Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud F30HL143880 (K.L.L.), Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) og U01HL145567 (L.E.N.); og ved en ubegrænset forskningsgave fra Humacyte Inc. (L.E.N.).
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |