Bu protokol, desellülarize hassas kesilmiş akciğer dilimlerini alveoler epitel tip 2 hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri ile yeniden doldurarak tekrarlanabilir, küçük ölçekli mühendislik ürünü akciğer dokuları oluşturmak için bir yöntemi açıklar.
Doğal akciğer alveolus ex vivo’nun mimari ve hücresel karmaşıklığını özetleyen geliştirilmiş 3 boyutlu (3D) akciğer modellerine ihtiyaç vardır. Son zamanlarda geliştirilen organoid modeller, akciğer epitel progenitörlerinin in vitro olarak genişlemesini ve incelenmesini kolaylaştırmıştır, ancak bu platformlar tipik olarak fare tümöründen türetilmiş matris ve / veya seruma dayanır ve sadece bir veya iki hücresel soyu içerir. Burada, desellülarize hassas kesimli akciğer dilimlerinin (PCLS) çok soylu resellülarizasyonuna dayanan mühendislik ürünü akciğer dokuları (ELT’ler) üretmek için bir protokol açıklanmaktadır. ELT’ler, doğal akciğerinkine çok benzeyen hücre dışı matriks (ECM) substratı içinde alveoler epitel, mezenkim ve endotelden oluşan alveolar benzeri yapılar içerir. Dokuları oluşturmak için, sıçan akciğerleri agaroz ile şişirilir, 450 μm kalınlığında dilimler halinde dilimlenir, şeritler halinde kesilir ve hücresellikten arındırılır. Elde edilen asellüler ECM iskeleleri daha sonra primer endotel hücreleri, fibroblastlar ve alveoler epitel tip 2 hücreleri (AEC2’ler) ile yeniden tohumlanır. AEC2’ler ELT kültüründe serumsuz, kimyasal olarak tanımlanmış bir büyüme ortamı ile en az 7 gün muhafaza edilebilir. Doku hazırlama ve kültür süreci boyunca, dilimler paralel olarak birden fazla ELT’nin işlenmesini ve standartlaştırılmış hücre tohumlamasını kolaylaştıran bir kaset sistemine kırpılır. Bu ELT’ler, alveol içindeki hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerinin yanı sıra AEC2’leri ve nişlerini düzenleyen biyokimyasal sinyallerin araştırılmasını kolaylaştırması gereken organotipik bir kültür platformunu temsil eder.
Alveoller, distal akciğerin fonksiyonel birimleridir ve alveoler epitel tip 1 hücreleri (AEC1’ler) ve tip 2 hücreleri (AEC2’ler) ile kaplı gaz alışverişi yapan hava sahalarının bir örgüsünü içerir. Epitelin altında yoğun bir kılcal damar ağı ve mezenkimi destekler, hepsi bu hassas hava keseciklerine hem güç hem de esneklik sağlayan hücre dışı bir matris (ECM) iskelesi ile desteklenir1. Alveoller ayrıca idiyopatik pulmoner fibroz2, akut solunum sıkıntısı sendromu3 ve şiddetli koronavirüs hastalığı-19 (COVID-19)4 dahil olmak üzere birçok akciğer patolojisinde yaralanma yeridir. Son on yıldaki çalışmalar akciğer epitelinde dikkate değer bir plastisite ortaya çıkarmış olsa da, bazı ortamlarda distal akciğer onarımını sağlayan – ve diğerlerinde onarımı engelleyen – mekanizmalar yoğun bir araştırma alanı olmaya devam etmektedir5. Alveolusu modellemek için geliştirilmiş in vitro platformların geliştirilmesi, alveolar biyoloji, rejenerasyon ve terapötiklerin çalışmalarını kolaylaştıracaktır.
AEC2’ler kendiliğinden yenilenir ve AEC1’lere farklılaşır ve böylece distal akciğerin birincil kök hücresi olarak kabul edilir 6,7,8. Bununla birlikte, bu hücreler, fenotip9 kaybı olmadan primer AEC2’lerin kültürlenmesiyle ilgili zorluklar göz önüne alındığında, in vitro çalışmaya özel bir zorluk teşkil etmektedir. Geleneksel 2 boyutlu (2D) kültürde, AEC2’ler düzleşir ve AEC1 benzeri hücrelerin bazı özelliklerini benimser10. Buna karşılık, 3D kültür stratejileri, en yaygın organoidler, birincil AEC2s6,11,12’deki farklılaşmış özelliklerin korunmasını destekler ve pluripotent kök hücre (PSC) kaynaklı AEC2s 13,14’ün uzun vadelikültürüne izin verir. Organoidler, distal akciğer gelişimi 15, viral enfeksiyon11,15 ve AEC2 ile ilişkili genetik hastalık13,16,17’yi modellemek için kullanılmış ve AEC2 biyolojisi ve rejenerasyonu hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu kültür modelleri tipik olarak sadece bir veya iki hücresel soydan oluşur ve hücreleri, doğal akciğer alveolusunun mimarisini veya ECM substratını özetleyemeyen jel tipi matrislere gömer.
ECM, moleküler, topolojik ve mekanik ipuçları yoluyla hücre fenotipinin ve davranışının kritik bir düzenleyicisidir; kök hücre kaderini düzenleyen dokuya özgü nişlerin önemli bir bileşenini içerir; ve yerel olarak salgılanan büyüme faktörlerinin kullanılabilirliğini modüle eden bir rezervuar görevi görür 18,19,20,21. Doğal ECM üzerindeki hücrelerin kültürlenmesi, in vivo dokuların biyolojisini modellemek için in vitro sistemlerin prediktif kapasitesini artırabilir. Hücresel materyali deterjanlar, enzimler veya fiziksel veya diğer yöntemlerle dokulardan uzaklaştıran bir işlem olan desellülarizasyon, dikkatli bir şekilde gerçekleştirildiğinde doğal bir organın ECM iskelesini büyük ölçüde koruyabilir22,23. Bu tür iskeleler 3D biyomimetik kültür için hücrelerle yeniden doldurulabilir. Bununla birlikte, desellülarize iskeleler doku mühendisliği uygulamaları için yaygın olarak kullanılırken, rutin hücre kültürü için kullanımları sınırlı kalmıştır. Daha önce yapılan birkaç çalışmada, akciğer dilimlerinin veya küçük akciğer dokusu segmentlerinin desellülarizasyonu ve resellülarizasyonu bildirilmiştir. Kavram kanıtı çalışmaları 24,25,26’ya ek olarak, fibroblast-matriks adezyonu 27,28’i incelemek ve hastalıklı akciğer matrislerinin fibroblast fenotip 27,29 üzerindeki etkisini araştırmak için yeniden doldurulmuş akciğer dilimleri kullanılmıştır. Hassas kesilmiş doku dilimleri oluşturmak için mevcut gelişmiş teknolojilerle, desellülarize akciğer dilimleri, alveolar, hava yolu ve vasküler alt yapıları korurken, hücreleri kültürlemek için uygun ve küçük ölçekli bir platform sunabilir. Birden fazla hücre tipinin dahil edilmesi, fizyolojik olarak ilgili bir 3D ortamda hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesini sağlayacaktır. Bununla birlikte, kültür süreci boyunca dokuların işlenmesini kolaylaştırmak ve bilinen sayıda hücreye sahip dokuların kontrollü ve tekrarlanabilir tohumlanmasını sağlamak için geliştirilmiş stratejilere ihtiyaç vardır.
Burada, desellülarize hassas kesimli akciğer dilimlerini (PCLS) primer endotel hücreleri, AEC2’ler ve fibroblastlarla yeniden doldurarak mühendislik akciğer dokuları (ELT’ler) oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Daha önce tarif edilen mühendislik ürünü kalp dokusu sistemi30 ve tüm akciğer desellülarizasyon-resellülarizasyon stratejilerimiz 22,31’in bir uyarlamasında, PCLS’yi sıçan akciğerlerinden kesmek ve dilimleri aşağı akış manipülasyonlarını basitleştiren ve standartlaştıran yeniden kullanılabilir doku kültürü kasetlerine kırpmak için prosedürleri açıklıyoruz. Kırpılmış dilimler, özelleştirilmiş tohumlama banyolarında yeniden doldurulan asellüler ECM iskeleleri oluşturmak için hücresellikten arındırılır. Akciğer dilim iskeleleri, kritik ECM bileşenlerini ve mimarisini korur ve AEC2’lerin çok soylu alveolar benzeri yapılar içinde büyümesini en az 7 gün boyunca destekler. ELT’ler, fizyolojik olarak ilgili bir 3D matris içinde, akciğer dokusu mühendisliği stratejilerinin gelişimini desteklemesi gereken ve AEC2’lerin ve alveollerin temel biyolojik çalışmalarını kolaylaştıran yeni bir alveolar ko-kültür sistemini temsil eder.
Bu yazıda, desellülarize hassas kesimli akciğer dilimlerinin, çok soylu alveolar benzeri yapılar içeren in vitro mühendislik akciğer dokuları oluşturmak için bir platform olarak kullanımı açıklanmaktadır. Tüm akciğer mühendisliği22,31 için yüksek doğrulukta asellüler ECM akciğer iskelelerini yeniden doldurmak için daha önce geliştirdiğimiz stratejileri, küçük ölçekli mühendislik kalpdokularını kültürlemek için sağlam sistemimizle birleştirerek, bu protokol fizyolojik olarak ilgili akciğer ECM’sinin bir doku kültürü substratı olarak, tekrarlanabilir ve orta verimli bir şekilde kullanılmasını sağlar.
Burada sunulan yöntemler, sıçan akciğerlerinden kolayca ulaşılabilen, agaroz inüflemesi için sağlam hava yollarına doğrudan erişimi olan en blok halinde ekstrakte edilebilen ve fare akciğerinden daha büyük boyutta olan ELT iskele preparatını detaylandırmaktadır. Ancak agaroz ile şişirilebilen ve en az 9 mm uzunluğunda dilimler verebilen herhangi bir akciğer dokusu bu sistem içerisinde kullanılabilir. Doku kaynağından bağımsız olarak, agarozlu akciğer dokusunun homojen şişirilmesi, aşağı akış doku dilimleme, kırpma ve doku işlemenin başarısını sağlamak için en kritik adımdır. Az şişirilmiş akciğer dokusu temiz bir şekilde dilimlenmeme eğilimindedir, aşırı şişirilmiş doku kırpma sırasında yırtılabilir. Agaroz jelasyonunu takiben, uygun şekilde şişirilmiş doku bölgeleri sağlamdır, ancak forseps ile hafifçe bastırıldığında biraz verir. Sağlam sıçan akciğerleri için, ekstrakte edilen akciğerlerin birkaç kez hava ile önceden şişirilmesinin, ardından ekstraksiyondan sonra mümkün olan en kısa sürede agaroz enflasyonunun takip edilmesinin, en iyi dilimleme sonuçları ve ortaya çıkan doku iskelelerinin en iyi kalitesi ile sonuçlandığını bulduk. Uygun agaroz hacminin ampirik olarak optimize edilmesi gerekir; Bir sıçan akciğeri için akciğeri toplam akciğer kapasitesine şişirmek için gereken hacim yaklaşık 30 mL / kg hayvan kütlesidir (örneğin, 350 g’lık bir sıçandan akciğerler için 10.5 mL agaroz). Daha az basit hava yolu erişimine sahip daha büyük rezeke akciğer dokuları için (insan donörlerinden gelenler gibi), dokuyu bronş32 yoluyla şişirmek için bazı ek sorun giderme gerekli olabilir. Sonraki akciğer dilimleme sırasında, piston üzerindeki dokunun seçimi ve oryantasyonu, 1) dilimlerin doku kültürü kasetlerine kırpılabilecek doku şeritleri oluşturacak kadar büyük olmasını sağlamak ve 2) büyük hava yolları veya damarlar hariç parankimal (alveolar) doku alanını en üst düzeye çıkarmak için bir başka önemli adımdır.
PCLS’yi doku kültürü kasetlerine kırpmak başlangıçta zor bir adım olabilir, ancak kasetler desellülarizasyon ve tohumlama sırasında doku kullanımını büyük ölçüde basitleştirir. Ortaya çıkabilecek iki potansiyel sorun, doku yırtılması (kırpma işlemi sırasında veya hücresellikten arındırma sırasında) veya klipslerde zayıf aşağı akış tohumlamasına neden olan doku konumlandırmasıdır (örneğin, tohumlama yok veya sadece uçlarda tohumlama). Yırtılma, agaroz aşırı şişirilmesinin, sekme yerleştirme sırasında dokunun aşırı gerilmesinin veya tırnakları yerleştirirken yeterli doku tutuşu sağlamak için çok az çıkıntı bırakmanın bir sonucu olabilir. Bir klips ucunda yırtılan dilimlerin başarılı bir şekilde tohumlanabileceğini, ancak doku düz olmadığı için kültür sırasında mikroskop altında görselleştirilmesinin zor olduğunu unutmayın. Zayıf doku tohumlaması ( Şekil 6C’deki gibi) muhtemelen dilimin iki klips arasında düz durmamasının ve böylece baş aşağı çevrildiğinde tohumlama banyosunun tabanıyla zayıf temas etmesinin sonucudur. Diğer bir olası neden, kasetin tohumlama banyosunun dibinde yanlış oturmasıdır. Kırpma açısından, düz durmasına yardımcı olmak için ikinci klipsi yerleştirirken dokuya biraz daha fazla gerginlik uygulayın. Bazı dilimler hafif bir konkaviteye sahiptir; Bu durumlarda dilimi dışbükey tarafı yukarı bakacak şekilde kırpın. Uygulamada, tipik olarak% 2’den daha az dilimle başarısız tohumlama yaşarız.
Bu protokolün bir sınırlaması, ELT hazırlığı için ilk malzemeleri üretmek için bazı özel ekipmanların – bir lazer kesici ve bir 3D yazıcı – gerekliliğidir. Bununla birlikte, doku kültürü kasetleri ve tohumlama banyoları oluşturulduktan sonra, ek özel materyallere gerek yoktur. ELT iskele preparasyonunun akciğer dilimleme ve desellülarizasyon adımları orta derecede zaman alıcıdır; ancak, bu adımlar önceden veya aynı anda birden fazla deneye hazırlanmak için yeterli sayıda gerçekleştirilebilir. Birçok PCLS (parankimal bölgeler için optimize edilirse >100) tek bir akciğerden kesilebilir ve daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. Tek bir donma-çözülme döngüsü ECM46’da küçük ultrayapısal hasara neden olabilirken, birden fazla donma-çözülme döngüsünün bile ECM 23,47’de önemli bir kayba neden olmadığı gösterilmiştir. PCLS ayrıca bir ay içinde kullanılmak üzere bir deneyden önce kırpılabilir ve hücreselden arındırılabilir. (Özellikle, açıklanan hücreselleştirme protokolü yaklaşık 6 saat içinde gerçekleştirilebilir, bu da bir gün veya daha fazla gerektiren daha önce açıklanan yöntemlere göre önemli bir avantaj sağlar27,28.) İskeleler hazırlandıktan sonra, hücre tohumlama işlemi basit ve hızlıdır ve ELT kültürü özel teknikler gerektirmez.
Tanımlanan ELT yönteminin bir uyarısı, bölgeye özgü tohumlamanın olmaması, yani AEC2’lerin özellikle alveoler boşluğa veya endotel hücrelerinin özellikle vasküler boşluğa verilmesidir. Bununla birlikte, hücreler basitçe doku iskelelerinin üzerine tohumlanmasına rağmen, resellülarizasyon paterni, epitel halkaları da dahil olmak üzere alveolar benzeri organizasyonun bir benzerliği ile rastgele değildir. Hücre-hücre etkileşimlerinin yanı sıra ECM bileşimi ve geometri20,21’deki yerel farklılıkların, gözlemlenen resellülarizasyon paternlerine katkıda bulunduğundan şüpheleniyoruz. Bu hipotezi desteklemek için, fibroblastların spesifik olmayan bir şekilde desellülarize akciğer dilimlerine tohumlandığı daha önce yayınlanmış bir çalışma, doku repopulasyonu ve ilişkili hücresel fenotiplerin paterninin mikroskobik doku bölgesi ve ECM iskele kaynağı (örneğin, sağlıklı ve hastalıklı) ile önemli ölçüde değiştiğini göstermiştir27. Fibroblastların ayrıca interstisiyuma invaze olduğu gözlendi – doğal akciğer dokusunda bulundukları yer 1,27. Akciğer dilimleri üzerindeki hücreleri gerçekten bölgeye özgü bir şekilde kültürlemek için hayal edebileceğimiz birincil alternatif yöntem, bozulmamış desellülarize akciğerlerin hava yolu31,48 ve vasküler bölmeler 49,50 yoluyla tohumlanmasını ve daha sonra resellülarize dokunun dilimlenmesini gerektirecektir. Bununla birlikte, bu alternatif 1) önemli ölçüde daha fazla maliyet, zaman ve kaynak yoğundur; 2) daha düşük verimdir; 3) artan sayıda hayvan gerektirir; ve 4) tüm akciğer kültürünün zorlukları ve daha sonra tohumlanmış akciğerin dilimlenmesi nedeniyle artan kontaminasyon riski ile ilişkilidir. Doğal hücresel organizasyonun tüm yönlerini özetlemese de, ELT platformu, fizyolojik olarak ilgili bir ECM substratı üzerinde, daha birçok laboratuvarın erişebileceği bir şekilde akciğer hücre kültürünü mümkün kılar.
ELT sisteminin esnekliği bu platformun önemli bir avantajıdır ve herhangi bir sayıda doku iskelesi, hücre veya kültür ortamı ile küçük ölçekli akciğer dokusu kültürüne izin vermelidir. Hastalıklı dokudan veya yaralanma modellerinden türetilen iskelelerin kullanılması, hastalıkla değiştirilmiş ECM 27,29,51 ortamında hücre-hücre veya hücre-matris etkileşimlerinin incelenmesine izin verebilir. Bununla birlikte, desellülarizasyon protokolünün,52. türler arasındaki matris farklılıklarını hesaba katmak için uyarlanması gerekebileceğini unutmayın. Açıklanan tohumlama stratejisi, herhangi bir hücre tipi için kullanılabilir ve kültür zaman çizelgesi, araştırmacının ihtiyaçlarına uyacak şekilde uyarlanmıştır. Başlangıç noktası olarak, iskele başına 1 x 106 hücre, kültürden sonraki 7 gün içinde yüksek hücresel bir doku vermelidir, oysa 1 x 105 toplam hücre zayıf hücreselliğe neden olur. Zaman çizelgesinin herhangi bir adaptasyonunda, doku kültürü kasetleri, son doku tohumlamasından 24 saat sonra tohumlama banyosundan çıkarılmalıdır. Burada, akciğer alveolünün hücresel karmaşıklığının bir kısmını modellemek amacıyla, alveolar benzeri yapılarda iyi diferansiye yenidoğan AEC2’lerin en az 7 gün boyunca korunmasını destekleyen üç kültürlü bir resellülarizasyon stratejisi tanımlamaktayız. Sonuçlarımız ayrıca, ELT’ler içindeki hem fibroblastların hem de endotel hücrelerinin başarılı bir şekilde engraftasyonunu göstererek, kültür substratının geniş uygulanabilirliğini ve ko-kültür çalışmaları için uygunluğunu vurgulamaktadır. ELT’lerde yetişkin hücrelerin tohumlanması, daha sessiz alveolar yapıların modellenmesini kolaylaştırabilirken, genetik modifikasyonları olanlar da dahil olmak üzere insan PSC kaynaklı AEC2’lerin tohumlanması, insan hastalığının translasyonel çalışmalarını kolaylaştırabilir13,53. Genel olarak, ELT platformu tarafından sağlanan aşağıdan yukarıya yaklaşım, belirli hücre tiplerinin AEC2 proliferasyonu veya farklılaşma durumu gibi ilgi çekici okumalara katkılarını araştırma fırsatı sunar.
Özetle, bu protokol, asellüler ECM akciğer dilim iskeleleri içindeki AEC2’lerin, fibroblastların ve endotel hücrelerinin ko-kültür çalışmaları için tasarlanmış akciğer dokuları üretmek için sağlam bir sistemi özetlemektedir. ELT’ler, birincil AEC2’ler için yeni bir 3D kültür stratejisini temsil eder; bunlar, bugüne kadar iyi farklılaşmış bir fenotip 6,11,12’yi korumak için tipik olarak daha az fizyolojik jel tipi matrislere güvenmiştir. Mevcut platform, desellülarize akciğer dilimlerinin 24,25,26,27,28,29 yeniden popülasyonunda yapılan önceki çalışmalara dayanmaktadır, ancak çeşitli avantajlar sunmaktadır: 1) desellülarizasyon, tohumlama ve kültür sırasında ELT kullanımını kolaylaştırmak için bir doku kültürü kaset sistemi; 2) Her dilim iskelesinde bilinen sayıda hücreyi tam olarak tohumlamak için özelleştirilmiş bir tohumlama banyosu; ve 3) epitelyal, mezenkimal ve endotel hücreleri ile alveoler doku repopulasyonunu sağlayan bir üçlü kültür yeniden tohumlama stratejisi. Bu nedenle, ELT’ler, doğal alveolus ve AEC2 kök hücre nişinin hücresel ve substrat karmaşıklığını yakalayan tekrarlanabilir in vitro modeller oluşturmaya yönelik önemli bir adımı temsil etmektedir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Lorenzo Sewanan ve Jorge Nunez’e bu protokolde kullanılan doku kültürü kaset tasarımını geliştiren çalışmaları için, vibratomlarının kullanımı için Kaminski laboratuvarına, akciğer dilimleme konusunda yardım için Maurizio Chioccioli ve Jessica Nouws’a, ilk pilot deneylerde yardım için Allie LaRocco’ya ve protokolün dikkatli bir şekilde okunması için Hong Qian’a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma NIH hibeleri F30HL143880 (K.L.L.), Tıbbi Bilim İnsanı Eğitim Programı Eğitim Hibe T32GM136651 (KLL) ve U01HL145567 (L.E.N.) tarafından desteklenmiştir; ve Humacyte Inc.’den (L.E.N.) sınırsız bir araştırma hediyesi ile.
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |