Этот протокол описывает иммуноферментный анализ для обнаружения спорозоитов слюнных желез у комаров. Используя легкодоступные моноклональные антитела, этот метод позволяет экономично и с высокой пропускной способностью обнаруживать комаров, переносящих Plasmodium falciparum или Plasmodium vivax. Метод подходит для исследований передачи малярии, в том числе для обследования переносчиков.
Спорозоиты Plasmodium являются инфекционной стадией малярийных паразитов, которые заражают человека. Спорозоиты, обитающие в слюнных железах самок комаров Anopheles, передаются человеку через укусы комаров во время кормления кровью. Таким образом, наличие спорозоитов в слюнных железах комаров определяет заразность комаров. Чтобы определить, является ли комар Anopheles переносчиком спорозоитов Plasmodium, метод иммуноферментного анализа (ИФА) был стандартным инструментом для обнаружения белка Plasmodium circumsporozoite (CSP), основного поверхностного белка спорозоитов. В этом методе голову вместе с грудной клеткой каждого комара отделяют от брюшка, гомогенизируют и подвергают многофункциональному тесту ИФА для обнаружения присутствия CSP, специфичного для Plasmodium falciparum и каждого из двух подтипов, VK210 и VK247, Plasmodium vivax. Этот метод был использован для изучения передачи малярии, включая сезонную динамику инфекции комаров и виды основных переносчиков малярии в исследуемых районах.
Plasmodium sporozoites являются инфекционной стадией малярийных паразитов у комаров. Спорозоиты попадают к человеку через укусы комаров. У комаров спорозоиты сначала образуются внутри ооцист на стенке средней кишки. Когда они готовы, они выпускаются в гемоцел и отправляются в слюнные железы комаров. Там они созревают и становятся готовыми к передаче человеку во время кормления кровью. У человека спорозоиты откладываются в дерме. Затем они попадают в кровеносный сосуд и путешествуют по циркуляции крови, чтобы достичь печени, чтобы установить инфекцию в гепатоцитах 1,2.
Для определения спорозоитной инфекции слюнных желез комаров использовались три различных метода. Первый метод – вскрытие слюнных желез с последующим непосредственным исследованием спорозоитов под световым микроскопом. Этот метод является золотым стандартом для обнаружения и количественного определения спорозоитов в слюнных железах комаров Anopheles 3. Тем не менее, для этого требуется техник, хорошо обученный как вскрытию, так и микроскопическому исследованию. Более того, он не может быть использован для определения видов Plasmodium и подтипирования CSP (для P. vivax)4,5. Второй метод использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для обнаружения ДНК плазмодия в верхней части тела комара6. Учитывая специфичность ПЦР, возможны как виды, так и подтипы паразита 7,8,9,10. Хотя ПЦР используется все чаще, для этого требуется относительно дорогое оборудование и хорошо обученный персонал. Последний метод, ИФА для обнаружения специфичного для Plasmodium циркумспорозоитного белка (CSP), был основным в течение трех десятилетий 11,12,13. CSP присутствует как в спорозоитах ооцист, так и в спорозоитах слюнных желез12,14. Используя специфические антитела, этот метод позволяет идентифицировать виды Plasmodium и подтипировать ЦСП спорозоитов P. vivax. Обоснованием для этого анализа является требование простого высокопроизводительного анализа для изучения большого количества диких комаров для понимания передачи малярии (т.е. определения уровня заражения спорозоитами).
Метод ИФА имеет два ключевых преимущества перед микроскопическим исследованием. Во-первых, это позволяет исследователям хранить образцы комаров до тех пор, пока они не будут готовы к обработке образцов. Во-вторых, метод ИФА может быть использован для дифференцировки видов Plasmodium с помощью видоспецифичных моноклональных антител. Кроме того, ИФА может вместить большее количество образцов комаров, что позволяет обеспечить гораздо более высокуюпроизводительность15. По сравнению с ПЦР, которая обнаруживает ДНК спорозоита, процедура ИФА занимает больше времени, но стоит дешевле16. Описанный здесь анализ ИФА был разработан для определения инфекционности комаров и отдельного обнаружения CSP P. falciparum и каждого из двух вариантов CSP P. vivax, VK210 и VK247. Этот метод ИФА использовался во многих исследованиях для определения сезонной динамики инфекции комаров и выявления видов основных переносчиков малярии в полевых условиях 12,13,17,18. Для проведения этого анализа достаточно стандартной лаборатории, оснащенной планшетным считывателем ИФА.
Общий подход кратко изложен на рисунке 1. В этом сэндвич-ИФА первичное (захватывающее) моноклональное антитело (mAb), специфичное для каждого вида/подтипа Plasmodium , сначала используется для покрытия планшета ИФА. Каждая пластина покрыта одним захватным mAb. Функция mAb заключается в захвате соответствующего антигена CSP в гомогенатах комаров. После захвата антигена и промывки планшетов второе CSP-специфичное антитело, меченное пероксидазой, используется для обнаружения присутствия CSP, связанного с захватом mAb. Химическая реакция, катализируемая пероксидазой, приводит к развитию цветности в скважинах, положительных на CSP.
CSP-ELISA представляет собой высокоспецифичный и экономически эффективный метод обнаружения Plasmodium CSP. Это позволяет проводить различие между P. falciparum и P. vivax спорозоитами, а также между двумя подтипами, VK210 и VK247, P vivax 11,13,14,15.</s…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим г-на Киракорн Киатибутр, MVRU, за обучение и руководство. Мы также благодарим г-жу Пиньяпат Коннгнген, MVRU, за ее техническую помощь в подготовке рисунка 2. Эта работа была поддержана грантом Национального института аллергии и инфекционных заболеваний и Национального института здравоохранения (U19 AI089672).
Equipment | |||
ELISA plate reader | BioTek Instrument, Inc. | Synergy H1 | Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode |
Grinder pestle | Axygen | PES-15-B-SI | For homogenizing the mosquito head/thorax |
Reagents | |||
ABTS substrate 2-component | KPL | 50-62-00 | For peroxidase driven detection |
Blocking buffer (BB) | Note: solution | ||
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs) | Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.) | ||
Casein | Sigma aldrich | 9000-71-9 | For blocking buffer preparation |
Grinding buffer (GB) | Note: solution | ||
Igepal CA-630 | Sigma aldrich | 9002-93-1 | For grinding buffer preparation |
KCl | Sigma aldrich | 7447-40-7 | For phosphate buffer saline preparation |
KH2PO4 | Sigma aldrich | 7778-77-0 | For phosphate buffer saline preparation |
Na2HPO4 | Sigma aldrich | 7558-79-4 | For phosphate buffer saline preparation |
NaCl | Sigma aldrich | 7647-14-5 | For phosphate buffer saline preparation |
NaOH | Sigma aldrich | 1310-73-2 | For blocking buffer preparation |
PBS-Tween | |||
Pf capture mAb | CDC | Pf-CAP | For capturing Pf circumsporozoite protein |
Pf peroxidase mAb | CDC | Pf-HRP | For detecting Pf circumsporozoite protein |
Pf positive control | CDC | Pf-PC | Pf positive control |
Phenol red | Sigma aldrich | 143-74-8 | For blocking buffer preparation |
Phosphate buffered saline (PBS) | Note: solution | ||
Positive controls | Note: solution | ||
Pv210 capture mAb | CDC | Pv210-CAP | For capturing Pv210 circumsporozoite protein |
Pv210 peroxidase mAb | CDC | Pv210-HRP | For detecting Pv210 circumsporozoite protein |
Pv210 positive control | CDC | Pv210-PC | Pv210 positive control |
Pv247 capture mAb | CDC | Pv247-CAP | For capturing Pv247 circumsporozoite protein |
Pv247 peroxidase mAb | CDC | Pv247-HRP | For detecting Pv247 circumsporozoite protein |
Pv247 positive control | CDC | Pv247-PC | Pv247 positive control |
Tween20 | Sigma aldrich | 9005-64-5 | For PBS-Tween preparation |
Consumables | |||
Disposable pipetting reservoirs | Generic | For working reagents | |
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVS | Corning Life Science | 2797 | For ELISA |
Gloves: disposable gloves and freezer gloves | Generic | For personal protection | |
Lab gown | Generic | for personal protection | |
Multichannel Pipette P30-300 | Generic | For solution transfer | |
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000 | Generic | For solution transfer | |
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µL | Generic | For solution transfer | |
Serological pipettes 5 mL, 10 mL | Generic | For solution transfer | |
Transfer pipettes | Generic | For solution transfer |