Summary

Обнаружение спорозоитов Plasmodium у комаров Anopheles с помощью иммуноферментного анализа

Published: September 30, 2021
doi:

Summary

Этот протокол описывает иммуноферментный анализ для обнаружения спорозоитов слюнных желез у комаров. Используя легкодоступные моноклональные антитела, этот метод позволяет экономично и с высокой пропускной способностью обнаруживать комаров, переносящих Plasmodium falciparum или Plasmodium vivax. Метод подходит для исследований передачи малярии, в том числе для обследования переносчиков.

Abstract

Спорозоиты Plasmodium являются инфекционной стадией малярийных паразитов, которые заражают человека. Спорозоиты, обитающие в слюнных железах самок комаров Anopheles, передаются человеку через укусы комаров во время кормления кровью. Таким образом, наличие спорозоитов в слюнных железах комаров определяет заразность комаров. Чтобы определить, является ли комар Anopheles переносчиком спорозоитов Plasmodium, метод иммуноферментного анализа (ИФА) был стандартным инструментом для обнаружения белка Plasmodium circumsporozoite (CSP), основного поверхностного белка спорозоитов. В этом методе голову вместе с грудной клеткой каждого комара отделяют от брюшка, гомогенизируют и подвергают многофункциональному тесту ИФА для обнаружения присутствия CSP, специфичного для Plasmodium falciparum и каждого из двух подтипов, VK210 и VK247, Plasmodium vivax. Этот метод был использован для изучения передачи малярии, включая сезонную динамику инфекции комаров и виды основных переносчиков малярии в исследуемых районах.

Introduction

Plasmodium sporozoites являются инфекционной стадией малярийных паразитов у комаров. Спорозоиты попадают к человеку через укусы комаров. У комаров спорозоиты сначала образуются внутри ооцист на стенке средней кишки. Когда они готовы, они выпускаются в гемоцел и отправляются в слюнные железы комаров. Там они созревают и становятся готовыми к передаче человеку во время кормления кровью. У человека спорозоиты откладываются в дерме. Затем они попадают в кровеносный сосуд и путешествуют по циркуляции крови, чтобы достичь печени, чтобы установить инфекцию в гепатоцитах 1,2.

Для определения спорозоитной инфекции слюнных желез комаров использовались три различных метода. Первый метод – вскрытие слюнных желез с последующим непосредственным исследованием спорозоитов под световым микроскопом. Этот метод является золотым стандартом для обнаружения и количественного определения спорозоитов в слюнных железах комаров Anopheles 3. Тем не менее, для этого требуется техник, хорошо обученный как вскрытию, так и микроскопическому исследованию. Более того, он не может быть использован для определения видов Plasmodium и подтипирования CSP (для P. vivax)4,5. Второй метод использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для обнаружения ДНК плазмодия в верхней части тела комара6. Учитывая специфичность ПЦР, возможны как виды, так и подтипы паразита 7,8,9,10. Хотя ПЦР используется все чаще, для этого требуется относительно дорогое оборудование и хорошо обученный персонал. Последний метод, ИФА для обнаружения специфичного для Plasmodium циркумспорозоитного белка (CSP), был основным в течение трех десятилетий 11,12,13. CSP присутствует как в спорозоитах ооцист, так и в спорозоитах слюнных желез12,14. Используя специфические антитела, этот метод позволяет идентифицировать виды Plasmodium и подтипировать ЦСП спорозоитов P. vivax. Обоснованием для этого анализа является требование простого высокопроизводительного анализа для изучения большого количества диких комаров для понимания передачи малярии (т.е. определения уровня заражения спорозоитами).

Метод ИФА имеет два ключевых преимущества перед микроскопическим исследованием. Во-первых, это позволяет исследователям хранить образцы комаров до тех пор, пока они не будут готовы к обработке образцов. Во-вторых, метод ИФА может быть использован для дифференцировки видов Plasmodium с помощью видоспецифичных моноклональных антител. Кроме того, ИФА может вместить большее количество образцов комаров, что позволяет обеспечить гораздо более высокуюпроизводительность15. По сравнению с ПЦР, которая обнаруживает ДНК спорозоита, процедура ИФА занимает больше времени, но стоит дешевле16. Описанный здесь анализ ИФА был разработан для определения инфекционности комаров и отдельного обнаружения CSP P. falciparum и каждого из двух вариантов CSP P. vivax, VK210 и VK247. Этот метод ИФА использовался во многих исследованиях для определения сезонной динамики инфекции комаров и выявления видов основных переносчиков малярии в полевых условиях 12,13,17,18. Для проведения этого анализа достаточно стандартной лаборатории, оснащенной планшетным считывателем ИФА.

Общий подход кратко изложен на рисунке 1. В этом сэндвич-ИФА первичное (захватывающее) моноклональное антитело (mAb), специфичное для каждого вида/подтипа Plasmodium , сначала используется для покрытия планшета ИФА. Каждая пластина покрыта одним захватным mAb. Функция mAb заключается в захвате соответствующего антигена CSP в гомогенатах комаров. После захвата антигена и промывки планшетов второе CSP-специфичное антитело, меченное пероксидазой, используется для обнаружения присутствия CSP, связанного с захватом mAb. Химическая реакция, катализируемая пероксидазой, приводит к развитию цветности в скважинах, положительных на CSP.

Protocol

1. Приготовление реагентов ПРИМЕЧАНИЕ: Список оборудования, реагентов и других расходных материалов, используемых в данном протоколе, см. в Таблице материалов, а список растворов и их состав см. в Таблице 1 . Захват и пероксидаза-конъюгиров?…

Representative Results

Репрезентативные результаты ИФА показаны на рисунке 2. В этом эксперименте методом иммуноферментного анализа P. falciparum была обнаружена спорозоитная инфекция в скважине А7. Положительная лунка может быть визуально обнаружена по ее слабому зеленому цвету (…

Discussion

CSP-ELISA представляет собой высокоспецифичный и экономически эффективный метод обнаружения Plasmodium CSP. Это позволяет проводить различие между P. falciparum и P. vivax спорозоитами, а также между двумя подтипами, VK210 и VK247, P vivax 11,13,14,15.</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим г-на Киракорн Киатибутр, MVRU, за обучение и руководство. Мы также благодарим г-жу Пиньяпат Коннгнген, MVRU, за ее техническую помощь в подготовке рисунка 2. Эта работа была поддержана грантом Национального института аллергии и инфекционных заболеваний и Национального института здравоохранения (U19 AI089672).

Materials

Equipment
ELISA plate reader BioTek Instrument, Inc. Synergy H1 Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode
Grinder pestle Axygen PES-15-B-SI For homogenizing the mosquito head/thorax
Reagents
ABTS substrate 2-component KPL 50-62-00 For peroxidase driven detection
Blocking buffer (BB) Note: solution
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs) Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
Casein Sigma aldrich 9000-71-9 For blocking buffer preparation
Grinding buffer (GB) Note: solution
Igepal CA-630 Sigma aldrich 9002-93-1 For grinding buffer preparation
KCl Sigma aldrich 7447-40-7 For phosphate buffer saline preparation
KH2PO4 Sigma aldrich 7778-77-0 For phosphate buffer saline preparation
Na2HPO4 Sigma aldrich 7558-79-4 For phosphate buffer saline preparation
NaCl Sigma aldrich 7647-14-5 For phosphate buffer saline preparation
NaOH Sigma aldrich 1310-73-2 For blocking buffer preparation
PBS-Tween
Pf capture mAb CDC Pf-CAP For capturing Pf circumsporozoite protein
Pf peroxidase mAb CDC Pf-HRP For detecting Pf circumsporozoite protein
Pf positive control CDC Pf-PC Pf positive control
Phenol red Sigma aldrich 143-74-8 For blocking buffer preparation
Phosphate buffered saline (PBS) Note: solution
Positive controls Note: solution
Pv210 capture mAb CDC Pv210-CAP For capturing Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 peroxidase mAb CDC Pv210-HRP For detecting Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 positive control CDC Pv210-PC Pv210 positive control
Pv247 capture mAb CDC Pv247-CAP For capturing Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 peroxidase mAb CDC Pv247-HRP For detecting Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 positive control CDC Pv247-PC Pv247 positive control
Tween20 Sigma aldrich 9005-64-5 For PBS-Tween preparation
Consumables
Disposable pipetting reservoirs Generic For working reagents
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVS Corning Life Science 2797 For ELISA
Gloves: disposable gloves and freezer gloves Generic For personal protection
Lab gown Generic for personal protection
Multichannel Pipette P30-300 Generic For solution transfer
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000 Generic For solution transfer
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µL Generic For solution transfer
Serological pipettes 5 mL, 10 mL Generic For solution transfer
Transfer pipettes Generic For solution transfer

References

  1. Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
  2. Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
  3. World Health Organization. Division of Malaria and Other Parasitic Diseases. Manual on practical entomology in Malaria, Part I and Part II. World Health Organization. , (1975).
  4. Robert, V., et al. Study of the distribution of circumsporozoite antigen in Anopheles gambiae infected with Plasmodium falciparum, using the enzyme-linked immunosorbent assay. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 82 (3), 389-391 (1988).
  5. Fontenille, D., Meunier, J. Y., Nkondjio, C. A., Tchuinkam, T. Use of circumsporozoite protein enzyme-linked immunosorbent assay compared with microscopic examination of salivary glands for calculation of malaria infectivity rates in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Cameroon. Journal of Medical Entomology. 38 (3), 451-454 (2001).
  6. Echeverry, D. F., et al. Fast and robust single PCR for Plasmodium sporozoite detection in mosquitoes using the cytochrome oxidase I gene. Malaria Journal. 16 (1), 230 (2017).
  7. Singh, B., et al. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60 (4), 687-692 (1999).
  8. Snounou, G. Genotyping of Plasmodium spp. Nested PCR. Methods in Molecular Medicine. 72, 103-116 (2002).
  9. Snounou, G., Singh, B. Nested PCR analysis of Plasmodium parasites. Methods in Molecular Medicine. 72, 189-203 (2002).
  10. Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown, K. N. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Molecular and Biochemical Parasitology. 58 (2), 283-292 (1993).
  11. Wirtz, R. A., et al. Identification of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes using an enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 34 (6), 1048-1054 (1985).
  12. Wirtz, R. A., Burkot, T. R., Graves, P. M., Andre, R. G. Field evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Papua New Guinea. Journal of Medical Entomology. 24 (4), 433-437 (1987).
  13. Wirtz, R. A., Sattabongkot, J., Hall, T., Burkot, T. R., Rosenberg, R. Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for Plasmodium vivax-VK247 sporozoites. Journal of Medical Entomology. 29 (5), 854-857 (1992).
  14. Burkot, T. R., Williams, J. L., Schneider, I. Identification of Plasmodium falciparum-infected mosquitoes by a double antibody enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 33 (5), 783-788 (1984).
  15. Rosenberg, R., et al. Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax. Science. 245 (4921), 973-976 (1989).
  16. Marie, A., et al. Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae. Malaria Journal. 12, 224 (2013).
  17. Arevalo-Herrera, M., et al. Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems. Frontiers in Immunology. 12, 634738 (2021).
  18. Balkew, M., et al. An update on the distribution, bionomics, and insecticide susceptibility of Anopheles stephensi in Ethiopia, 2018-2020. Malaria Journal. 20 (1), 263 (2021).
  19. Wirtz, R. A., Avery, M., Benedict, M., Sutcliffe, A. Plasmodium sporozoite ELISA. Methods in Anopheles Research. , 333-343 (2016).
  20. Durnez, L., et al. False positive circumsporozoite protein ELISA: a challenge for the estimation of the entomological inoculation rate of malaria and for vector incrimination. Malaria Journal. 10, 195 (2011).

Play Video

Cite This Article
Kumpitak, C., Nguitragool, W., Cui, L., Sattabongkot, J., Bantuchai, S. Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (175), e63158, doi:10.3791/63158 (2021).

View Video