Summary

Detektion av Plasmodium Sporozoites i Anopheles-myggor med hjälp av en enzymkopplad immunadsorberande analys

Published: September 30, 2021
doi:

Summary

Detta protokoll beskriver en sandwichenzymkopplad immunadsorberande analys för att detektera spottkörtelsporozoiter hos myggor. Med hjälp av lättillgängliga monoklonala antikroppar möjliggör metoden kostnadseffektiv detektion av myggor som bär på Plasmodium falciparum eller Plasmodium vivax. Metoden är lämplig för forskning om överföring av malaria, inklusive vektorundersökningar.

Abstract

Plasmodium sporozoiter är det infektiösa stadiet av malariaparasiter som infekterar människor. Sporodzoiterna som lever i spottkörtlarna hos honmyggor av honkön överförs till människor via myggbett under blodmatning. Förekomsten av sporozoiter i myggornas spottkörtlar definierar således myggornas smittsamhet. För att avgöra om en Anopheles-mygga bär på Plasmodium sporozoiter har ELISA-metoden (enzyme-linked immunosorbent assay) varit standardverktyget för att detektera Plasmodium circumsporozoite-proteinet (CSP), det huvudsakliga ytproteinet hos sporozoiterna. I denna metod separeras huvudet tillsammans med bröstkorgen hos varje mygga från buken, homogeniseras och utsätts för en sandwich-ELISA för att detektera förekomsten av CSP som är specifik för Plasmodium falciparum och var och en av de två undertyperna, VK210 och VK247, av Plasmodium vivax. Denna metod har använts för att studera överföring av malaria, inklusive den säsongsmässiga dynamiken hos mygginfektioner och arterna av de viktigaste malariavektorerna på studieplatserna.

Introduction

Plasmodium sporozoiter är det infektiösa stadiet av malariaparasiterna hos myggorna. Sporogoiderna överförs till människor via myggbett. Hos myggan bildas sporozoiterna först inuti oocystorna på mitttarmens vägg. När de är klara släpps de ut i hemocoelen och reser till myggornas spottkörtlar. Där mognar de och blir redo för överföring till människor under blodmatning. Hos människor deponeras sporozoiterna i dermis. Sedan kommer de in i blodkärlet och färdas längs blodcirkulationen för att nå levern för att etablera infektion i hepatocyterna 1,2.

Tre olika metoder har använts för att bestämma sporozoitinfektion i myggornas spottkörtlar. Den första metoden är dissektion av spottkörtlarna följt av direkt undersökning av sporozoiter under ett ljusmikroskop. Denna metod är den gyllene standarden för att detektera och kvantifiera sporozoiter i Anopheles-myggans spottkörtlar3. Det kräver dock en tekniker som är väl utbildad i både dissektion och mikroskopisk undersökning. Dessutom kan den inte användas för att bestämma Plasmodium-arter och CSP-subtypning (för P. vivax)4,5. Den andra metoden använder polymeraskedjereaktion (PCR) för att detektera Plasmodium-DNA i den övre delen av myggkroppen6. Med tanke på PCR:s specificitet är både art- och subtypisering av parasiten möjlig 7,8,9,10. Även om PCR används i allt större utsträckning kräver det relativt dyr utrustning och välutbildad personal. Den sista metoden, ELISA, för att detektera det Plasmodium-specifika circumsporozoitproteinet (CSP), har varit stöttepelaren i tre decennier 11,12,13. CSP förekommer i både oocystsporozoiter och spottkörtelsporozoiter12,14. Med hjälp av specifika antikroppar gör denna metod det möjligt att identifiera Plasmodium-arter och CSP-subtypning av P. vivax sporozoiter. Motivet för denna analys är kravet på en enkel analys med hög kapacitet för att undersöka ett stort antal vilda myggor för att förstå malariaöverföring (dvs. bestämma frekvensen av sporozoitinfektion).

ELISA-metoden har två viktiga fördelar jämfört med mikroskopisk undersökning. För det första gör det det möjligt för forskare att behålla myggprover tills de är redo för provbehandling. För det andra kan ELISA-metoden användas för att differentiera Plasmodium-arter genom artspecifika monoklonala antikroppar. Dessutom kan ELISA ta emot ett större antal myggprover, vilket möjliggör en mycket högre genomströmning15. Jämfört med PCR, som detekterar sporozoit-DNA, tar ELISA-proceduren längre tid men kostar mindre16. ELISA-analysen som beskrivs här utvecklades för att bestämma myggans smittsamhet och separat detektera CSP av P. falciparum och var och en av de två CSP-varianterna av P. vivax, VK210 och VK247. Denna ELISA-metod har använts i många studier för att bestämma säsongsdynamiken för mygginfektion och identifiera arten av de viktigaste malariavektorerna i fält 12,13,17,18. För att utföra denna analys räcker det med ett standardlaboratorium utrustat med en ELISA-plattläsare.

Den övergripande strategin sammanfattas i figur 1. I denna sandwich-ELISA används först den primära (infångande) monoklonala antikroppen (mAb) som är specifik för varje Plasmodium-art /subtyp för att belägga ELISA-plattan. Varje platta är belagd med en enda infångning mAb. MaB:s funktion är att fånga upp motsvarande CSP-antigen i mygghomogenaten. Efter antigenavskiljning och tvätt på plattorna används en andra CSP-specifik antikropp märkt med peroxidas för att detektera förekomst av CSP bunden till infångnings-mAb. Den kemiska reaktionen som katalyseras av peroxidas resulterar i färgutveckling i brunnar som är positiva för CSP.

Protocol

1. Beredning av reagenser OBS: Se materialtabellen för en lista över utrustning, reagenser och andra förbrukningsvaror som används i detta protokoll och till tabell 1 för en lista över lösningar och deras sammansättning. Infångning och peroxidaskonjugerade mAbsFör att rekonstituera mAb, återsuspendera det frystorkade mAb:et i en 1:1 blandning av destillerat vatten:glycerol vid 0,5 mg/ml. Gör de alikvoter som behö…

Representative Results

Representativa ELISA-resultat visas i figur 2. I detta experiment påvisade P. falciparum ELISA sporozoitinfektion i brunn A7. Den positiva brunnen kunde visuellt detekteras genom dess svaga gröna färg (Figur 2A). Absorbansvärdet för denna brunn låg över cut-off-tröskeln (två gånger medelvärdet för de fyra negativa kontrollbrunnarna) (figur 2B). Fördelningen av absorbansvärdena för alla 80 okända brunnar visa…

Discussion

CSP-ELISA tillhandahåller en mycket specifik och kostnadseffektiv metod för att detektera Plasmodium CSP. Det gör det möjligt att skilja mellan P. falciparum och P. vivax sporozoiter samt mellan de två subtyperna, VK210 och VK247, av P vivax 11,13,14,15. Vissa kritiska punkter bör övervägas för att uppnå tillförlitliga och reproducerbara resultat. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Kirakorn Kiatibutr, MVRU, för utbildning och vägledning. Vi tackar också Mrs. Pinyapat Kongngen, MVRU, för hennes tekniska hjälp med att förbereda Figur 2. Detta arbete stöddes av ett anslag från National Institute for Allergy and Infectious Diseases och National Institute of Health (U19 AI089672).

Materials

Equipment
ELISA plate reader BioTek Instrument, Inc. Synergy H1 Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode
Grinder pestle Axygen PES-15-B-SI For homogenizing the mosquito head/thorax
Reagents
ABTS substrate 2-component KPL 50-62-00 For peroxidase driven detection
Blocking buffer (BB) Note: solution
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs) Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
Casein Sigma aldrich 9000-71-9 For blocking buffer preparation
Grinding buffer (GB) Note: solution
Igepal CA-630 Sigma aldrich 9002-93-1 For grinding buffer preparation
KCl Sigma aldrich 7447-40-7 For phosphate buffer saline preparation
KH2PO4 Sigma aldrich 7778-77-0 For phosphate buffer saline preparation
Na2HPO4 Sigma aldrich 7558-79-4 For phosphate buffer saline preparation
NaCl Sigma aldrich 7647-14-5 For phosphate buffer saline preparation
NaOH Sigma aldrich 1310-73-2 For blocking buffer preparation
PBS-Tween
Pf capture mAb CDC Pf-CAP For capturing Pf circumsporozoite protein
Pf peroxidase mAb CDC Pf-HRP For detecting Pf circumsporozoite protein
Pf positive control CDC Pf-PC Pf positive control
Phenol red Sigma aldrich 143-74-8 For blocking buffer preparation
Phosphate buffered saline (PBS) Note: solution
Positive controls Note: solution
Pv210 capture mAb CDC Pv210-CAP For capturing Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 peroxidase mAb CDC Pv210-HRP For detecting Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 positive control CDC Pv210-PC Pv210 positive control
Pv247 capture mAb CDC Pv247-CAP For capturing Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 peroxidase mAb CDC Pv247-HRP For detecting Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 positive control CDC Pv247-PC Pv247 positive control
Tween20 Sigma aldrich 9005-64-5 For PBS-Tween preparation
Consumables
Disposable pipetting reservoirs Generic For working reagents
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVS Corning Life Science 2797 For ELISA
Gloves: disposable gloves and freezer gloves Generic For personal protection
Lab gown Generic for personal protection
Multichannel Pipette P30-300 Generic For solution transfer
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000 Generic For solution transfer
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µL Generic For solution transfer
Serological pipettes 5 mL, 10 mL Generic For solution transfer
Transfer pipettes Generic For solution transfer

References

  1. Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
  2. Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
  3. World Health Organization. Division of Malaria and Other Parasitic Diseases. Manual on practical entomology in Malaria, Part I and Part II. World Health Organization. , (1975).
  4. Robert, V., et al. Study of the distribution of circumsporozoite antigen in Anopheles gambiae infected with Plasmodium falciparum, using the enzyme-linked immunosorbent assay. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 82 (3), 389-391 (1988).
  5. Fontenille, D., Meunier, J. Y., Nkondjio, C. A., Tchuinkam, T. Use of circumsporozoite protein enzyme-linked immunosorbent assay compared with microscopic examination of salivary glands for calculation of malaria infectivity rates in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Cameroon. Journal of Medical Entomology. 38 (3), 451-454 (2001).
  6. Echeverry, D. F., et al. Fast and robust single PCR for Plasmodium sporozoite detection in mosquitoes using the cytochrome oxidase I gene. Malaria Journal. 16 (1), 230 (2017).
  7. Singh, B., et al. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60 (4), 687-692 (1999).
  8. Snounou, G. Genotyping of Plasmodium spp. Nested PCR. Methods in Molecular Medicine. 72, 103-116 (2002).
  9. Snounou, G., Singh, B. Nested PCR analysis of Plasmodium parasites. Methods in Molecular Medicine. 72, 189-203 (2002).
  10. Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown, K. N. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Molecular and Biochemical Parasitology. 58 (2), 283-292 (1993).
  11. Wirtz, R. A., et al. Identification of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes using an enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 34 (6), 1048-1054 (1985).
  12. Wirtz, R. A., Burkot, T. R., Graves, P. M., Andre, R. G. Field evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Papua New Guinea. Journal of Medical Entomology. 24 (4), 433-437 (1987).
  13. Wirtz, R. A., Sattabongkot, J., Hall, T., Burkot, T. R., Rosenberg, R. Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for Plasmodium vivax-VK247 sporozoites. Journal of Medical Entomology. 29 (5), 854-857 (1992).
  14. Burkot, T. R., Williams, J. L., Schneider, I. Identification of Plasmodium falciparum-infected mosquitoes by a double antibody enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 33 (5), 783-788 (1984).
  15. Rosenberg, R., et al. Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax. Science. 245 (4921), 973-976 (1989).
  16. Marie, A., et al. Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae. Malaria Journal. 12, 224 (2013).
  17. Arevalo-Herrera, M., et al. Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems. Frontiers in Immunology. 12, 634738 (2021).
  18. Balkew, M., et al. An update on the distribution, bionomics, and insecticide susceptibility of Anopheles stephensi in Ethiopia, 2018-2020. Malaria Journal. 20 (1), 263 (2021).
  19. Wirtz, R. A., Avery, M., Benedict, M., Sutcliffe, A. Plasmodium sporozoite ELISA. Methods in Anopheles Research. , 333-343 (2016).
  20. Durnez, L., et al. False positive circumsporozoite protein ELISA: a challenge for the estimation of the entomological inoculation rate of malaria and for vector incrimination. Malaria Journal. 10, 195 (2011).

Play Video

Cite This Article
Kumpitak, C., Nguitragool, W., Cui, L., Sattabongkot, J., Bantuchai, S. Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (175), e63158, doi:10.3791/63158 (2021).

View Video