Detta protokoll beskriver en sandwichenzymkopplad immunadsorberande analys för att detektera spottkörtelsporozoiter hos myggor. Med hjälp av lättillgängliga monoklonala antikroppar möjliggör metoden kostnadseffektiv detektion av myggor som bär på Plasmodium falciparum eller Plasmodium vivax. Metoden är lämplig för forskning om överföring av malaria, inklusive vektorundersökningar.
Plasmodium sporozoiter är det infektiösa stadiet av malariaparasiter som infekterar människor. Sporodzoiterna som lever i spottkörtlarna hos honmyggor av honkön överförs till människor via myggbett under blodmatning. Förekomsten av sporozoiter i myggornas spottkörtlar definierar således myggornas smittsamhet. För att avgöra om en Anopheles-mygga bär på Plasmodium sporozoiter har ELISA-metoden (enzyme-linked immunosorbent assay) varit standardverktyget för att detektera Plasmodium circumsporozoite-proteinet (CSP), det huvudsakliga ytproteinet hos sporozoiterna. I denna metod separeras huvudet tillsammans med bröstkorgen hos varje mygga från buken, homogeniseras och utsätts för en sandwich-ELISA för att detektera förekomsten av CSP som är specifik för Plasmodium falciparum och var och en av de två undertyperna, VK210 och VK247, av Plasmodium vivax. Denna metod har använts för att studera överföring av malaria, inklusive den säsongsmässiga dynamiken hos mygginfektioner och arterna av de viktigaste malariavektorerna på studieplatserna.
Plasmodium sporozoiter är det infektiösa stadiet av malariaparasiterna hos myggorna. Sporogoiderna överförs till människor via myggbett. Hos myggan bildas sporozoiterna först inuti oocystorna på mitttarmens vägg. När de är klara släpps de ut i hemocoelen och reser till myggornas spottkörtlar. Där mognar de och blir redo för överföring till människor under blodmatning. Hos människor deponeras sporozoiterna i dermis. Sedan kommer de in i blodkärlet och färdas längs blodcirkulationen för att nå levern för att etablera infektion i hepatocyterna 1,2.
Tre olika metoder har använts för att bestämma sporozoitinfektion i myggornas spottkörtlar. Den första metoden är dissektion av spottkörtlarna följt av direkt undersökning av sporozoiter under ett ljusmikroskop. Denna metod är den gyllene standarden för att detektera och kvantifiera sporozoiter i Anopheles-myggans spottkörtlar3. Det kräver dock en tekniker som är väl utbildad i både dissektion och mikroskopisk undersökning. Dessutom kan den inte användas för att bestämma Plasmodium-arter och CSP-subtypning (för P. vivax)4,5. Den andra metoden använder polymeraskedjereaktion (PCR) för att detektera Plasmodium-DNA i den övre delen av myggkroppen6. Med tanke på PCR:s specificitet är både art- och subtypisering av parasiten möjlig 7,8,9,10. Även om PCR används i allt större utsträckning kräver det relativt dyr utrustning och välutbildad personal. Den sista metoden, ELISA, för att detektera det Plasmodium-specifika circumsporozoitproteinet (CSP), har varit stöttepelaren i tre decennier 11,12,13. CSP förekommer i både oocystsporozoiter och spottkörtelsporozoiter12,14. Med hjälp av specifika antikroppar gör denna metod det möjligt att identifiera Plasmodium-arter och CSP-subtypning av P. vivax sporozoiter. Motivet för denna analys är kravet på en enkel analys med hög kapacitet för att undersöka ett stort antal vilda myggor för att förstå malariaöverföring (dvs. bestämma frekvensen av sporozoitinfektion).
ELISA-metoden har två viktiga fördelar jämfört med mikroskopisk undersökning. För det första gör det det möjligt för forskare att behålla myggprover tills de är redo för provbehandling. För det andra kan ELISA-metoden användas för att differentiera Plasmodium-arter genom artspecifika monoklonala antikroppar. Dessutom kan ELISA ta emot ett större antal myggprover, vilket möjliggör en mycket högre genomströmning15. Jämfört med PCR, som detekterar sporozoit-DNA, tar ELISA-proceduren längre tid men kostar mindre16. ELISA-analysen som beskrivs här utvecklades för att bestämma myggans smittsamhet och separat detektera CSP av P. falciparum och var och en av de två CSP-varianterna av P. vivax, VK210 och VK247. Denna ELISA-metod har använts i många studier för att bestämma säsongsdynamiken för mygginfektion och identifiera arten av de viktigaste malariavektorerna i fält 12,13,17,18. För att utföra denna analys räcker det med ett standardlaboratorium utrustat med en ELISA-plattläsare.
Den övergripande strategin sammanfattas i figur 1. I denna sandwich-ELISA används först den primära (infångande) monoklonala antikroppen (mAb) som är specifik för varje Plasmodium-art /subtyp för att belägga ELISA-plattan. Varje platta är belagd med en enda infångning mAb. MaB:s funktion är att fånga upp motsvarande CSP-antigen i mygghomogenaten. Efter antigenavskiljning och tvätt på plattorna används en andra CSP-specifik antikropp märkt med peroxidas för att detektera förekomst av CSP bunden till infångnings-mAb. Den kemiska reaktionen som katalyseras av peroxidas resulterar i färgutveckling i brunnar som är positiva för CSP.
CSP-ELISA tillhandahåller en mycket specifik och kostnadseffektiv metod för att detektera Plasmodium CSP. Det gör det möjligt att skilja mellan P. falciparum och P. vivax sporozoiter samt mellan de två subtyperna, VK210 och VK247, av P vivax 11,13,14,15. Vissa kritiska punkter bör övervägas för att uppnå tillförlitliga och reproducerbara resultat. …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Kirakorn Kiatibutr, MVRU, för utbildning och vägledning. Vi tackar också Mrs. Pinyapat Kongngen, MVRU, för hennes tekniska hjälp med att förbereda Figur 2. Detta arbete stöddes av ett anslag från National Institute for Allergy and Infectious Diseases och National Institute of Health (U19 AI089672).
Equipment | |||
ELISA plate reader | BioTek Instrument, Inc. | Synergy H1 | Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode |
Grinder pestle | Axygen | PES-15-B-SI | For homogenizing the mosquito head/thorax |
Reagents | |||
ABTS substrate 2-component | KPL | 50-62-00 | For peroxidase driven detection |
Blocking buffer (BB) | Note: solution | ||
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs) | Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.) | ||
Casein | Sigma aldrich | 9000-71-9 | For blocking buffer preparation |
Grinding buffer (GB) | Note: solution | ||
Igepal CA-630 | Sigma aldrich | 9002-93-1 | For grinding buffer preparation |
KCl | Sigma aldrich | 7447-40-7 | For phosphate buffer saline preparation |
KH2PO4 | Sigma aldrich | 7778-77-0 | For phosphate buffer saline preparation |
Na2HPO4 | Sigma aldrich | 7558-79-4 | For phosphate buffer saline preparation |
NaCl | Sigma aldrich | 7647-14-5 | For phosphate buffer saline preparation |
NaOH | Sigma aldrich | 1310-73-2 | For blocking buffer preparation |
PBS-Tween | |||
Pf capture mAb | CDC | Pf-CAP | For capturing Pf circumsporozoite protein |
Pf peroxidase mAb | CDC | Pf-HRP | For detecting Pf circumsporozoite protein |
Pf positive control | CDC | Pf-PC | Pf positive control |
Phenol red | Sigma aldrich | 143-74-8 | For blocking buffer preparation |
Phosphate buffered saline (PBS) | Note: solution | ||
Positive controls | Note: solution | ||
Pv210 capture mAb | CDC | Pv210-CAP | For capturing Pv210 circumsporozoite protein |
Pv210 peroxidase mAb | CDC | Pv210-HRP | For detecting Pv210 circumsporozoite protein |
Pv210 positive control | CDC | Pv210-PC | Pv210 positive control |
Pv247 capture mAb | CDC | Pv247-CAP | For capturing Pv247 circumsporozoite protein |
Pv247 peroxidase mAb | CDC | Pv247-HRP | For detecting Pv247 circumsporozoite protein |
Pv247 positive control | CDC | Pv247-PC | Pv247 positive control |
Tween20 | Sigma aldrich | 9005-64-5 | For PBS-Tween preparation |
Consumables | |||
Disposable pipetting reservoirs | Generic | For working reagents | |
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVS | Corning Life Science | 2797 | For ELISA |
Gloves: disposable gloves and freezer gloves | Generic | For personal protection | |
Lab gown | Generic | for personal protection | |
Multichannel Pipette P30-300 | Generic | For solution transfer | |
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000 | Generic | For solution transfer | |
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µL | Generic | For solution transfer | |
Serological pipettes 5 mL, 10 mL | Generic | For solution transfer | |
Transfer pipettes | Generic | For solution transfer |