Summary

Determinando o papel dos genes materno-expressos no desenvolvimento inicial com crispants maternos

Published: December 21, 2021
doi:

Summary

O desenvolvimento inicial depende de produtos herdados maternalmente, e o papel de muitos desses produtos é atualmente desconhecido. Neste trabalho, descrevemos um protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenótipos de efeito materno em uma única geração.

Abstract

O desenvolvimento precoce depende de um conjunto de fatores maternos incorporados ao ovócito maduro durante a oogênese que desempenham todas as funções celulares necessárias para o desenvolvimento até a ativação do genoma zigótico. Normalmente, o direcionamento genético desses fatores maternos requer uma geração adicional para identificar fenótipos de efeito materno, dificultando a capacidade de determinar o papel dos genes expressos maternalmente durante o desenvolvimento. A descoberta das capacidades de edição bialélica da CRISPR-Cas9 permitiu a triagem de fenótipos embrionários em tecidos somáticos de embriões injetados ou “crispants”, aumentando a compreensão do papel que os genes zigoticamente expressos desempenham nos programas de desenvolvimento. Este artigo descreve um protocolo que é uma extensão do método crispant. Neste método, a edição bialélica de células germinativas permite o isolamento de um fenótipo de efeito materno em uma única geração, ou “crispants maternos”. A multiplexação de RNAs guia para um único alvo promove a produção eficiente de crispants maternos, enquanto a análise de sequência de haploides crispantes maternos fornece um método simples para corroborar lesões genéticas que produzem um fenótipo de efeito materno. O uso de crispants maternos suporta a rápida identificação de genes maternos essenciais expressos, facilitando assim a compreensão do desenvolvimento precoce.

Introduction

Um conjunto de produtos depositados maternalmente (por exemplo, RNAs, proteínas e outras biomoléculas) é necessário para todos os processos celulares iniciais até que o genoma zigótico do embrião seja ativado1. O esgotamento prematuro desses produtos do ovócito é tipicamente letal embrionário. Apesar da importância desses genes no desenvolvimento, o papel de muitos genes expressos maternalmente é atualmente desconhecido. O avanço da tecnologia de edição de genes em peixes-zebra, como o CRISPR-Cas9, possibilita o direcionamento de genes expressos maternalmente 2,3,4. No entanto, a identificação de um fenótipo de efeito materno requer uma geração extra quando comparada a um fenótipo zigótico, necessitando, portanto, de mais recursos. Recentemente, a capacidade de edição bialélica da CRISPR-Cas9 tem sido utilizada para rastrear fenótipos embrionários em tecidos somáticos de embriões injetados (F0), conhecidos como “crispants”5,6,7,8,9,10. A técnica crispante permite a triagem eficiente em termos de recursos de genes candidatos em células somáticas, facilitando a compreensão de aspectos específicos no desenvolvimento. O protocolo descrito neste trabalho permite a identificação de fenótipos de efeito materno, ou “crispants maternos”, em uma única geração11. Este esquema é alcançável pela multiplexação de RNAs guia para um único gene e promovendo eventos de edição bialélica na linha germinativa. Esses embriões crispantes maternos podem ser identificados por fenótipos morfológicos macroscópicas e submetidos à caracterização primária, como marcação para limites celulares e padronização do DNA11. A análise combinada do fenótipo observável e a caracterização molecular básica dos INDELs induzidos permitem a previsão do papel do gene alvo no desenvolvimento inicial.

No peixe-zebra, durante as primeiras 24 h pós-fertilização (hpf), um pequeno grupo de células se desenvolve nas células germinativas primordiais, precursoras da linha germinativa12,13,14,15. Nas garras colocadas por fêmeas F0, a proporção de embriões crispantes maternos recuperados depende de quantas células germinativas contêm um evento de edição bialélico no gene alvo. Em geral, quanto mais cedo o evento de edição ocorrer no embrião, maior a probabilidade de mutações CRISPR-Cas9 serem observadas na linha germinativa. Na maioria dos casos, os fenótipos de embriões crispantes maternos vêm da perda de função nos dois alelos maternos presentes no ovócito em desenvolvimento. À medida que o ovócito termina a meiose, um dos alelos maternos é extrudado do embrião através do corpo polar, enquanto o outro alelo é incorporado ao pronúcleo materno. O sequenciamento de múltiplos haploides crispantes maternos representará uma mistura das mutações (inserções e/ou deleções (INDELs)) presentes na linha germinativa que contribuem para o fenótipo11.

O protocolo a seguir descreve as etapas necessárias para criar mutações CRISPR-Cas9 em genes de efeito materno e identificar o fenótipo correspondente usando uma abordagem materna crispante (Figura 1). A seção um explicará como efetivamente projetar e criar RNAs guia, enquanto as seções dois e três contêm etapas críticas para a criação de crispants maternos por microinjeção. Após a injeção da mistura CRISPR-Cas9, os embriões injetados são rastreados para edições somáticas via PCR (secção quatro). Uma vez que os embriões F0 injetados se desenvolvem e atingem a maturidade sexual, as fêmeas F0 são cruzadas para machos selvagens e seus descendentes são rastreados para fenótipos de efeito materno (seção cinco). A seção seis inclui instruções sobre como fazer haploides crispantes maternos que podem ser combinados com o sequenciamento de Sanger para identificar os INDELs induzidos por CRISPR-Cas9. Além disso, a Discussão contém modificações que podem ser feitas no protocolo para aumentar a sensibilidade e o poder desse método.

Protocol

Nos estudos que levaram ao desenvolvimento deste protocolo, todos os alojamentos e experimentos de peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2). 1. Síntese de RNAs Guia NOTA: Os crispants zigóticos foram criados usando um único RNA guia ou multiplexando múltiplos RNAs guia para um único alvo 5,6,7,8,9,10.<sup class="xr…

Representative Results

A abordagem experimental descrita neste protocolo permite a identificação de fenótipos de efeito materno de forma rápida e eficiente em termos de recursos (Figura 1). Gerando crispants maternos:Ao projetar os quatro RNAs guia para atingir um único gene de efeito materno candidato, deve-se considerar especialmente onde os RNAs guia se ligarão ao DNA. Em geral, todos eles devem ser agrupados com regiões mínimas ou nenhuma sobreposição …

Discussion

O protocolo apresentado neste manuscrito permite a identificação e caracterização molecular primária de um fenótipo de efeito materno em uma única geração, em vez das múltiplas gerações necessárias para técnicas genéticas avançadas e reversas. Atualmente, o papel de muitos genes expressos maternalmente é desconhecido. Essa falta de conhecimento se deve, em parte, à geração extra necessária para visualizar um fenótipo ao identificar genes de efeito materno. No passado, a rápida identificação de ge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos antigos e atuais membros da equipe de criação de animais de laboratório da Pelegri por seu cuidado com a instalação aquática. Também somos gratos pelos comentários e insights sobre o manuscrito de Ryan Trevena e Diane Hanson. O financiamento foi fornecido pela subvenção do NIH à F.P. (GM065303)

Materials

1 M Tris-HCl (pH 8.4) Invirogen 15568025 For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes Any Maker
10 mM dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013 Synthesis of gRNA
100 BP ladder Any Maker For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol Any Maker
100% RNAse free ethanol Any Maker
100ml Beaker Any Maker For IVF
5 M Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit Synthesis of gRNA
70% Ethanol Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID FHC INC 27-30-1 for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds Bulk Reef Supply 255 Fish supplies
CaCl2 MiliporeSigma C7902
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate Thermo Fischer Scientific 13-748B For IVF
Dissecting Forceps Dumont SS For IVF
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14091-09 For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source) Any Maker For IVF
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014 Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x) Any Maker For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1 For PCR mix
Electropheresis Power Supply Any Maker For gel electrophoresis
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Thermo Fischer Scientific E5242956003 for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any Maker
FemtoJet 4i Eppendorf 5252000021 for Microinjection
Fish Net Any Maker Fish supplies
Frozen Brine Shrimp Brine Shrimp Direct Fish supplies
General All Purpose Agarose Any Maker For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves Any Maker
Ice Bucket Any Maker
Instant Ocean salt Any Maker Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL Thermo Fischer Scientific 15-585-011
KCl MiliporeSigma P5405
KH2PO4 MiliporeSigma 7778-77-0
Kimwipes Thermo Fischer Scientific 06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit Thermo Fischer Scientific AM1354 Synthesis of gRNA
Methylene Blue Thermo Fischer Scientific AC414240250 For E3
MgCl2 MiliporeSigma 7791-18-6 For PCR mix
MgSO2·7H2O MiliporeSigma M2773
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds for Microinjection
Micromanipulator Any Maker for Microinjection
Micropipeters Any Maker
Micropipette Puller Sutter P-87 for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes) Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes) Any Maker
Microwave Any Maker
Mineral Oil MiliporeSigma m5904-5ml for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D) Any Maker FDA approved
Na2HPO4 MiliporeSigma S3264
NaCl MiliporeSigma S5886
NaHC03 MiliporeSigma S5761
Nanodrop Any Maker
NaOH MiliporeSigma 567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Ambion AM12450 Synthesis of gRNA
nuclease-free water Any Maker
Paper Towel Any Maker
Pastro Pipettes Any Maker
PCR Strip Tubes Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter Any Maker
Phenol Red solution MiliporeSigma P0290 for Microinjection
Plastic Pestals VWR 47747-358 For IVF
Plastic Spoon Any Maker For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs Brine Shrimp Direct Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit For gel electrophoresis
RNAse AWAY Thermo Fischer Scientific 21-402-178
Scale Any Maker
Sharpie Any Maker
 Spatula Any Maker
Sterile H2O Any Maker For PCR mix
T4 DNA Polymerase NEB M0203 Synthesis of gRNA
Tape Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x Any Maker For gel electrophoresis
Tea Stainer Amazon IMU-71133W Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 Thermo Fischer Scientific B2-12 For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fischer Scientific 09-528-110B For gel electrophoresis
Thermocycler Any Maker
Thermocycler Any Maker
Transilluminator Any Maker
UV lamp UVP Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) For IVF
UV safety glasses Any Maker For IVF
Wash Bottle Thermo Fischer Scientific S39015 Fish supplies
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1 Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-402-11
10 Molar dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013
100 BP ladder Thermo Fischer Scientific 15628019
100% RNAse free ethanol any maker
5m Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box Fisher Scientific 0.625 mm
Agarose any maker
CaCl2 Sigma 10043-52-4
CaCl2, dihydrate Sigma 10035-04-8 E3 Medium
Capillary Tubing Cole-Parmer UX-03010-68 for injection needles
Cas9 Protein Thermo Fischer Scientific A36496
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer any maker
Dissecting Forcepts any maker
Dissecting Microscope any maker
Dissecting Scissors any maker
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fischer Scientific R0611
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips Fischer Scientific 10289651 20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free) any maker
Ethidium Bromide Thermo Fischer Scientific 15585011
Fish Net any maker fine mesh
Frozen Brine Shrimp LiveAquaria CD-12018 fish food
Gel Comb (0.625mm) any maker
Gel Electropheresis System any maker
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle Grainger 21TZ99 https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes any maker
Gloves any maker
Hank's Final Working Solution Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl Sigma 7647-01-0
Ice Bucket any maker
Instant Ocean salt any maker for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script Thermo Fischer Scientific AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water Fisher Scientific 10-977-023
KCl Sigma 7447-40-7 E3 Medium
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit Thermo Fischer Scientific AM1354
methylene blue Fisher Scientific AC414240250 E3 Medium
MgSO2-7H2O Sigma M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips any maker need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips any maker
Micropippetter (100-1000) with tips any maker
Microplastic slide
Microwave any maker
MiliQ Water any maker
mineral oil sigma-aldrich m5904-5ml
Na2HPO4 Sigma
NaCl Sigma S9888
NaHC02 Sigma 223441
Nanodrop
NaOH Sigma 567530
Narrow Spatula any maker
Needle Puller Sutter P-97
Paper Towel any maker
Pastro Pipettes Fisher Scientific 13-678-20A
PCR primer flanking guide site Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Standard desalted
PCR Strip Tubes Thermo Fischer Scientific AB0771W
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875714 10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red Fisher Science S25464 https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips any maker 10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals Fisher Scientific 12-141-364
Plastic Spoon any maker
Primer Guide Site Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade Uline H-595B
RNA gel Loading Dye in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away Fisher 21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water Fisher Scientific 10-977-023
Scale any maker
Sharpie any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested) Sigma S5761 fish water
Sodium Bromide Solotion Sigma E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O any brand
T4 DNA Polymerase NEB M0203S https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X Thermo Fischer Scientific B52 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer amazon IMU-71133W avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette Uline S-24320
Transilluminator
Tricaine fisher scientific NC0872873
Tris HCl 7.5 Thermo Fischer Scientific 15567027
Universal Primer Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lamp UVP
UV safety glasses any maker
Wash Bottle fisher scientific S39015
Zebrafish mating boxes any maker
PCR Buffer Recipe Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes

References

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Cite This Article
Moravec, C. E., Voit, G. C., Pelegri, F. Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants. J. Vis. Exp. (178), e63177, doi:10.3791/63177 (2021).

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