Summary
La gestion de la flétrissure fusarium de la pastèque nécessite la connaissance des races pathogènes présentes. Ici, nous décrivons les méthodes d’inoculation par trempage des racines, d’ensemencement infesté des grains et de barquette modifiée pour démontrer leur efficacité dans le typage racinaire du champignon pathogène Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).
Abstract
La flétrissure de fusarium de la pastèque (Citrullus lanatus), causée par Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), est réapparue comme une contrainte de production majeure dans le sud-est des États-Unis, en particulier en Floride. Le déploiement de stratégies intégrées de lutte antiparasitaire, comme les cultivars résistants spécifiques à la race, nécessite des informations sur la diversité et la densité de population de l’agent pathogène dans les champs des producteurs. Malgré certains progrès dans le développement d’outils de diagnostic moléculaire pour identifier les isolats d’agents pathogènes, la détermination de la race nécessite souvent des approches de bioessai.
Le typage de race a été effectué par inoculation par trempage racinaire, méthode d’ensemencement du noyau infesté et méthode modifiée de barquette avec chacun des quatre différentiels de pastèque (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Les isolats se voient attribuer une désignation de race par calcul de l’incidence de la maladie cinq semaines après l’inoculation. Si moins de 33 % des plantes d’un cultivar particulier étaient symptomatiques, elles étaient classées comme résistantes. Les cultivars dont l’incidence était supérieure à 33 % étaient considérés comme sensibles. Cet article décrit trois méthodes différentes d’inoculation pour déterminer la race, le trempage racinaire, le noyau infesté et l’inoculation modifiée par bac, dont les applications varient selon la conception expérimentale.
Introduction
Les champignons du sol qui composent le complexe d’espèces Fusarium oxysporum (FOSC) sont des agents pathogènes hémibiotrophes des plantes qui peuvent causer de graves maladies et une perte de rendement dans une gamme variée de cultures1. La flétrissure fusarium de la pastèque, causée par F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), a augmenté en portée, en incidence et en gravité dans le monde entier au cours des dernières décennies 2,3. Chez les semis, les symptômes du flétrissement de Fusarium ressemblent souvent à un amortissement. Chez les plantes plus âgées, le feuillage devient gris, chlorotique et nécrotique. Finalement, le flétrissement des plantes progresse vers l’effondrement complet de la plante et la mort4. La perte de rendement directe se produit en raison des symptômes et de la mort de la plante, tandis que la perte de rendement indirecte peut survenir en raison des dommages causés par le soleil par l’élimination de la canopée foliaire5. La reproduction sexuée et les structures reproductrices associées n’ont jamais été observées chez F. oxysporum. Cependant, l’agent pathogène produit deux types de spores asexuées, les micro- et macroconidies, ainsi que des structures de survie plus grandes et à long terme appelées chlamydospores, qui peuvent survivre dans le sol pendant de nombreuses années6.
Le FOSC est classé en formae speciales en fonction des gammes d’hôtes observées, généralement limitées à une ou quelques espèces hôtes1. Bien que des recherches récentes aient indiqué que ce complexe d’espèces peut être un composite de 15 espèces différentes, les espèces particulières qui infectent la pastèque sont actuellement inconnues7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) est le nom des groupes de souches qui infectent exclusivement Citrullus lanatus ou la pastèque domestiquée 8,9. Les souches de F. oxysporum dans la plupart des spécialités pathogènes présentent certains niveaux de diversité en ce qui concerne leurs composants génétiques et leur virulence envers une espèce hôte. Par exemple, une souche peut infecter tous les cultivars d’un hôte, tandis qu’une autre peut n’infecter que les cultivars les plus sensibles. Pour tenir compte de cette variation, ces groupes sont classés de manière informelle en races en fonction de relations évolutives ou de caractéristiques phénotypiques communes. Au sein de Fon, quatre races (0, 1, 2 et 3) ont été caractérisées en fonction de leur pathogénicité par rapport à un ensemble de cultivars de pastèques sélectionnés, la découverte de la race 3 ayant eu lieu récemment10.
Malgré cette diversité apparente, les morphologies des spores ou des hyphes ne sont pas distinguables entre les races de Fon, ce qui signifie que des tests moléculaires ou phénotypiques sont nécessaires pour identifier la race unique11 d’un isolat. La recherche moléculaire a identifié certaines différences génétiques. Par exemple, le rôle des effecteurs sécrétés dans le xylème (SIX) a été étudié pendant des années chez F. oxysporum, et certains de ces effecteurs ont été localisés sur les chromosomes échangés lors du transfert horizontal de gènes12. Par exemple, SIX6 se trouve dans les courses Fon 0 et 1 mais pas dans la course 213. SIX effecteurs ont été impliqués dans la pathogénicité de F. oxysporum f. sp. lycopersici et F. oxysporum f. sp. cubense, qui provoquent la flétrissure de Fusarium sur la tomate et la banane, respectivement 14,15,16,17. L’analyse des profils effecteurs SIX parmi les souches de F. oxysporum f. sp. spiniciae, l’agent pathogène du flétrissement fusarium sur les épinards, a permis une classification qui reflète avec précision la diversité génétique et phénotypique18. Cependant, les différences entre les mécanismes de virulence des races de Fon ne sont actuellement pas entièrement comprises, et les tests moléculaires développés lors de leur utilisation ont montré des résultats incohérents et inexacts19. Par conséquent, les résultats phénotypiques des tests d’infection sont actuellement le meilleur moyen de classer les isolats.
F. oxysporum infecte d’abord les hôtes par les racines avant de remonter le xylème20. Cela fait de l’inoculation directe des racines d’un cultivar hôte donné un moyen efficace d’effectuer le typage de race et constitue la base des méthodes d’inoculation root-dip et tray-dip21. Lorsqu’il n’infecte pas un hôte, F. oxysporum réside dans le sol et peut rester dormant pendant des années. Cultiver des cultivars de pastèque sensibles dans le sol à partir d’un domaine d’intérêt est une façon de tester la présence de Fon. L’extension de cette méthode pour inclure des cultivars de différents niveaux connus de résistance dans un sol délibérément infesté de Fon est également un bon moyen d’effectuer un typage de race (tableau 1) et constitue la base de la méthode d’ensemencement des grains infestés. La méthode modifiée de trempage par plateau est une variante de la méthode originale de trempage par plateau qui permet un typage de course à haut débit où de nombreuses plantes et isolats de champ peuvent être étudiés rapidement22. Les facteurs importants d’un essai biologique rapide et réussi comprennent l’utilisation de cultivars qui ont documenté des différences de résistance aux différentes races d’agents pathogènes, la garantie que l’inoculum est à la fois biologiquement actif et abondant pendant l’infection, le maintien d’un environnement propice à la fois à l’agent pathogène et à l’hôte, et l’utilisation d’un système d’évaluation cohérent de la gravité ou de l’incidence de la maladie. Cet article décrit les méthodes root-dip23,24, infested kernel seeding25,26 et tray-dip22 modifiées pour le typage phénotypique de la race sur la base des principes décrits ci-dessus.
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Protocol
1. Détermination de la race par la méthode root-dip (RDM)
- Préparation de l’environnement expérimental
- Parce que l’expression des symptômes dépend fortement des conditions environnementales, maintenez les plantes dans une zone contrôlée. Surveillez l’humidité relative, la température, la photopériode et l’intensité lumineuse (Figure 1).
- Réglez la température à 26-28 °C, l’humidité relative à 50-75% et réglez une photopériode de 16 h pour assurer une croissance et une santé adéquates des plantes.
REMARQUE: Pour prévenir l’hypoxie, le flétrissement des semis et / ou la pourriture des graines, ne pas trop arroser ou laisser l’eau stagnante autour des semis. - Utilisez deux lampes à tubes fluorescents, chacune avec au moins 1850 lumens de lumière et une température de couleur de 2 800 K par banque de lumières pour soutenir la croissance photosynthétique.
- Gardez la zone propre et utilisez des pratiques hygiéniques, y compris l’enlèvement des déchets de sol et des débris végétaux, pour prévenir les dommages causés par les ravageurs et les infections accidentelles.
- Réglez la température à 26-28 °C, l’humidité relative à 50-75% et réglez une photopériode de 16 h pour assurer une croissance et une santé adéquates des plantes.
- Conditions de plantation
- Remplissez 8 x 16 cellules (25 cm de largeur x 50 cm de longueur) en commençant par des plats avec un milieu de plantation et tapotez vers le bas pour comprimer légèrement le sol (Figure 2).
- Obtenez les graines des quatre cultivars différentiels : Black Diamond/Sugar Baby, Charleston Grey/Allsweet/Dixielee, Calhoun Grey et PI-296341-FR.
- Semez les graines avec leur apex (extrémité pointue) pointant vers le haut à une profondeur égale à leur longueur. Une fois les graines semées, couvrez le milieu contenant les graines enterrées avec 100% de Terre de Fuller ou d’autres argiles bentonites alternatives à une profondeur de 0,3175-0,635 cm.
- Vaporisez les plats pour amortir le milieu sans créer d’eau stagnante ou de mise en commun. Ensuite, gardez le milieu humide en brumisant pendant 20 s toutes les 180 minutes ou en arrosant à la main une fois par jour jusqu’à la germination des graines pendant environ 5 jours. Après la germination, arrosez une fois par jour et au besoin pour soutenir la croissance des semis.
- Préparation des médias
REMARQUE: Les deux milieux sont fermes avec une gélose granulée supplémentaire pour permettre la récolte des spores en grattant la surface.- Milieu de jus V8 clarifié (V8)
- Préparer 500 mL de jus V8 clarifié (V8)27 en ajoutant 100 mL de jus de légumes 100 % original V8 clarifié avec 1 % de CaCO3 à 400 mL d’eau distillée.
- Ajouter 7,5 g de gélose granulée.
- Bien mélanger les ingrédients, autoclaver, et laisser refroidir à 50 °C avant de verser dans des boîtes de Petri stériles.
- Milieu de gélose au dextrose de pomme de terre à quart de force (qPDA)
- Préparer le milieu qPDA en ajoutant 4,5 g de gélose granulée à 500 mL d’eau distillée, ajouter 3,8 g de gélose au dextrose de pomme de terre.
- Bien mélanger les ingrédients, autoclaver, et laisser refroidir à 50 °C avant de verser 12-15 mL dans des boîtes de Petri stériles.
- Milieu de jus V8 clarifié (V8)
- Parce que l’expression des symptômes dépend fortement des conditions environnementales, maintenez les plantes dans une zone contrôlée. Surveillez l’humidité relative, la température, la photopériode et l’intensité lumineuse (Figure 1).
- Préparation de traitements expérimentaux
- Préparez l’inoculum.
- Cinq jours après la plantation (dpp), placer des disques de papier infiltrés (1-1,25 cm de diamètre) contenant l’isolat préféré de F. oxysporum sur une plaque V8 et une plaque qPDA et les stocker dans un incubateur (~28 °C) pendant huit jours28 (Figure 3A).
- Le huitième jour de croissance fongique et la veille de l’inoculation (voir rubrique 1.3.2), transférez les plaques V8 et qPDA de l’incubateur vers une armoire de biosécurité.
- Pour chaque isolat, distribuer 6 mL d’eau désionisée stérilisée sur chaque plaque de culture V8 et qPDA.
- Déloger les conidies en grattant un épandeur de cellules stériles sur la surface moyenne (Figure 3B). Regrouper la suspension cidiale liquide et la transférer dans un tube de culture stérile de 50 mL (figure 3C).
- Répétez ce processus jusqu’à ce que le volume total de suspension cylindrique liquide dans le tube de culture de 50 mL soit d’environ 12 mL.
- Avant de procéder à un autre isolat, stérilisez la zone de travail et l’épandeur de cellules avec de l’alcool. Stérilisez l’épandeur de cellules en le faisant passer à travers un brûleur Bunsen après l’avoir trempé dans de l’éthanol à ≥70%.
- Une fois que les suspensions conidiales liquides ont été transférées dans des tubes de culture pour tous les isolats, quantifiez le nombre de spores. Tout d’abord, vortexez un tube de culture individuel de 50 mL et distribuez 10 μL dans chaque chambre d’un hémacytomètre. Ensuite, calculez le nombre de spores dans l’hémacytomètre comme décrit précédemment29.
- Préparer la solution finale d’inoculum en transférant le volume calculé pour 106 + 10% dans un autre tube de culture stérile et porter le volume total à 30 mL en ajoutant de l’eau désionisée stérile.
- Conservez ces tubes de culture pendant la nuit à 8 ± 1 °C.
REMARQUE: Cela peut être fait sans perte de viabilité conidiale, comme l’indiquent des données non publiées.
- Préparez l’inoculum.
- Inoculation
- Préparez l’inoculation.
- Avant le jour de l’inoculation, arrosez vigoureusement les semis de treize jours à la capacité de charge du sol.
- Préétiquetez les piquets avec des informations pertinentes, y compris l’isolat à tester, le cultivar de pastèque et la date d’inoculation.
- Placez 6 appartements en polystyrène à 12 cellules (20 cm de largeur x 40 cm de longueur), préalablement désinfectés avec 10% d’eau de Javel et bien rincés, pour recevoir les plantes inoculées.
- Prépositionnez tous les matériaux nécessaires (voir le tableau des matériaux).
- Inoculer les racines de la plante.
- Arrosez vigoureusement les plantes plusieurs heures avant le début de l’inoculation. Au moins 2 heures après l’arrosage, retirez les plantules des 8 plaques de polystyrène à 16 cellules et rincez leurs racines pour éliminer les particules de matériel de plantation adhérentes.
- Entreposer temporairement les plantes rincées dans des récipients propres avec de l’eau du robinet jusqu’à leur utilisation, en gardant les cultivars séparés les uns des autres (figure 4A). Séparez les plantules en groupes de six individus et gardez les groupes de semis enveloppés dans des serviettes en papier humides sur un plateau de laboratoire pour éviter la dessiccation.
- Placez 25-30 cm3 de terre dans le fond de chaque cellule du plateau en polystyrène 6 x 12 et utilisez une bouteille de gicleurs pour mouiller le sol jusqu’à ce qu’il soit visiblement humide.
- Inoculez les plantes et replantez-les dans l’ordre selon le cultivar, de sorte que Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, puis PI 296341 01 FR soient plantés de gauche à droite.
- En commençant par le contrôle sain, placez un groupe de six plants non endommagés du même cultivar dans les tubes de 50 mL contenant l’inoculum. Dans le cas du contrôle sain, utilisez de l’eau du robinet au lieu d’une suspension de spores. Inoculez les plantes avec le contrôle positif (Fon race 3) en dernier.
- Une fois à l’intérieur du tube, assurez-vous que les racines de la plante atteignent et sont exposées à l’inoculum (eau du robinet).
- Vortex des tubes avec des racines de plantules immergées pendant 30 s (Figure 4B). Après le vortex, placez une seule plantule par cellule dans les 6 x 12 plats en polystyrène. Placez les plantes du même cultivar dans la même colonne du plateau.
- Après la mise en place, désinfectez les mains gantées en les tenant dans des seaux de solution de chlore disponible à 0,7% pendant 30 s, suivi d’un rinçage à l’eau du robinet pendant 1 min.
- Ensuite, couvrez les plantules placées avec du milieu de plantation et fixez doucement. À l’aide d’une seringue ou d’une pipette, arrosez soigneusement les plantules de 20 mL par plantule tout en évitant les éclaboussures.
- Avant de passer à la prochaine série de plantes, désinfectez à nouveau les mains gantées à l’aide d’une solution de chlore et d’un rinçage à l’eau du robinet.
- Une fois que toutes les plantules ont été replantées, arrosez-les à nouveau au minimum pour éviter le ruissellement de l’inoculum.
- Conservez les plantules pendant la nuit dans un environnement clos et sombre avec une température moyenne de 27 ° C. Le lendemain, transférez les plantes dans la serre, en maintenant la température moyenne à 27 ° C.
- Préparez l’inoculation.
- Entretien et entretien des plantes inoculées
- Pour éviter le débordement de l’eau excédentaire, arrosez légèrement les appartements trois fois par jour pendant 4 à 5 jours jusqu’à ce que les plantes se stabilisent.
- Vérifiez les plateaux 2 à 3 fois par jour pendant au moins trois jours pour vous assurer d’une couverture adéquate et uniforme de l’arrosage.
- Évitez le séchage dû à la lumière du soleil ou à l’ombrage en faisant pivoter les appartements et / ou en fournissant un ombrage / arrosage supplémentaire si nécessaire.
- À 3 dpp, fertilisez les plantes avec un engrais à libération rapide 20-20-20 (10 g / 3,78 L) à raison de 3 à 6 mL par litre d’eau.
- Fertilisez chaque semaine pendant 3-4 semaines.
- Maintenez les mêmes conditions d’éclairage et d’environnement tout au long de cette étape.
2. Détermination de la race par la méthode du noyau infesté (IKM)
- Infestation des grains
- Préparez l’inoculum.
- À partir d’un échantillon stocké ou nouvellement prélevé, isolez et cultivez une souche de F. oxysporum f. sp. niveum d’intérêt sur une plaque de qPDA au point que sa croissance couvre la moitié de la plaque.
REMARQUE: Cela démontre qu’il est actif et viable, ce qui est nécessaire pour une infestation importante du grain dans les étapes ultérieures.
- À partir d’un échantillon stocké ou nouvellement prélevé, isolez et cultivez une souche de F. oxysporum f. sp. niveum d’intérêt sur une plaque de qPDA au point que sa croissance couvre la moitié de la plaque.
- Préparez les noyaux.
- Sur une balance, mesurez 200 g de baies de seigle (Secale spp.) (ou de grains de blé Maxie var. (Triticum spp.)) dans un récipient suffisamment grand et versez-les dans une ou plusieurs fioles d’Erlenmeyer en verre de 1 L. Ajouter de l’eau du robinet stérile dans les flacons pour couvrir complètement les grains jusqu’à au moins 5 cm (figure 5A).
- Faire tremper les grains à température ambiante (~24 °C) pendant 2 h. Drainez l’eau des flacons; boucher l’ouverture avec un morceau de rouleau de coton enveloppé dans une étamine; et recouvrir l’ouverture d’une pellicule d’aluminium (Figure 5B).
- Décontaminer les noyaux. Une fois que le grain a absorbé de l’eau, autoclavez-le deux fois de deux manières distinctes pour tuer d’autres microbes indésirables avant l’inoculation.
- Lors de la première fois, autoclavez le grain dans les flacons préparés sur un cycle de gravité (121,2 °C, 1,06 kg/cm2) pendant 1 h avec 5 min de temps de séchage. Laissez les flacons refroidir à température ambiante.
- Avant d’autoclaver la deuxième fois, transférer les grains dans un petit sac de culture de champignons avec un filtre de 0,5 μm. Retirez l’air du sac, puis pliez l’excès de plastique autour du sac.
- Placez le sac dans un bac en plastique, sans danger pour l’autoclave. Couvrez le bac avec une pellicule d’aluminium (Figure 5C).
REMARQUE: N’utilisez pas de bac métallique lors de l’autoclavage des grains dans les sacs, car cela pourrait faire fondre les sacs. - Autoclavez le bac sur un cycle de gravité pendant 1 h avec 5 min de temps de séchage, le même cycle qu’auparavant.
REMARQUE: Ne faites autoclaver le sac que la deuxième fois, pas la première, car le filtre et le port peuvent être compromis si les sacs sont autoclavés deux fois. Empêchez la condensation sur le filtre en laissant les sacs refroidir lentement et complètement avant de les retirer de l’autoclave, car le filtre à manches de culture sera compromis s’il est mouillé.
- Inoculer les noyaux.
- En travaillant avec la plaque de culture et le sac dans une armoire de biosécurité, coupez des disques de gélose de 6 mm de diamètre dans la zone de croissance active de la plaque de culture avec un alésage stérile en liège de taille #4. Dépliez le sac. En utilisant une technique stérile stricte, placez 5 disques de gélose dans le sac. Utilisez un cylindre gradué stérile de 50 mL pour mesurer 35 mL d’eau du robinet stérile et ajoutez-le au sac.
- Roulez un peu l’ouverture du sac, puis vaporisez l’extérieur avec de l’éthanol à 70% pour stériliser la surface.
REMARQUE: Ne vaporisez pas le filtre car cette humidité le compromettra également. - Fermez le sac en pliant les coins vers le centre, puis plus de deux fois au-dessus du filtre. Fixez le sac avec des pinces à sac et des tubes en vinyle transparent fournis par le fabricant.
REMARQUE: Les pinces sont réutilisables. - Retirez le sac de l’armoire de biosécurité.
- Stockez l’agent pathogène pour la croissance.
- Rangez le sac à la verticale. Assurez-vous que le filtre est retiré du côté opposé du sac pour permettre un échange de gaz maximal (Figure 5D).
- Incuber les matériaux à température ambiante pendant environ trois semaines. Redistribuez les grains régulièrement pour assurer une croissance uniforme de l’agent pathogène.
REMARQUE: Les sacs ne sont pas réutilisables.
- Préparez l’inoculum.
- Infection des plants de pastèques par des grains infestés
- Source de graines de pastèque comme décrit précédemment.
- Déterminez les groupes expérimentaux.
REMARQUE : La ou les seules souches de l’agent pathogène requises sont les isolats analysés aux fins de l’identification de la race. Cependant, les contrôles négatifs et positifs aideront à faire des comparaisons avec les plantes sans infection ou avec un niveau spécifique d’infection.- Pour préparer un témoin négatif, utilisez des grains de blé stérilisés selon la méthode mentionnée précédemment, mais sans inoculation.
- Pour préparer un témoin positif, utilisez des grains de blé inoculés avec une souche déjà classée pour comparaison avec l’isolat inconnu.
- Combinez le sol et le grain.
- Mesurez 14 grains de grains infestés dans un grand sac en plastique (figure 5E). Remplissez les pots en plastique (15 cm de diamètre x 10 cm de hauteur) avec du terreau pour mesurer la quantité de mélange nécessaire. Videz le mélange dans le sac. Créez un coussin d’air dans le sac et tordez-le ou scellez-le fermé.
- Mélangez les grains et la terre en inversant le sac plusieurs fois. Pour un contrôle négatif, effectuez le même processus dans un sac différent avec des noyaux propres. Pour un contrôle positif, effectuez le même processus dans un sac différent avec des grains infestés par la souche de comparaison.
- Remplissez quatre pots stérilisés en surface avec le mélange de sol infesté. Pour un contrôle négatif, mettez ce mélange en pot avant de manipuler tout sol contaminé par le Fon.
- Semez les graines de pastèque.
- Semez six graines dans chaque pot. Assurez-vous que chaque pot ne contient que des graines d’un cultivar. Positionnez les graines avec l’extrémité apex de la graine tournée vers le haut pour permettre une croissance appropriée pendant la levée (Figure 6A).
- À l’aide d’un vaporisateur, mouillez les 0,3 à 0,6 cm supérieurs du sol avec de l’eau. Placez un plat en plastique transparent (15 cm de diamètre) sous et sur chaque pot pour créer un environnement humide propice à la germination des graines (figure 6B).
- Établir les conditions de croissance.
- Arrosez les pots trois fois par jour avec un flacon pulvérisateur pour maintenir la turgescence sans ruissellement jusqu’à ce que les graines aient germé (environ 5 jours).
REMARQUE: La quantité d’eau utilisée augmentera avec la taille de la plante et la taille du pot. - Une fois que les graines ont germé, déplacez le plat supérieur sur la face inférieure du pot.
- Arrosez les plantes quotidiennement au besoin pour une croissance optimale des plantes. Exposez les plantes à une photopériode de 16 h dans des conditions d’éclairage similaires à celles décrites précédemment et à une température de 27 °C (± 1 °C).
- Arrosez les pots trois fois par jour avec un flacon pulvérisateur pour maintenir la turgescence sans ruissellement jusqu’à ce que les graines aient germé (environ 5 jours).
3. Détermination de la race par la méthode modifiée de trempage du plateau (MTDM)
- Préparation des matériaux pour les inoculations
- Établir les conditions de plantation.
- Remplissez les inserts à 48 cellules (3,68 cm de largeur x 5,98 cm de longueur x 4,69 cm de profondeur) avec du sable pasteurisé à la vapeur: tourbe: vermiculite (4:1:1) et tapotez pour comprimer légèrement le sol. Placez les inserts dans des plateaux en plastique (27,9 cm de largeur x 53,3 cm de longueur x 5,1 cm de profondeur).
- Semez les graines avec leur apex (extrémité proximale) pointant vers le haut jusqu’à une profondeur égale à leur longueur.
- Procurez-vous les graines comme décrit précédemment.
- Ensuite, gardez le média humide en brumisant pendant 20 s toutes les 180 minutes ou en arrosant à la main une fois par jour.
- Après la germination (environ 5 jours), arrosez une fois par jour et au besoin pour soutenir la croissance des semis.
- Préparez les médias.
- Préparer le milieu qPDA en ajoutant 5,625 g de gélose granulée à 500 mL d’eau distillée; ajouter 4,875 g de gélose au dextrose de pommes de terre. Bien mélanger les ingrédients, autoclaver et refroidir à 50 °C avant de les verser dans des boîtes de Petri stériles. Scellez les boîtes de Petri avec un parafilm et conservez les assiettes au réfrigérateur (4 °C) jusqu’à utilisation.
- Pour préparer le bouillon moyen, peser et ajouter 24 g de dextrose de pomme de terre dans un flacon de 1 L. Porter le mélange à 1000 mL en ajoutant de l’eau distillée à la bouteille, placer la bouteille sur une plaque chauffante et remuer jusqu’à dissolution. Distribuer 100 mL de bouillon dans des flacons d’Erlenmeyer de 250 mL. Utilisez une étamine pour sceller les flacons et l’autoclave.
- Préparez l’inoculum.
- Sept jours avant la plantation, inoculez cinq plaques de qPDA avec du papier28 infiltré et stockez-les dans une zone incubée pendant huit jours sur un cycle sombre de 14 h/10 h22.
- Le septième jour, transférer deux bouchons de gélose de 1 cm2 dans chaque fiole d’Erlenmeyer de 250 mL contenant 100 mL de dextrose de pomme de terre. Placez les flacons Erlenmeyer sur un agitateur de paillasse à 200 tr/min pendant 7 jours sur un cycle lumière/obscurité de 14 h/10 h.
- Le jour de l’inoculation (14 jours après le semis), récoltez les spores en filtrant l’inoculum à travers quatre couches d’étamine stérile.
- Déterminer la concentration microconidiale dans les flacons à l’aide d’un hémocytomètre comme décrit précédemment. Préparer une suspension d’inoculum de 7 L dans une cuve en plastique (largeur de 40,6 cm x longueur 67,3 cm x profondeur) en transférant le volume correct de suspension de spores dans de l’eau stérile pour une concentration finale de spores de 1 × 106 mL−1 (figure 7A).
- Établir les conditions de plantation.
- Inoculation
- Quatorze jours après le semis (au moins au premier stade de la feuille véritable), transférer les inserts cellulaires avec les semis dans des plateaux palmés (26,9 cm de largeur x 53,7 cm de longueur x 6,28 cm de profondeur). Placez délicatement les plateaux palmés avec les semis dans une cuve en plastique contenant la suspension d’inoculum de 7 L. Inoculez chaque bac un à la fois (Figure 7B).
- Laissez les semis rester dans l’inoculum sans être dérangés pendant 15 min. Après 15 minutes, transférer délicatement les inserts cellulaires contenant les plants inoculés dans des plateaux sans trou (27,9 cm de largeur x 53,3 cm de longueur x 5,1 cm de profondeur). Répétez ce processus pour chaque plateau.
- Placez les plateaux sans trou sur le banc de la serre et arrosez au besoin. Maintenir les mêmes conditions d’éclairage et d’environnement que celles décrites pour l’essai biologique de trempage racinaire.
4. Évaluation de la maladie
- Sélectionnez les intervalles de temps pour l’évaluation.
- Pour les méthodes de trempage des racines et de barquette modifiée, commencez à noter une semaine après l’inoculation des plantules et continuez chaque semaine pendant quatre semaines supplémentaires.
REMARQUE : L’ensemble de données combiné comprendra cinq séries d’observations au cours de cette période. - Tout en utilisant la méthode du noyau, ne commencez les évaluations qu’une fois que les semis émergent et continuez chaque semaine pour un total de six évaluations.
- Pour les méthodes de trempage des racines et de barquette modifiée, commencez à noter une semaine après l’inoculation des plantules et continuez chaque semaine pendant quatre semaines supplémentaires.
- Observez et calculez l’incidence.
- Lors de chaque évaluation, prenez des images numériques pour documenter la progression de la maladie.
- Signalez l’incidence du flétrissement et de la mort des plantes. Calculer l’incidence en prenant la somme des plantes symptomatiques par rapport au témoin sain et le nombre de plantes mortes en proportion du nombre total de plantes dans ce cultivar.
- Analysez les résultats. Comparer les profils d’infection entre les cultivars et entre les groupes d’expérience si des témoins ont été utilisés.
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Representative Results
Ces expériences aident à définir la résistance relative des cultivars couramment cultivés (tableau 1). Ces informations peuvent ensuite être utilisées pour guider les recommandations de gestion en fonction des populations locales de Fon. En d’autres termes, si la race 0 ou 1 est connue pour être présente dans un champ commercial, l’agriculteur peut être enclin à cultiver une variété « résistante » telle que Calhoun Gray, Sunsugar ou équivalent. Les résultats des essais biologiques utilisant toutes les méthodes montrent que lorsque les semis ont été infectés par un isolat de race 1, les cultivars Black Diamond et Charleston Grey sont morts ou ont présenté des symptômes graves, tandis que les cultivars Calhoun Grey et PI ont montré une résistance (tableau 2 et figure 8A).
Toutes les méthodes ont montré que lorsque les semis étaient infectés par un isolat de race 3, presque toutes les plantes de tous les cultivars mouraient ou présentaient des symptômes graves (figure 8B). Ces résultats démontrent comment les essais biologiques utilisant les deux méthodes d’inoculation réussissent à différencier les races de Fon. L’apparence des plantes malades devrait être la même pour toutes les méthodes. La seule différence réside dans la façon dont les cultivars sont regroupés spatialement. Pour les méthodes de trempage de racines et de dray-dip modifiées, les cultivars seront organisés par colonnes du plateau, tandis que dans la méthode du noyau, les cultivars seront regroupés dans leurs propres pots.
Figure 1 : Zone expérimentale pour la GDR. En raison de la variabilité des symptômes, qui dépend fortement des conditions environnementales telles que l’humidité relative, la température, la photopériode et l’intensité lumineuse, il est important de maintenir une zone expérimentale réglementée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation des appartements de départ pour RDM. Remplissez 8 x 16 cellules (25 cm de largeur x 50 cm de longueur) en commençant les plats avec un milieu de plantation et tapotez vers le bas pour comprimer légèrement le sol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Préparation de la suspension conidiale pour rdM. (A) Isolement et culture. À partir d’un échantillon stocké ou nouvellement prélevé, isolez et cultivez une souche d’intérêt de F. oxysporum f. sp. niveum sur une plaque de qPDA au point que sa croissance couvre la moitié de la plaque. Cela démontre qu’il est actif et viable, ce qui est nécessaire pour une infestation importante du grain dans les étapes ultérieures. (B) Délogement des conidies. Déloger les conidies en grattant un épandeur de cellules stériles sur la surface moyenne. C) Dépôt en suspension. Mettre en commun la suspension de conidies liquides et la transférer dans un tube de culture stérile de 50 mL. Abréviation : qPDA = milieu de gélose au dextrose de pomme de terre d’une force d’un quart. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Organisation et vortex des semis pour RDM. (A) Séparation des cultivars. Entreposer temporairement les plantes rincées dans des récipients propres avec de l’eau du robinet jusqu’à leur utilisation, en gardant les cultivars séparés. B) Vortex des semis. Vortex les tubes avec des racines de plantule immergées pendant 30 s pour planter une seule plantule par cellule dans les 6 x 12 plats en polystyrène. Les plantes du même cultivar sont placées dans la même colonne du plateau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Préparation et infestation des amandes pour iKM. (A) Imbibition de baies de seigle. Sur une balance, mesurez 200 g de baies de seigle (Secale spp.) (ou de grains de blé Maxie var. (Triticum spp.)) dans un récipient suffisamment grand et versez-les dans une ou plusieurs fioles d’Erlenmeyer en verre de 1 L. Ajouter de l’eau du robinet stérile dans les flacons pour couvrir complètement les grains jusqu’à au moins 5 cm. (B) Égoutter les flacons. Égouttez l’eau des flacons, bouchez l’ouverture avec un morceau de rouleau de coton enveloppé dans une étamine et couvrez l’ouverture avec une pellicule d’aluminium. (C) Configuration de l’autoclave. Placez le sac dans un bac en plastique, sans danger pour l’autoclave. N’utilisez pas de bac en métal lorsque vous autoclavez les grains dans les sacs, car cela pourrait faire fondre les sacs. Couvrez le bac avec une pellicule d’aluminium. D) Entreposage des sacs. Rangez le sac à la verticale. Assurez-vous que le filtre est retiré du côté opposé du sac pour permettre un échange de gaz maximal. (E) Mesurer 14 grains de grains infestés dans un grand sac en plastique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Semis et germination des graines de pastèque. (A) Semer des graines de cultivar dans des pots. Semez six graines dans chaque pot. Assurez-vous que chaque pot ne contient que des graines d’un cultivar. Positionnez les graines avec l’extrémité apex de la graine tournée vers le haut pour permettre une croissance appropriée pendant la levée. B) Germination des semences. À l’aide d’un vaporisateur, mouillez les 0,3 à 0,6 cm supérieurs du sol avec de l’eau. Placez un plat en plastique transparent (15 cm de diamètre) sous et sur chaque pot pour créer un environnement humide pour la germination des graines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Préparation de l’inoculum et inoculation des semis pour le MTDM. (A) Préparation de l’inoculum. Déterminer la concentration microconidiale dans les flacons à l’aide d’un hémocytomètre comme décrit précédemment. Préparer une suspension d’inoculum de 7 L dans une cuve en plastique (40,6 cm de largeur × 67,3 cm de longueur × 16,8 cm de profondeur) en transférant le volume correct de suspension de spores dans de l’eau stérile pour une concentration finale de spores de 1 × 106 mL−1. B) Inoculation des semis. Quatorze jours après le semis (au moins au premier stade foliaire véritable), transférer les inserts cellulaires avec les semis dans des plateaux palmés (26,9 cm de largeur × 53,7 cm de longueur × 6,28 cm de profondeur). Placez délicatement les plateaux palmés avec les semis dans une cuve en plastique contenant la suspension d’inoculum de 7 L. Inoculez chaque plateau un à la fois. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Résultats phénotypiques des méthodes d’identification de la race. (A) Résultats de la course 1. Les résultats des essais biologiques utilisant (A) toutes les méthodes montrent que lorsque les semis ont été infectés par un isolat de race 1, les cultivars Black Diamond et Charleston Grey sont morts ou ont présenté des symptômes graves, tandis que les cultivars Calhoun Grey et PI ont montré une résistance. (B) Résultats de la course 3. Toutes les méthodes ont montré que lorsque les semis étaient infectés par un isolat de race 3, presque toutes les plantes de tous les cultivars mouraient ou présentaient des symptômes graves. (L’apparence des plantes malades devrait être la même pour toutes les méthodes. Ordre de plantation (de gauche à droite) représenté par des flèches : Black Diamond (flèche bleue), Charleston Grey (flèche violette), Calhoun Grey (flèche brune), Plant Introduction 296341-FR (flèche verte). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Cultivar | Course 0 | Course 1 | Course 2 | Course 3 |
| Sugar Baby, Diamant Noir | S | S | S | S |
| Charleston Gray, Allsweet, Dixielee | R | S | S | S |
| Calhoun Gray, Suier solaire | R | R | S | S |
| PI-296341-FR | R | R | R | S |
Tableau 1 : Race de Fusarium oxysporum f. sp. Niveum. La race de Fusarium oxysporum f. sp. niveum est déterminée par des réactions sensibles ou résistantes à un ensemble de différentiels de pastèque. Les cultivars énumérés dans chaque rangée sont les plus utilisés pour représenter chaque niveau de résistance lors de l’évaluation de la race d’un isolat. Ce tableau a été modifié à partir de 4. Abréviations : S = sensible; R = résistant.
| Isoler | Méthode | BD | CH. G | Cal G. | PI | Course | ||||
| S | COMME | S | COMME | S | COMME | S | COMME | |||
| X | Tremper | 6 | 0 | 6 | 0 | 0 | 6 | 0 | 6 | 1 |
| X | Noyau | 6 | 0 | 6 | 0 | 0 | 6 | 0 | 6 | 1 |
| X | MTD | 6 | 0 | 6 | 0 | 0 | 6 | 0 | 6 | 1 |
| Y | Tremper | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 3 |
| Y | Noyau | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 3 |
| Y | MTD | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 3 |
| S = Symptomatique; AS = Asymptomatique | ||||||||||
Tableau 2 : Identification des races. Les valeurs utilisées dans ce tableau reflètent l’incidence ou le nombre de plantes symptomatiques, par rapport au témoin sain, et le nombre de plantes mortes en proportion du nombre total de plantes dans ce cultivar. Les chiffres dans chaque cellule reflètent l’incidence rapportée à la fin de la période d’observation. Un cultivar est jugé sensible lorsqu’au moins 1/3 ou 33% des plantes de ce cultivar sont symptomatiques ou mortes. La race de l’agent pathogène est ensuite déterminée en fonction des cultivars qui ont été jugés sensibles. En d’autres termes, la performance de l’agent pathogène contre les cultivars à résistance croissante détermine la race de l’isolat. Ces résultats ne proviennent pas d’un essai réel et sont plutôt montrés pour transmettre comment les races sont identifiées à partir des résultats de ces méthodes. Abréviations: MTD = méthode de goutte à goutte modifiée; BD = Diamant Noir; CH. G = Charleston Grey; Cal G. = Calhoun Grey; PI = Introduction de la plante 296341-FR; S = symptomatique; AS = asymptomatique.
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Discussion
Trois méthodes de typage de race ont été présentées. Chacune de ces méthodes est la mieux adaptée à des questions et des conditions expérimentales particulières. La méthode d’inoculation du noyau infesté (infestation du sol) est peut-être plus simple et plus directe, ce qui la rend particulièrement utile pour l’évaluation de la pathogénicité30. L’utilisation de cette méthode pour un typage de course simple est très efficace. Cependant, l’application de la méthode pour déterminer la résistance d’un cultivar spécifique pourrait être difficile, étant donné que chaque plante peut ne pas faire face au même degré d’infection ou d’exposition, et des niveaux tout aussi élevés de maladie peuvent être nécessaires pour tester la résistance des cultivars d’intérêt. C’est le cas parce que l’inoculum produit de cette manière n’est pas bien quantifié, et la proportion de propagules viables, ou le nombre de propagules infectieuses qui atteignent la zone racinaire, n’est pas bien régulée31. De plus, cette méthode est limitée par des incohérences dans la proximité des noyaux plantés avec la zone racinaire. Si elles sont trop éloignées, les spores peuvent ne pas germer ou les hyphes peuvent ne pas se développer suffisamment pour atteindre les racines.
La méthode de trempage desracines 32,33 est plus laborieuse et prend plus de temps; cependant, étant donné que la quantité de propagules viables interagissant avec la plante est mesurée avec plus de précision, la résistance de l’hôte peut être décrite plus précisément, ce qui facilite le criblage de la résistance. De plus, les différences de virulence au sein d’une même race peuvent être plus facilement détectées. Cette méthode a l’avantage supplémentaire que généralement, les plantes deviennent symptomatiques plus tôt et plus expressivement que dans la méthode du noyau. Une variante de la méthode root-dip utilisant des chlamydospores dans la suspension d’inoculum au lieu de conidies peut ne pas avoir cet avantage6. De même, la méthode modifiée de trempage par plateau22 est exigeante en main-d’œuvre, mais permet un phénotypage à haut débit lorsque de nombreux isolats et semis doivent être examinés.
Les facteurs communs pour les trois méthodes comprennent la sélection des cultivars, les conditions de croissance et les exigences en matière d’hygiène. Selon ce qui est disponible dans le commerce, certains cultivars peuvent être substitués21,34. Sugar Baby et Black Diamond peuvent tous deux être utilisés pour déterminer les isolats de race 0, tandis que Charleston Gray, Allsweet et Dixielee ont été décrits comme résistants à la race 0 mais sensibles à la race 1. Calhoun Gray et Sunsugar sont résistants aux races 0 et 1 et sensibles aux races 2 et 3. Le développement de la maladie du fon dépend fortement de la température. Il faut veiller à ce que les conditions expérimentales tiennent compte de cette variable. Lors du choix d’un milieu de plantation, les mélanges commerciaux généraux qui comprennent de la mousse de tourbe et / ou du gypse et permettent une bonne aération doivent être satisfaisants. Des précautions doivent être prises pour éviter la contamination croisée des milieux de plantation dans les deux méthodes, en particulier à partir du sac source.
Après avoir utilisé l’une des méthodes décrites, la maladie doit être évaluée avec précision et cohérence. Les chercheurs précédents ont généralement décidé d’un seuil à partir duquel les plantes sont classées comme sensibles ou résistantes35,36. Par exemple, si moins de 33 % des plantes d’un cultivar spécifique étaient symptomatiques, alors ce cultivar serait classé comme résistant avec l’isolat défini par rapport au profil sensible du cultivar. Le seuil fixé est défini par le chercheur et la question qu’il souhaite aborder. La variabilité entre les évaluateurs et par le même évaluateur entre les usines a été largement rapportée37,38. Des facteurs tels que la qualité de la graine utilisée, la qualité du sol, la densité de l’inoculum, l’âge de stockage des isolats et le biais d’évaluation39,40 contribuent tous à cette variabilité8. En raison de cette variabilité de l’inoculation et des réponses des cultivars PI, de multiples réplications expérimentales sont nécessaires; idéalement, au moins trois mais cinq réplications sont recommandées, avec 6 plantes par réplication par variété.
Bien que des essais moléculaires aient été mis au point pour détecter les isolats de Fon 41,42,43, les résultats n’ont pas été cohérents en raison de la nature polyphylétique de F. oxysporum et de la variabilité géographique et génomique du complexe d’espèces 44,45,46. En outre, bien que des recherches antérieures aient établi l’importance des effecteurs sécrétés dans le xylème (SIX) en pleine virulence, le complément exact des effecteurs qui définissent la structure raciale des isolats de Fon n’a pas encore été déterminé13. Des diagnostics moléculaires pour la race sont encore en cours de développement, pour lesquels ces techniques phénotypiques sont essentielles pour évaluer leur précision et leur utilité dans le typage de race Fon19,47.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Ali et le Laboratoire de diagnostic moléculaire des plantes ainsi que le Dr Pingsheng Ji de l’Université de Géorgie, dont le leadership et le soutien ont contribué à l’établissement de notre programme Fon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Fuller’s Earth | Sigma-Aldrich | F200-5KG | |
| 1 L glass Erlenmeyer Flask | PYREX | 4980-1L | |
| 15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| 50 mL graduated cylinder | Lab Safety Supply | 41121805 | |
| 50 mL Eppendorf Conical Tubes | Fisher Scientific | 05-413-921 | |
| Aluminum foil wrap | Reynolds Wrap | 720 | |
| Bleach | Walmart | 587192290 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-391-301 | |
| CaCO3 | sigma-Aldrich | 239216 | |
| cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-11 | |
| Cheesecloth | Lions Services, Inc | 8305-01-125-0725 | |
| Clear plastic dishes | Visions Wave | 999RP6CLSS | ~15 cm diameter |
| Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
| Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | Sterile |
| Ethanol | Fisher Chemical | A4094 | 100%, then combine with water to make 70% for use |
| Flourescent Tube Lights | MaxLume | Model T5 | 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long |
| granulated agar | VWR International | 90000-786 | |
| Hand-held Spray Bottle | Ability One | 24122002 | ~0.95 L |
| hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-55A | Two chamber hemacytometer |
| Lab trays | Fisher Scientific | 15-236-2A | |
| Large, sealable plastic bags | Ziploc | 430805 | 38 cm x 38 cm |
| Mister / watering can | Bar5F | B10H22 | |
| Mushroom Bag Clamp | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | |
| Organic Rye Berries | Shroom Supply | 0.5 gallon or 25 lb bags | |
| P1000 pipette and tips | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | FB0875713 | Round, 100 mm diameter, 15 mm height |
| Planting media | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| Plastic Pitcher | BrandTech | UX0600850 | 1 L or larger |
| Plastic planting pots | Neo/SCI | 01-1177 | ~15 cm diameter and ~10 cm height |
| Plastic, autoclave-safe bin | Thermo Scientific | UX0601022 | 3 L |
| Quarter-strength potato dextrose agar media | Cole-Parmer | UX1420028 | Use powder in combination with recipe for QPDA |
| Scientific Balance Scale, measuring in g | Ohaus | 30208458 | Any precise scale that can hold and measure 200g will work |
| Size #4 cork bore | Cole-Parmer | NC9585352 | |
| Small Mushroom grow bag | Shroom Supply | 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes | |
| Soil trowel | Walmart | 563876946 | |
| Styrofoam flats (6 x 12 cells) | Speedling | Model TR72A | |
| Styrofoam flats (8 x 16 cells) | Speedling | Model TR128A | |
| Syringe (5 or 10 mL) | fisher Scientific | 14-829-19C | |
| Timer | Walmart | TM-01 | |
| V8 Original 100% Vegetable Juice | Walmart | 564638212 | |
| vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | |
| Watermelon Seed - Black Diamond | Willhite Seed Inc | 17 | |
| Watermelon Seed - Calhoun Gray | Holmes Seed Company | 4440 | |
| Watermelon Seed - Charleston Gray | Bonnie Plants | 7.15339E+11 | |
| Watermelon Seed - PI 296341-FR | Contact authors | Contact authors | |
| Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) | Alachua County Feed & Seed |
References
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