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Biology

अज्ञात Fusarium oxysporum f.sp की दौड़ निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली तीन इनोक्यूलेशन तकनीकों का एक विपरीत। निवेम आइसोलेट्स

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63181
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 3, 4,5, 6, 1
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

तरबूज के फुसेरियम विल्ट के प्रबंधन के लिए मौजूद रोगज़नक़ दौड़ के ज्ञान की आवश्यकता होती है। यहां, हम रूट-डुबकी, संक्रमित कर्नेल सीडिंग, और संशोधित ट्रे-डिप इनोक्यूलेशन विधियों का वर्णन करते हैं ताकि रोगजनक कवक फुसेरियम ऑक्सीस्पोरम एफ एसपी निवम (एफओएन) की दौड़-टाइपिंग में उनकी प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया जा सके।

Abstract

तरबूज (Citrullus lanatus) के Fusarium wilt, Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon) के कारण, दक्षिण-पूर्वी संयुक्त राज्य अमेरिका में एक प्रमुख उत्पादन बाधा के रूप में फिर से उभरा है, विशेष रूप से फ्लोरिडा में। एकीकृत कीट प्रबंधन रणनीतियों की तैनाती, जैसे कि दौड़-विशिष्ट प्रतिरोधी cultivars, उत्पादकों के क्षेत्रों में रोगज़नक़ की विविधता और जनसंख्या घनत्व पर जानकारी की आवश्यकता होती है। रोगज़नक़ आइसोलेट्स की पहचान करने के लिए आणविक नैदानिक उपकरण विकसित करने में कुछ प्रगति के बावजूद, दौड़ निर्धारण के लिए अक्सर बायोएसे दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।

रेस टाइपिंग रूट-डिप इनोक्यूलेशन, संक्रमित कर्नेल सीडिंग विधि, और चार तरबूज अंतर (ब्लैक डायमंड, चार्ल्सटन ग्रे, कैलहॉन ग्रे, प्लांट इंट्रोडक्शन 296341-एफआर) में से प्रत्येक के साथ संशोधित ट्रे-डुबकी विधि द्वारा आयोजित की गई थी। आइसोलेट्स को टीकाकरण के पांच सप्ताह बाद रोग की घटनाओं की गणना करके एक दौड़ पदनाम सौंपा जाता है। यदि किसी विशेष किस्म के लिए 33% से कम पौधे रोगसूचक थे, तो उन्हें प्रतिरोधी के रूप में वर्गीकृत किया गया था। 33% से अधिक घटनाओं वाले उन cultivars को अतिसंवेदनशील माना जाता था। यह पेपर दौड़, रूट-डुबकी, संक्रमित कर्नेल, और संशोधित ट्रे-डुबकी टीकाकरण का पता लगाने के लिए टीकाकरण के तीन अलग-अलग तरीकों का वर्णन करता है, जिनके अनुप्रयोग प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार भिन्न होते हैं।

Introduction

मृदाजनित कवक जो फुसेरियम ऑक्सीस्पोरम प्रजाति परिसर (एफओएससी) बनाते हैं, वे प्रभावी हेमीबियोट्रोफिक पौधे के रोगजनक हैं जो गंभीर बीमारी का कारण बन सकते हैं और फसलों की एक विविध श्रृंखला में नुकसान उठा सकतेहैं। तरबूज के Fusarium wilt, F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) के कारण, पिछले कई दशकों में दुनिया भर में दायरे, घटनाओं और गंभीरता में वृद्धि हो रही है 2,3. रोपाई में, फुसेरियम विल्ट के लक्षण अक्सर अवमंदन-बंद के समान होते हैं। पुराने पौधों में, पत्ते भूरे, क्लोरोटिक और नेक्रोटिक हो जाते हैं। आखिरकार, पौधों की मुरझाना पूर्ण पौधे के पतन और मृत्युके लिए प्रगति करती है। प्रत्यक्ष उपज हानि लक्षणों और पौधे की मृत्यु के कारण होती है, जबकि अप्रत्यक्ष उपज हानि फोलियार चंदवा 5 के उन्मूलन के कारण सूर्य की क्षति के कारण हो सकतीहै। यौन प्रजनन और संबंधित प्रजनन संरचनाओं को कभी भी एफ ऑक्सीस्पोरम में नहीं देखा गया है। हालांकि, रोगज़नक़ दो प्रकार के अलैंगिक बीजाणुओं, सूक्ष्म और मैक्रोकोनिडिया का उत्पादन करता है, साथ ही साथ क्लैमाइडोस्पोर नामक बड़ी, दीर्घकालिक उत्तरजीविता संरचनाएं भी होती हैं, जोकई वर्षों तक मिट्टी में जीवित रह सकती हैं।

FOSC को मनाया मेजबान श्रेणियों के आधार पर formae speciales में वर्गीकृत किया गया है, आमतौर पर एक या कुछ मेजबान प्रजातियोंतक सीमित है। हालांकि हाल के शोध ने संकेत दिया है कि यह प्रजाति परिसर 15 विभिन्न प्रजातियों का एक समग्र हो सकता है, तरबूज को संक्रमित करने वाली विशेष प्रजातियां वर्तमानमें अज्ञात हैं। F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) उपभेदों के समूहों के लिए नाम है जो विशेष रूप से Citrullus lanatus या पालतू तरबूज 8,9 को संक्रमित करते हैं। अधिकांश रोगजनक फॉर्मे स्पेशलीज़ के भीतर ऑक्सीस्पोरम उपभेदों में उनके आनुवंशिक घटकों और एक मेजबान प्रजाति की ओर उग्रता के संबंध में विविधता के कुछ स्तर प्रदर्शित होते हैं। उदाहरण के लिए, एक तनाव एक मेजबान के सभी cultivars को संक्रमित कर सकता है, जबकि दूसरा केवल अधिक संवेदनशील cultivars को संक्रमित कर सकता है। इस तरह की भिन्नता के लिए खाते में, इन समूहों को अनौपचारिक रूप से विकासवादी संबंधों या सामान्य फेनोटाइपिक विशेषताओं के आधार पर दौड़ में वर्गीकृत किया जाता है। फोन के भीतर, चार दौड़ (0, 1, 2, और 3) को चुनिंदा तरबूज किस्मों के एक सेट के खिलाफ उनकी रोगजनकता के आधार पर विशेषता दी गई है, जिसमें दौड़ 3 की खोज हाल ही में10 हुई है।

इस स्पष्ट विविधता के बावजूद, बीजाणुओं या हाइफे की आकृति विज्ञान फोन दौड़ की दौड़ के बीच अलग-अलग नहीं हैं, जिसका अर्थ है कि एक अलग की अद्वितीय दौड़11 की पहचान करने के लिए आणविक या फेनोटाइपिक एसेस की आवश्यकता होती है। आणविक अनुसंधान ने कुछ आनुवंशिक अंतरों की पहचान की है। उदाहरण के लिए, जाइलम (SIX) प्रभावकों में स्रावित की भूमिका का अध्ययन एफ ऑक्सीस्पोरम में वर्षों से किया गया है, और इनमें से कुछ प्रभावकों को क्षैतिज जीन हस्तांतरण12 के दौरान आदान-प्रदान किए गए गुणसूत्रों पर स्थित किया गया है। उदाहरण के लिए, SIX6 Fon दौड़ 0 और 1 में पाया जाता है लेकिन दौड़ 213 में नहीं। छह effectors F. oxysporum f. sp. lycopersici और F. oxysporum f. sp. cubense की रोगजनकता में फंस गए हैं, जो टमाटर और केले पर Fusarium wilt का कारण बनता है, क्रमशः 14,15,16,17. F. oxysporum f. sp. spiniciae के उपभेदों के बीच छह effector प्रोफाइल के विश्लेषण, पालक पर Fusarium wilt रोगज़नक़, वर्गीकरण है कि सटीक रूप से आनुवंशिक और फेनोटाइपिक विविधता18 को दर्शाता है सक्षम किया गया है. हालांकि, फोन दौड़ के विषाणु तंत्र के बीच अंतर वर्तमान में पूरी तरह से समझा नहीं गया है, और उनके उपयोग पर विकसित आणविक assays ने असंगत और गलत परिणाम दिखाएहैं। इसलिए, संक्रमण assays से फेनोटाइपिक परिणाम वर्तमान में आइसोलेट्स को वर्गीकृत करने का सबसे अच्छा तरीका है।

एफ ऑक्सीस्पोरम शुरू में जाइलम20 तक अपना रास्ता बनाने से पहले जड़ों के माध्यम से मेजबानों को संक्रमित करता है। यह किसी दिए गए मेजबान कल्टीवर की जड़ों का प्रत्यक्ष टीकाकरण दौड़-टाइपिंग करने का एक प्रभावी तरीका बनाता है और रूट-डिप और ट्रे-डिप इनोक्यूलेशन विधियोंका आधार है। जब एक मेजबान को संक्रमित नहीं किया जाता है, तो एफ ऑक्सीस्पोरम मिट्टी में रहता है और वर्षों तक निष्क्रिय रह सकता है। ब्याज के एक क्षेत्र से मिट्टी में अतिसंवेदनशील तरबूज cultivars बढ़ती Fon की उपस्थिति के लिए परीक्षण करने का एक तरीका है। मिट्टी में प्रतिरोध के विभिन्न ज्ञात स्तरों की किस्मों को शामिल करने के लिए इस विधि का विस्तार करना जो जानबूझकर फोन से संक्रमित है, दौड़-टाइपिंग (तालिका 1) करने का एक अच्छा तरीका भी है और प्रभावित कर्नेल सीडिंग विधि का आधार है। संशोधित ट्रे-डुबकी विधि मूल ट्रे-डुबकी विधि की एक भिन्नता है जो एक उच्च-थ्रूपुट रेस-टाइपिंग की अनुमति देती है जहां कई पौधों और फील्ड आइसोलेट्स की तेजी से जांच की जा सकतीहै। एक त्वरित और सफल रेस-टाइपिंग बायोएसे के महत्वपूर्ण कारकों में विभिन्न रोगज़नक़ दौड़ के प्रतिरोध में अंतर का दस्तावेजीकरण करने वाली किस्मों का उपयोग करना शामिल है, यह सुनिश्चित करना कि संक्रमण के दौरान इनोकुलम जैविक रूप से सक्रिय और प्रचुर मात्रा में है, एक ऐसे वातावरण को बनाए रखना जो रोगज़नक़ और मेजबान दोनों के लिए अनुकूल है, और बीमारी की गंभीरता या घटनाओं के लिए एक सुसंगत रेटिंग प्रणाली का उपयोग करना। यह पेपर रूट-डिप23,24, संक्रमित कर्नेल सीडिंग25,26, और ऊपर वर्णित सिद्धांतों के आधार पर फेनोटाइपिक रेस-टाइपिंग के लिए संशोधित ट्रे-डुबकी22 विधियों का वर्णन करता है।

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Protocol

1. रूट-डुबकी विधि (RDM) द्वारा दौड़ का निर्धारण

  1. प्रयोगात्मक वातावरण की तैयारी
    1. क्योंकि लक्षण अभिव्यक्ति पर्यावरणीय स्थितियों पर अत्यधिक निर्भर है, इसलिए एक नियंत्रित क्षेत्र में पौधों को बनाए रखें। सापेक्ष आर्द्रता, तापमान, photoperiod, और प्रकाश तीव्रता (चित्रा 1) की निगरानी करें।
      1. तापमान को 26-28 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, सापेक्ष आर्द्रता को 50-75% तक, और पर्याप्त पौधे के विकास और स्वास्थ्य को सुनिश्चित करने के लिए 16 घंटे की फोटोपीरियड सेट करें।
        नोट: हाइपोक्सिया, अंकुर मुरझाने, और / या बीज सड़ने को रोकने के लिए, पानी से अधिक न करें या रोपाई के चारों ओर खड़े पानी की अनुमति न दें।
      2. प्रकाश संश्लेषक विकास का समर्थन करने के लिए प्रकाश के प्रति बैंक कम से कम 1850 लुमेन और 2,800 K प्रति बैंक रोशनी के रंग के तापमान के साथ दो फ्लोरोसेंट ट्यूब लाइट्स का उपयोग करें।
      3. क्षेत्र को साफ रखें और कीट क्षति और आकस्मिक संक्रमण को रोकने के लिए अपशिष्ट मिट्टी और पौधे के मलबे को हटाने सहित स्वच्छ प्रथाओं का उपयोग करें।
    2. रोपण की स्थितियाँ
      1. रोपण माध्यम के साथ फ्लैट शुरू करने वाले 8 x 16-सेल (25 सेमी चौड़ाई x 50 सेमी लंबाई) भरें और मिट्टी को थोड़ा संपीड़ित करने के लिए नीचे टैप करें (चित्रा 2)।
      2. चार विभेदक cultivars के बीज प्राप्त करें: ब्लैक डायमंड / शुगर बेबी, चार्ल्सटन ग्रे / Allsweet / Dixielee, Calhoun ग्रे, और PI-296341-FR।
      3. उनके शीर्ष (नुकीले छोर) के साथ बीज बोएं जो उनकी लंबाई के बराबर गहराई की ओर इशारा करते हुए ऊपर की ओर इशारा करते हैं। बीज बोए जाने के बाद, 100% फुलर की पृथ्वी या 0.3175-0.635 सेमी की गहराई के लिए अन्य बेंटोनाइट मिट्टी के विकल्प के साथ दफन बीज वाले माध्यम को कवर करें।
      4. खड़े या पूलिंग पानी बनाने के बिना माध्यम को गीला करने के लिए फ्लैटों को धुंध करें। इसके बाद, हर 180 मिनट में 20 s के लिए मिस्टिंग करके मीडिया को नम रखें, या लगभग 5 दिनों तक बीज अंकुरण होने तक प्रति दिन एक बार हाथ से पानी दें। अंकुरण के बाद, प्रति दिन एक बार पानी और रोपाई के विकास का समर्थन करने के लिए आवश्यक के रूप में।
    3. मीडिया की तैयारी
      नोट: दोनों मीडिया अतिरिक्त दानेदार आगर के साथ फर्म कर रहे हैं सतह scraping द्वारा बीजाणु कटाई को सक्षम करने के लिए.
      1. स्पष्ट V8 रस माध्यम (V8)
        1. 500 मिलीलीटर स्पष्ट V8 रस माध्यम (V8)27 के 100 mL स्पष्ट V8 मूल 100% सब्जी रस 1% CaCO3 से 400 mL आसुत पानी के साथ जोड़ने के द्वारा तैयार करें।
        2. दानेदार आगर के 7.5 ग्राम जोड़ें।
        3. सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं, आटोक्लेव करें, और बाँझ पेट्री व्यंजनों में डालने से पहले 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने की अनुमति दें।
      2. चौथाई ताकत आलू dextrose आगर मीडिया (qPDA)
        1. आसुत पानी के 500 मिलीलीटर में 4.5 ग्राम दानेदार आगर जोड़कर क्यूपीडीए माध्यम तैयार करें, 3.8 ग्राम आलू डेक्सट्रोज आगर जोड़ें।
        2. सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं, आटोक्लेव करें, और बाँझ पेट्री व्यंजनों में 12-15 एमएल डालने से पहले 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने की अनुमति दें।
  2. प्रयोगात्मक उपचार की तैयारी
    1. इनोकुलम तैयार करें।
      1. पांच दिन पोस्टप्लांटिंग (डीपीपी), घुसपैठ किए गए पेपर डिस्क (1-1.25 सेमी व्यास) को रखें, जिसमें पसंदीदा एफ ऑक्सीस्पोरम एक वी 8 और एक क्यूपीडीए प्लेट पर अलग हो जाता है और उन्हें आठ दिनों के लिए इनक्यूबेटर (~ 28 डिग्री सेल्सियस) में स्टोर करता है28 (चित्रा 3 ए)।
      2. कवक विकास के आठवें दिन और टीकाकरण से पहले के दिन (अनुभाग 1.3.2 देखें), इनक्यूबेटर से एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में V8 और qPDA प्लेटों को स्थानांतरित करें।
      3. प्रत्येक आइसोलेट के लिए, प्रत्येक V8 और qPDA संस्कृति प्लेट पर 6 मिलीलीटर निष्फल विआयनीकृत पानी वितरित करें।
      4. मध्यम सतह पर एक बाँझ सेल स्प्रेडर स्क्रैप करके कोनिडिया को हटा दें (चित्रा 3 बी)। तरल conidial निलंबन पूल और यह एक बाँझ 50 mL संस्कृति ट्यूब (चित्रा 3 सी) के लिए स्थानांतरण.
      5. इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि 50 एमएल संस्कृति ट्यूब में कुल तरल कोनिडियल निलंबन की मात्रा लगभग 12 मिलीलीटर न हो।
      6. एक और अलग करने के लिए आगे बढ़ने से पहले, सतह-कार्य क्षेत्र और शराब के साथ सेल स्प्रेडर sterilize. सेल स्प्रेडर को ≥70% इथेनॉल में डुबोने के बाद एक बुनसेन बर्नर के माध्यम से पारित करके निष्फल करें।
      7. एक बार जब तरल कोनिडियल निलंबन को सभी आइसोलेट्स के लिए संस्कृति ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिया जाता है, तो बीजाणु की गिनती को निर्धारित करें। सबसे पहले, भंवर एक व्यक्ति 50 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब और एक hemacytometer के प्रत्येक कक्ष में 10 μL वितरित. फिर, हेमेसिटोमीटर में बीजाणुओं की संख्या की गणना करें जैसा कि पहलेवर्णित 29 था।
      8. 106 + 10% के लिए परिकलित मात्रा को एक और बाँझ संस्कृति ट्यूब में स्थानांतरित करके अंतिम इनोकुलम समाधान तैयार करें और बाँझ विआयनीकृत पानी जोड़कर कुल मात्रा को 30 मिलीलीटर तक लाएं।
      9. इन संस्कृति ट्यूबों को रात भर 8 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
        नोट: यह conidial व्यवहार्यता के नुकसान के बिना किया जा सकता है, के रूप में अप्रकाशित डेटा द्वारा इंगित किया गया है।
  3. टीका
    1. टीका लगाने के लिए तैयार करें।
      1. टीकाकरण के दिन से पहले, मिट्टी ले जाने की क्षमता के लिए तेरह दिन पुराने रोपाई को मजबूत रूप से पानी दें।
      2. प्रासंगिक जानकारी के साथ दांव को प्रीलेबल करें, जिसमें परीक्षण किए जाने वाले आइसोलेट, तरबूज की खेती और टीकाकरण की तारीख शामिल है।
      3. 6 x 12-सेल (20 सेमी चौड़ाई x 40 सेमी लंबाई) स्टायरोफोम फ्लैट्स रखें, जो पहले 10% ब्लीच के साथ साफ किया गया था और अच्छी तरह से कुल्ला किया गया था, ताकि संक्रमित पौधों को प्राप्त किया जा सके।
      4. Preposition सभी आवश्यक सामग्री ( सामग्री की तालिका देखें).
    2. पौधे की जड़ों को टीका लगाएं।
      1. टीकाकरण शुरू करने से कई घंटे पहले पौधों को मजबूती से पानी दें। पानी के बाद कम से कम 2 घंटे, 8 x 16-सेल स्टायरोफोम फ्लैटों से प्लांटलेट्स को हटा दें और किसी भी पालन रोपण सामग्री कणों को हटाने के लिए अपनी जड़ों को कुल्ला करें।
      2. अस्थायी रूप से उपयोग करने तक नल के पानी के साथ साफ कंटेनरों में कुल्ला किए गए पौधों को स्टोर करें, जिससे cultivars को एक दूसरे से अलग रखा जा सके (चित्रा 4 ए)। छह व्यक्तियों के समूहों में plantlets अलग और एक प्रयोगशाला ट्रे पर गीले कागज तौलिये में लिपटे अंकुर समूहों रखने के लिए desication को रोकने के लिए.
      3. 6 x 12 सरणी स्टायर स्टायरोफोम ट्रे के प्रत्येक सेल के तल में मिट्टी के25-30 सेमी 3 रखें और मिट्टी को गीला करने के लिए एक धारा निकलना बोतल का उपयोग करें जब तक कि यह स्पष्ट रूप से नम न हो।
      4. पौधों को टीका लगाएं और उन्हें खेती के अनुसार क्रम में फिर से लगाएं, जैसे कि ब्लैक डायमंड, चार्ल्सटन ग्रे, कैलहॉन ग्रे, और फिर पीआई 296341 01 एफआर को बाएं से दाएं लगाया जाता है।
      5. स्वस्थ नियंत्रण के साथ शुरुआत करते हुए, इनोकुलम युक्त 50 एमएल ट्यूबों में एक ही कल्टीवर के छह अक्षतिग्रस्त रोपाई के एक समूह को रखें। स्वस्थ नियंत्रण के मामले में, बीजाणु निलंबन के बदले नल के पानी का उपयोग करें। सकारात्मक नियंत्रण (Fon दौड़ 3) पिछले के साथ पौधों को संक्रमित.
      6. एक बार ट्यूब के अंदर, सुनिश्चित करें कि पौधे की जड़ें पहुंचती हैं और इनोकुलम (नल के पानी) के संपर्क में आती हैं।
      7. 30 s (चित्रा 4B) के लिए जलमग्न plantlet जड़ों के साथ ट्यूबों भंवर. भंवर के बाद, 6 x 12 स्टायरोफोम फ्लैटों में प्रति सेल एक एकल प्लांटलेट रखें। एक ही कल्टीवर के पौधों को ट्रे में एक ही कॉलम में रखें।
      8. प्लेसमेंट के बाद, 30 s के लिए 0.7% उपलब्ध क्लोरीन समाधान की बाल्टी में उन्हें पकड़कर gloved हाथों को सैनिटाइज करें, इसके बाद 1 मिनट के लिए नल का पानी कुल्ला करें।
      9. इसके बाद, रोपण माध्यम के साथ रखे गए प्लांटलेट्स को कवर करें और धीरे से सेट करें। एक सिरिंज या पिपेट का उपयोग करते हुए, स्प्लैशिंग से बचने के दौरान प्रति प्लांटलेट 20 एमएल के साथ प्लांटलेट्स को सावधानीपूर्वक पानी दें।
      10. पौधों के अगले सेट पर आगे बढ़ने से पहले, क्लोरीन समाधान और नल के पानी के कुल्ला का उपयोग करके फिर से हाथ साफ करें।
      11. सभी प्लांटलेट्स को फिर से लगाए जाने के बाद, इनोकुलम अपवाह को रोकने के लिए उन्हें फिर से न्यूनतम रूप से पानी दें।
      12. 27 डिग्री सेल्सियस के औसत तापमान के साथ एक संलग्न, अंधेरे वातावरण में रात भर प्लांटलेट्स को पकड़ो। अगले दिन, पौधों को ग्रीनहाउस में स्थानांतरित करें, औसत तापमान को 27 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. संक्रमित पौधों का रखरखाव और देखभाल
    1. अधिशेष पानी के अतिप्रवाह को रोकने के लिए, फ्लैटों को 4-5 दिनों के लिए दिन में तीन बार हल्के से पानी दें जब तक कि पौधे स्थिर न हो जाएं।
    2. कम से कम तीन दिनों के लिए ट्रे को दैनिक रूप से 2-3 बार जांचें ताकि पर्याप्त और यहां तक कि पानी का कवरेज सुनिश्चित किया जा सके।
    3. फ्लैटों को घुमाकर और / या आवश्यक रूप से पूरक छायांकन / पानी प्रदान करके सूरज की रोशनी या छायांकन के कारण सूखने से बचें।
    4. 3 डीपीपी पर, 20-20-20 त्वरित-रिलीज उर्वरक (10 ग्राम / 3.78 एल) के साथ पौधों को 3-6 मिलीलीटर प्रति लीटर पानी की दर से निषेचित करें।
    5. 3-4 सप्ताह के लिए साप्ताहिक निषेचन करें।
    6. इस पूरे चरण में एक ही प्रकाश और पर्यावरणीय स्थितियों को बनाए रखें।

2. संक्रमित कर्नेल विधि (IKM) द्वारा दौड़ का निर्धारण

  1. गुठलियों का प्रकोप
    1. इनोकुलम तैयार करें।
      1. या तो एक संग्रहीत या नए एकत्र किए गए नमूने से, अलग-थलग और संस्कृति एक एफ ऑक्सीस्पोरम एफ एसपी एनपीडीए की एक प्लेट पर ब्याज का निवम तनाव इस बिंदु पर है कि इसकी वृद्धि आधी प्लेट को कवर करती है।
        नोट: यह दर्शाता है कि यह सक्रिय और व्यवहार्य है, जो बाद के चरणों में अनाज के पर्याप्त संक्रमण के लिए आवश्यक है।
    2. गुठली तैयार करें।
      1. एक पैमाने पर, किसी भी पर्याप्त रूप से बड़े कंटेनर में राई (Secale spp.) जामुन (या Maxie var. wheat (Triticum spp.) गुठली) के 200 ग्राम को मापें और उन्हें एक या अधिक 1 L ग्लास Erlenmeyer फ्लास्क में डालें। कम से कम 5 सेमी (चित्रा 5 ए) तक अनाज को पूरी तरह से कवर करने के लिए फ्लास्क में बाँझ नल का पानी जोड़ें।
      2. गुठली को कमरे के तापमान (~ 24 डिग्री सेल्सियस) पर 2 घंटे के लिए भिगोएं। फ्लास्क से पानी निकालें; cheesecloth में लिपटे कपास रोल के एक टुकड़े के साथ उद्घाटन प्लग; और एल्यूमीनियम पन्नी लपेटें (चित्रा 5B) के साथ उद्घाटन को कवर करें।
    3. गुठली को विघटित करना. एक बार जब अनाज पानी को आत्मसात कर लेता है, तो टीकाकरण से पहले अन्य अवांछित रोगाणुओं को मारने के लिए इसे दो अलग-अलग तरीकों से दो बार आटोक्लेव करें।
      1. पहली बार के दौरान, गुरुत्वाकर्षण चक्र (121.2 डिग्री सेल्सियस, 1.06 किलोग्राम/ सेमी 2) पर तैयार फ्लास्क में अनाज को 5 मिनट के सुखाने के समय के साथ 1 घंटे के लिए आटोक्लेव करें। फ्लास्क को कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें।
      2. दूसरी बार ऑटोक्लेविंग से पहले, अनाज को 0.5 μm फ़िल्टर के साथ एक छोटे मशरूम-बढ़ते बैग में स्थानांतरित करें। बैग से हवा निकालें और फिर बैग के चारों ओर अतिरिक्त प्लास्टिक को मोड़ें।
      3. बैग को एक प्लास्टिक, आटोक्लेव-सुरक्षित बिन में रखें। एल्यूमीनियम पन्नी लपेटें (चित्रा 5C) के साथ बिन को कवर करें।
        नोट: बैग में अनाज autoclaving जब एक धातु बिन का उपयोग न करें, क्योंकि इससे बैग पिघल सकते हैं।
      4. एक गुरुत्वाकर्षण चक्र पर बिन को 5 मिनट के सुखाने के समय के साथ 1 घंटे के लिए आटोक्लेव करें, पहले की तरह एक ही चक्र।
        नोट: केवल बैग को दूसरी बार आटोक्लेव करें, पहली बार नहीं, क्योंकि यदि बैग दो बार आटोक्लेव किए जाते हैं तो फ़िल्टर और पोर्ट से समझौता किया जा सकता है। बैग को धीरे-धीरे और पूरी तरह से ठंडा करने की अनुमति देकर फ़िल्टर पर संघनन को रोकें, क्योंकि यदि यह गीला हो जाता है तो बढ़ते बैग फ़िल्टर से समझौता हो जाएगा।
    4. गुठली को टीका लगाएं।
      1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में संस्कृति प्लेट और बैग के साथ काम करना, अगर डिस्क, व्यास में 6 मिमी, एक बाँझ # 4 आकार कॉर्क बोर के साथ संस्कृति प्लेट पर सक्रिय विकास के क्षेत्र से कटौती। बैग को खोलें। एक सख्त बाँझ तकनीक का उपयोग करते हुए, बैग में 5 अगर डिस्क रखें। बाँझ नल के पानी के 35 मिलीलीटर को मापने और इसे बैग में जोड़ने के लिए एक बाँझ 50 एमएल स्नातक सिलेंडर का उपयोग करें।
      2. बैग के उद्घाटन को कुछ हद तक रोल करें और फिर सतह-निष्फल करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ बाहर स्प्रे करें।
        नोट: फिल्टर स्प्रे मत करो के रूप में है कि नमी भी यह समझौता होगा.
      3. केंद्र की ओर कोनों को मोड़कर बैग को बंद करें और फिर फ़िल्टर के ऊपर दो बार। बैग clamps और स्पष्ट विनाइल टयूबिंग निर्माता द्वारा प्रदान की टयूबिंग के साथ बैग सुरक्षित.
        नोट:: clamps पुन: प्रयोज्य हैं।
      4. बैग को जैव सुरक्षा कैबिनेट से निकालें।
    5. विकास के लिए रोगज़नक़ को स्टोर करें।
      1. बैग को सीधा स्टोर करें। सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर को अधिकतम गैस विनिमय (चित्रा 5 डी) को सक्षम करने के लिए बैग के विरोधी पक्ष से दूर खींच लिया गया है।
      2. लगभग तीन सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर सामग्री को इनक्यूबेट करें। रोगज़नक़ के विकास को सुनिश्चित करने के लिए अनाज को नियमित रूप से पुनर्वितरित करें।
        नोट: बैग पुन: प्रयोज्य नहीं हैं।
  2. संक्रमित अनाज के साथ तरबूज के अंकुर का संक्रमण
    1. स्रोत तरबूज के बीज के रूप में पहले वर्णित है.
    2. प्रयोगात्मक समूहों का निर्धारण करें।
      नोट: रोगज़नक़ के केवल तनाव (ओं) की आवश्यकता दौड़ की पहचान के लिए परीक्षण किया जा रहा आइसोलेट्स हैं। हालांकि, नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण बिना किसी संक्रमण या संक्रमण के एक विशिष्ट स्तर के साथ पौधों की तुलना करने में मदद करेंगे।
      1. नकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए, गेहूं की गुठली का उपयोग पहले उल्लिखित विधि के अनुसार स्टरलाइज़ किया गया है लेकिन बिना टीकाकरण के।
      2. एक सकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए, अज्ञात आइसोलेट के खिलाफ तुलना के लिए पहले से ही वर्गीकृत तनाव के साथ संक्रमित गेहूं की गुठली का उपयोग करें।
    3. मिट्टी और अनाज को मिलाएं।
      1. एक बड़े प्लास्टिक बैग (चित्रा 5E) में संक्रमित गुठली के 14 अनाज को मापें। प्लास्टिक के बर्तन (ऊंचाई में 15 सेमी व्यास x 10 सेमी) को पॉटिंग मिश्रण के साथ भरने के लिए आवश्यक मिश्रण की मात्रा को मापने के लिए। मिश्रण को बैग में खाली करें। बैग में एक एयर कुशन बनाएं और इसे मोड़ें या बंद कर दें।
      2. कई बार बैग को उलटकर गुठली और मिट्टी को मिलाएं। एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए, साफ कर्नेल के साथ एक अलग बैग में एक ही प्रक्रिया करें। एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए, तुलना तनाव से प्रभावित कर्नेल के साथ एक अलग बैग में एक ही प्रक्रिया करें।
      3. संक्रमित मिट्टी के मिश्रण के साथ चार सतह-निष्फल बर्तन भरें। एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए, किसी भी फोन-दूषित मिट्टी को संभालने से पहले उस मिश्रण को पॉट करें।
    4. तरबूज के बीज बोएं।
      1. प्रत्येक बर्तन में छह बीज बोएं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक बर्तन में केवल एक कल्टीवर से बीज होते हैं। बीज के शीर्ष छोर के साथ बीजों को उभरने के दौरान उचित विकास की अनुमति देने के लिए सामना करना पड़ रहा है (चित्रा 6 ए)।
      2. एक स्प्रे बोतल का उपयोग करके, पानी के साथ ऊपरी 0.3-0.6 सेमी मिट्टी को गीला करें। बीज अंकुरण के लिए एक आर्द्र वातावरण बनाने के लिए प्रत्येक बर्तन के नीचे और उसके ऊपर एक स्पष्ट प्लास्टिक डिश (15 सेमी व्यास) रखें (चित्रा 6 बी)।
    5. बढ़ती परिस्थितियों को स्थापित करें।
      1. एक स्प्रे बोतल के साथ एक स्प्रे बोतल के साथ बर्तनों को पानी दें ताकि अपवाह के बिना टर्गिडिटी बनाए रखा जा सके जब तक कि बीज अंकुरित न हो जाएं (लगभग 5 दिन)।
        नोट: उपयोग किए गए पानी की मात्रा पौधे के आकार और बर्तन के आकार के साथ बढ़ेगी।
      2. एक बार जब बीज अंकुरित हो जाते हैं, तो शीर्ष पकवान को बर्तन के नीचे की ओर ले जाएं।
      3. इष्टतम पौधे के विकास के लिए आवश्यक के रूप में पौधों को दैनिक रूप से पानी दें। पौधों को पहले से वर्णित लोगों के समान प्रकाश स्थितियों के तहत 16 घंटे की फोटोपीरियड में उजागर करें और 27 डिग्री सेल्सियस (± 1 डिग्री सेल्सियस) का तापमान।

3. संशोधित ट्रे-डुबकी विधि (MTDM) द्वारा दौड़ का निर्धारण

  1. इनोक्यूलेशन के लिए सामग्री की तैयारी
    1. रोपण की स्थिति स्थापित करें।
      1. भाप-पास्चुरीकृत रेत के साथ 48-सेल (3.68 सेमी चौड़ाई x 5.98 सेमी लंबाई x 4.69 सेमी गहराई) को भरें: पीट: वर्मीक्यूलाइट (4: 1: 1) और मिट्टी को थोड़ा संपीड़ित करने के लिए नीचे टैप करें। प्लास्टिक ट्रे (27.9 सेमी चौड़ाई x 53.3 सेमी लंबाई x 5.1 सेमी गहराई) में आवेषण रखें।
      2. बीजों को उनके शीर्ष (समीपस्थ छोर) के साथ बोएं जो उनकी लंबाई के बराबर गहराई की ओर इशारा करते हुए ऊपर की ओर इशारा करते हैं।
      3. पहले वर्णित बीजों का स्रोत।
      4. इसके बाद, हर 180 मिनट में 20 सेकंड के लिए मिस्टिंग करके या प्रति दिन एक बार हाथ से पानी देकर मीडिया को नम रखें।
      5. अंकुरण (लगभग 5 दिन) के बाद, प्रति दिन एक बार पानी और रोपाई के विकास का समर्थन करने के लिए आवश्यक के रूप में।
    2. मीडिया को तैयार करें।
      1. आसुत जल के 500 मिलीलीटर में 5.625 ग्राम दानेदार आगर जोड़कर क्यूपीडीए माध्यम तैयार करें; आलू डेक्सट्रोज अगर के 4.875 ग्राम जोड़ें. सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं, आटोक्लेव, और बाँझ पेट्री व्यंजनों में डालने से पहले 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। पैराफिल्म के साथ पेट्री व्यंजनों को सील करें और प्लेटों को उपयोग करने तक रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में स्टोर करें।
      2. शोरबा माध्यम तैयार करने के लिए, वजन करें और एक 1 एल बोतल में 24 ग्राम आलू डेक्सट्रोज जोड़ें। बोतल में आसुत पानी जोड़कर मिश्रण को 1000 मिलीलीटर तक लाएं, और बोतल को एक गर्म प्लेट पर रखें और भंग होने तक हिलाएं। शोरबा के 100 मिलीलीटर को 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में वितरित करें। फ्लास्क और आटोक्लेव को सील करने के लिए चीज़क्लॉथ का उपयोग करें।
    3. इनोकुलम तैयार करें।
      1. रोपण से सात दिन पहले, घुसपैठ किए गए पेपर28 के साथ पांच क्यूपीडीए प्लेटों को टीका लगाएं और उन्हें 14 घंटे / 10 घंटे के अंधेरे चक्र22 पर आठ दिनों के लिए एक इनक्यूबेटेड क्षेत्र में स्टोर करें।
      2. सातवें दिन, प्रत्येक250 mL Erlenmeyer फ्लास्क में दो 1 सेमी 2 अगर प्लग स्थानांतरित करें जिसमें 100 mL आलू डेक्सट्रोज होता है। Erlenmeyer फ्लास्क को 14 घंटे / 10 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र पर 7 दिनों के लिए 200 आरपीएम पर एक बेंचटॉप शेकर पर रखें।
      3. टीकाकरण के दिन (बुवाई के 14 दिन बाद), बाँझ चीज़क्लॉथ की चार परतों के माध्यम से इनोकुलम को छानकर बीजाणुओं की कटाई करें।
      4. पहले वर्णित हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके फ्लास्क में माइक्रोकोनिडियल एकाग्रता निर्धारित करें। एक प्लास्टिक टब (40.6 सेमी चौड़ाई x 67.3 सेमी लंबाई x 16.8 सेमी गहराई) में 7 एल इनोकुलम निलंबन तैयार करें, जो बीजाणु निलंबन की सही मात्रा को बाँझ पानी में स्थानांतरित करके 1 × 106 mL−1 (चित्रा 7A) की अंतिम बीजाणु सांद्रता के लिए बाँझ पानी में स्थानांतरित करता है।
  2. टीका
    1. बुवाई के चौदह दिन बाद (कम से कम पहली सच्ची पत्ती चरण), रोपाई के साथ सेल आवेषण को वेबेड ट्रे (26.9 सेमी चौड़ाई x 53.7 सेमी लंबाई x 6.28 सेमी गहराई) में स्थानांतरित करें। धीरे से 7 एल इनोकुलम निलंबन युक्त एक प्लास्टिक टब में रोपाई के साथ वेब्ड ट्रे जगह. एक समय में प्रत्येक ट्रे को टीका लगाएं (चित्रा 7 बी)।
    2. रोपाई को 15 मिनट के लिए इनोकुलम में बिना किसी बाधा के रहने दें। 15 मिनट के बाद, धीरे से संक्रमित रोपाई वाले सेल आवेषण को छेद-कम ट्रे (27.9 सेमी चौड़ाई x 53.3 सेमी लंबाई x 5.1 सेमी गहराई) में स्थानांतरित करें। प्रत्येक ट्रे के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    3. ग्रीनहाउस बेंच और पानी पर आवश्यकतानुसार छेद-रहित ट्रे रखें। रूट-डुबकी bioassay के लिए वर्णित के रूप में एक ही प्रकाश और पर्यावरण की स्थिति बनाए रखें।

4. रोग रेटिंग

  1. रेटिंग के लिए समय अंतराल का चयन करें.
    1. रूट-डुबकी और संशोधित ट्रे-डुबकी विधियों के लिए, प्लांटलेट्स को टीका लगाने के एक सप्ताह बाद रेटिंग शुरू करें और चार और हफ्तों तक साप्ताहिक रूप से जारी रखें।
      नोट:: संयुक्त डेटासेट इस अवधि के दौरान टिप्पणियों के पांच सेट शामिल होंगे।
    2. कर्नेल विधि का उपयोग करते समय, केवल एक बार रोपाई उभरने के बाद रेटिंग शुरू करें और कुल छह रेटिंग के लिए साप्ताहिक जारी रखें।
  2. घटना का निरीक्षण करें और गणना करें।
    1. प्रत्येक रेटिंग के दौरान, रोग की प्रगति को दस्तावेज करने के लिए डिजिटल छवियां लें।
    2. विल्ट और पौधे की मौत की घटनाओं की रिपोर्ट करें। स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में रोगसूचक पौधों के योग और उस खेती में पौधों की कुल संख्या के अनुपात के रूप में मृत पौधों की संख्या लेकर घटनाओं की गणना करें।
  3. परिणामों का विश्लेषण करें। cultivars के बीच और प्रयोग समूहों के बीच संक्रमण के पैटर्न की तुलना करें यदि नियंत्रण का उपयोग किया गया था।

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Representative Results

ये प्रयोग आमतौर पर उगाए जाने वाले किस्मों के सापेक्ष प्रतिरोध को परिभाषित करने में मदद करते हैं (तालिका 1)। इस जानकारी का उपयोग तब स्थानीय फोन आबादी के आधार पर प्रबंधन सिफारिशों का मार्गदर्शन करने के लिए किया जा सकता है। दूसरे शब्दों में, यदि दौड़ 0 या 1 को वाणिज्यिक क्षेत्र में मौजूद होने के लिए जाना जाता है, तो किसान एक "प्रतिरोधी" किस्म जैसे कि कैलहौन ग्रे, सनसुगर, या समकक्ष विकसित करने के लिए इच्छुक हो सकता है। सभी तरीकों का उपयोग करके बायोएसेस के परिणाम बताते हैं कि जब रोपाई एक रेस 1 आइसोलेट से संक्रमित थी, तो ब्लैक डायमंड और चार्ल्सटन ग्रे किस्मों की मृत्यु हो गई या गंभीर लक्षण दिखाए गए, जबकि कैलहॉन ग्रे और पीआई कल्टीवर्स ने प्रतिरोध दिखाया (तालिका 2 और चित्रा 8 ए)।

सभी तरीकों से पता चला है कि जब रोपाई रेस 3 आइसोलेट से संक्रमित थे, तो सभी किस्मों के लगभग सभी पौधों की मृत्यु हो गई या गंभीर लक्षण दिखाए गए (चित्रा 8 बी)। इन परिणामों से पता चलता है कि कैसे दोनों इनोक्यूलेशन विधियों का उपयोग करके बायोएसेस सफलतापूर्वक फोन की दौड़ के बीच अंतर करते हैं। रोगग्रस्त पौधों की उपस्थिति सभी तरीकों के लिए समान होनी चाहिए। एकमात्र अंतर यह है कि कैसे cultivars स्थानिक रूप से समूहीकृत कर रहे हैं। रूट-डुबकी और संशोधित ड्रे-डुबकी विधियों के लिए, cultivars ट्रे के स्तंभों द्वारा आयोजित किया जाएगा, जबकि कर्नेल विधि में, cultivars अपने स्वयं के बर्तन में समूहीकृत किया जाएगा।

Figure 1
चित्रा 1: RDM के लिए प्रयोगात्मक क्षेत्र। लक्षण परिवर्तनशीलता के कारण, जो सापेक्ष आर्द्रता, तापमान, फोटोपीरियड और प्रकाश तीव्रता जैसी पर्यावरणीय स्थितियों पर अत्यधिक निर्भर है, एक विनियमित प्रयोगात्मक क्षेत्र को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: RDM के लिए शुरुआती फ्लैट तैयार करना। रोपण माध्यम के साथ फ्लैट शुरू करने वाले 8 x 16-सेल (25 सेमी चौड़ाई x 50 सेमी लंबाई) भरें और मिट्टी को थोड़ा संपीड़ित करने के लिए नीचे टैप करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: RDM के लिए conidial निलंबन की तैयारी. (ए) अलगाव और खेती। या तो एक संग्रहीत या नए एकत्र किए गए नमूने से, अलग और संस्कृति एक एफ ऑक्सीस्पोरम एफ एसपी एनपीडीए की एक प्लेट पर ब्याज का निवम तनाव इस बिंदु पर कि इसकी वृद्धि आधे प्लेट को कवर करती है। यह दर्शाता है कि यह सक्रिय और व्यवहार्य है, जो बाद के चरणों में अनाज के पर्याप्त संक्रमण के लिए आवश्यक है। (बी) कोनिडिया को डिस्लोडिंग। मध्यम सतह पर एक बाँझ सेल स्प्रेडर को स्क्रैप करके कोनिडिया को हटा दें। (c) निलंबन निक्षेपण। तरल कोनिडिया निलंबन पूल और यह एक बाँझ 50 mL संस्कृति ट्यूब के लिए स्थानांतरण. संक्षिप्त नाम: qPDA = एक चौथाई ताकत आलू dextrose आगर माध्यम. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: संगठन और RDM के लिए रोपाई के भंवर. (ए) cultivars का पृथक्करण. अस्थायी रूप से उपयोग करने तक नल के पानी के साथ साफ कंटेनरों में कुल्ला पौधों को स्टोर करें, cultivars को अलग रखते हुए। (बी) रोपाई का भंवर। भंवर 6 x 12 styrofoam फ्लैटों में प्रति सेल एक एकल plantlet रोपण के लिए 30 s के लिए जलमग्न plantlet जड़ों के साथ ट्यूबों. एक ही कल्टीवर के पौधों को ट्रे में एक ही कॉलम में रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: IKM के लिए गुठली की तैयारी और संक्रमण( A) राई जामुन का Imbibition. एक पैमाने पर, किसी भी पर्याप्त रूप से बड़े कंटेनर में राई (Secale spp.) जामुन (या Maxie var. wheat (Triticum spp.) गुठली) के 200 ग्राम को मापें और उन्हें एक या अधिक 1 L ग्लास Erlenmeyer फ्लास्क में डालें। कम से कम 5 सेमी तक अनाज को पूरी तरह से कवर करने के लिए फ्लास्क में बाँझ नल का पानी जोड़ें। (बी) फ्लास्क को सूखाना। फ्लास्क से पानी निकालें, चीज़क्लॉथ में लिपटे कपास रोल के एक टुकड़े के साथ उद्घाटन प्लग करें, और एल्यूमीनियम पन्नी लपेटें के साथ उद्घाटन को कवर करें। (सी) आटोक्लेव सेटअप। बैग को एक प्लास्टिक, आटोक्लेव-सुरक्षित बिन में रखें। बैग में अनाज को ऑटोक्लेव करते समय धातु के डिब्बे का उपयोग न करें, क्योंकि इससे बैग पिघल सकते हैं। एल्यूमीनियम पन्नी लपेटो के साथ बिन कवर. (घ) थैलियों का भंडारण। बैग को सीधा स्टोर करें। सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर को अधिकतम गैस विनिमय को सक्षम करने के लिए बैग के विरोधी पक्ष से दूर खींच लिया गया है। (ई) एक बड़ी प्लास्टिक की थैली में संक्रमित गुठली के 14 अनाज को मापें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: तरबूज के बीजों की बुवाई और अंकुरण। (क) गमलों में कल्टीवर के बीज बोना। प्रत्येक बर्तन में छह बीज बोएं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक बर्तन में केवल एक कल्टीवर से बीज होते हैं। बीज के शीर्ष छोर के साथ बीजों को ऊपर की ओर रखें ताकि उद्भव के दौरान उचित विकास की अनुमति मिल सके। (ख) बीज अंकुरण। एक स्प्रे बोतल का उपयोग करके, पानी के साथ ऊपरी 0.3-0.6 सेमी मिट्टी को गीला करें। बीज अंकुरण के लिए एक आर्द्र वातावरण बनाने के लिए प्रत्येक बर्तन के नीचे और उसके ऊपर एक स्पष्ट प्लास्टिक डिश (15 सेमी व्यास) रखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: एमटीडीएम के लिए इनोकुलम तैयारी और अंकुर टीका। (ए) इनोकुलम की तैयारी। पहले वर्णित हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके फ्लास्क में माइक्रोकोनिडियल एकाग्रता निर्धारित करें। 1 × 10 6 mL−1 की अंतिम बीजाणु सांद्रता के लिए बीजाणु निलंबन की सही मात्रा को बाँझ पानी में स्थानांतरित करके एक प्लास्टिक टब (40.6 सेमी चौड़ाई × 67.3 सेमी लंबाई ×16.8 सेमी गहराई) में एक 7 एल इनोकुलम निलंबन तैयार करें। (बी) रोपाई को टीका लगाना। बुवाई के चौदह दिन बाद (कम से कम पहली सच्ची पत्ती चरण), रोपाई के साथ सेल आवेषण को वेबेड ट्रे में स्थानांतरित करें (26.9 सेमी चौड़ाई × 53.7 सेमी लंबाई × 6.28 सेमी गहराई)। धीरे से 7 एल इनोकुलम निलंबन युक्त एक प्लास्टिक टब में रोपाई के साथ वेब्ड ट्रे जगह. प्रत्येक ट्रे को एक समय में एक टीका लगाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: दौड़ की पहचान विधियों के फेनोटाइपिक परिणाम। (ए) रेस 1 परिणाम। (ए) सभी तरीकों का उपयोग करके बायोएसेस के परिणाम बताते हैं कि जब रोपाई रेस 1 आइसोलेट से संक्रमित हो गई थी, तो ब्लैक डायमंड और चार्ल्सटन ग्रे कल्टीवर्स की मृत्यु हो गई या गंभीर लक्षण दिखाए गए, जबकि कैलहौन ग्रे और पीआई कल्टीवर्स ने प्रतिरोध दिखाया। (बी) रेस 3 परिणाम। सभी तरीकों से पता चला कि जब रोपाई को रेस 3 आइसोलेट से संक्रमित किया गया था, तो सभी किस्मों के लगभग सभी पौधों की मृत्यु हो गई या गंभीर लक्षण दिखाए गए। (रोगग्रस्त पौधों की उपस्थिति सभी तरीकों के लिए समान होनी चाहिए। तीर द्वारा दिखाए गए रोपण का क्रम (बाएं से दाएं): ब्लैक डायमंड (नीला तीर), चार्ल्सटन ग्रे (बैंगनी तीर), कैलहॉन ग्रे (भूरा तीर), प्लांट परिचय 296341-एफआर (हरा तीर)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Cultivar रेस 0 रेस 1 रेस 2 रेस 3
चीनी बेबी, ब्लैक डायमंड S S S S
Charleston ग्रे, Allsweet, Dixielee R S S S
कैलहॉन ग्रे, सनसुगर R R S S
PI-296341-FR R R R S

तालिका 1: Fusarium oxysporum f. sp की दौड़। निवेम । Fusarium oxysporum f. sp. niveum की दौड़ तरबूज के अंतर के एक सेट के लिए अतिसंवेदनशील या प्रतिरोधी प्रतिक्रियाओं द्वारा निर्धारित की जाती है। प्रत्येक पंक्ति में सूचीबद्ध cultivars एक अलग की दौड़ के मूल्यांकन के दौरान प्रतिरोध के प्रत्येक स्तर का प्रतिनिधित्व करने के लिए सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। इस तालिका को 4 से संशोधित किया गया है. संक्षेप: S = अतिसंवेदनशील; R = प्रतिरोधी।

अलग पद्धति BD CH. G कैल जी। पाइ जाति
S जैसा S जैसा S जैसा S जैसा
X डुबकी 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X गिरी 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X MTD 6 0 6 0 0 6 0 6 1
Y डुबकी 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y गिरी 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y MTD 6 0 6 0 6 0 6 0 3
S = रोगसूचक; AS = स्पर्शोन्मुख

तालिका 2: दौड़ की पहचान। इस तालिका में उपयोग किए जाने वाले मान स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में घटनाओं या रोगसूचक पौधों की संख्या को दर्शाते हैं, और उस खेती में पौधों की कुल संख्या के अनुपात के रूप में मृत पौधों की संख्या। प्रत्येक सेल में संख्याएं अवलोकन अवधि के अंत में रिपोर्ट की गई घटनाओं को दर्शाती हैं। एक कल्टीवर को अतिसंवेदनशील माना जाता है जब उस कल्टीवर के कम से कम 1/3 या 33% पौधे रोगसूचक या मृत होते हैं। रोगज़नक़ की दौड़ तब निर्धारित की जाती है जिसके आधार पर cultivars अतिसंवेदनशील माना जाता है। दूसरे शब्दों में, बढ़ते प्रतिरोध के साथ रोगजनक cultivars के खिलाफ कैसे प्रदर्शन करता है, यह अलग-थलग की दौड़ को निर्धारित करता है। ये परिणाम एक वास्तविक परीक्षण से नहीं हैं और बल्कि यह बताने के लिए दिखाए गए हैं कि इन तरीकों के परिणामों से दौड़ की पहचान कैसे की जाती है। संक्षेप: MTD = संशोधित ट्रे-ड्रिप विधि; बीडी = ब्लैक डायमंड; CH. G = Charleston Grey; Cal G. = Calhoun Grey; पीआई = संयंत्र परिचय 296341-FR; S = रोगसूचक; AS = स्पर्शोन्मुख।

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Discussion

रेस टाइपिंग के तीन तरीके प्रस्तुत किए गए हैं। इन विधियों में से प्रत्येक विशेष प्रश्नों और प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए सबसे उपयुक्त है। संक्रमित कर्नेल इनोक्यूलेशन विधि (मिट्टी का संक्रमण) शायद सरल और अधिक सीधा है, जिससे यह रोगजनकता30 के मूल्यांकन के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो जाता है। सरल दौड़-टाइपिंग के लिए इस विधि का उपयोग करना अत्यधिक प्रभावी है। हालांकि, एक विशिष्ट किस्म के प्रतिरोध को निर्धारित करने के लिए विधि को लागू करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, यह देखते हुए कि प्रत्येक पौधे को संक्रमण या जोखिम की समान डिग्री का सामना नहीं करना पड़ सकता है, और ब्याज की किस्मों के प्रतिरोध का परीक्षण करने के लिए समान रूप से उच्च स्तर की बीमारी की आवश्यकता हो सकती है। यह मामला है क्योंकि इस तरह से उत्पादित इनोकुलम अच्छी तरह से परिमाणित नहीं है, और व्यवहार्य प्रोपागुल्स का अनुपात, या रूट ज़ोन तक पहुंचने वाले संक्रामक प्रोपेगुल्स की संख्या, अच्छी तरह से विनियमित नहीं है31। साथ ही, यह विधि जड़ क्षेत्र के लिए लगाए गए गुठली की निकटता में विसंगतियों द्वारा सीमित है। यदि बहुत दूर है, तो बीजाणु अंकुरित नहीं हो सकते हैं, या हाइफे जड़ों तक पहुंचने के लिए पर्याप्त विकसित नहीं हो सकता है।

रूट-डुबकी विधि32,33 अधिक श्रमसाध्य और समय लेने वाली है; हालांकि, क्योंकि संयंत्र के साथ बातचीत करने वाले व्यवहार्य प्रोपेगुल्स की मात्रा को अधिक सटीक रूप से मापा जाता है, मेजबान प्रतिरोध को अधिक सटीक रूप से वर्णित किया जा सकता है, जिससे प्रतिरोध स्क्रीनिंग की सुविधा मिलती है। इसके अलावा, एक ही दौड़ के भीतर वायरस में अंतर को अधिक आसानी से पता लगाया जा सकता है। इस विधि में अतिरिक्त लाभ है कि आम तौर पर, पौधे कर्नेल विधि की तुलना में पहले और अधिक अभिव्यंजक रूप से रोगसूचक हो जाते हैं। कोनिडिया के बजाय इनोकुलम निलंबन में क्लैमाइडोस्पोर का उपयोग करके रूट-डिप विधि के एक संस्करण में इस लाभ की कमी हो सकतीहै 6। इसी तरह, संशोधित ट्रे-डुबकी विधि22 श्रम-गहन है, लेकिन उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिंग के लिए अनुमति देता है जब कई आइसोलेट्स और रोपाई को जांचने की आवश्यकता होती है।

तीन तरीकों के लिए साझा कारकों में खेती का चयन, बढ़ती स्थिति और स्वच्छता के लिए आवश्यकताएं शामिल हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध के आधार पर, कुछ cultivarsको 21,34 प्रतिस्थापित किया जा सकता है। चीनी बेबी और ब्लैक डायमंड दोनों का उपयोग रेस 0 आइसोलेट्स को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जबकि चार्ल्सटन ग्रे, ऑलस्वीट और डिक्सिली को रेस 0 के लिए प्रतिरोधी के रूप में वर्णित किया गया है, लेकिन रेस 1 के लिए अतिसंवेदनशील है। Calhoun ग्रे और Sunsugar दौड़ 0 और 1 के लिए प्रतिरोधी हैं और दौड़ 2 और 3 के लिए अतिसंवेदनशील हैं। फोन रोग का विकास अत्यधिक तापमान पर निर्भर करता है। यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि प्रयोगात्मक स्थितियां इस चर के लिए नियंत्रण करती हैं। एक रोपण माध्यम चुनते समय, सामान्य वाणिज्यिक मिश्रण जिसमें पीट काई और / या जिप्सम शामिल हैं और अच्छे वातन की अनुमति देते हैं, संतोषजनक होना चाहिए। दोनों तरीकों से रोपण मीडिया के क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए, खासकर स्रोत बैग से।

वर्णित तरीकों में से एक का उपयोग करने के बाद, बीमारी का सटीक और लगातार मूल्यांकन किया जाना चाहिए। पिछले शोधकर्ताओं ने आमतौर पर एक दहलीज पर फैसला किया है जिस पर पौधों को या तो अतिसंवेदनशील या प्रतिरोधी35,36 के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। उदाहरण के लिए, यदि एक विशिष्ट किस्म के 33% से कम पौधे रोगसूचक थे, तो उस कल्टीवर को कल्टीवर के अतिसंवेदनशील प्रोफ़ाइल के संबंध में परिभाषित आइसोलेट के साथ प्रतिरोधी के रूप में वर्गीकृत किया जाएगा। थ्रेशोल्ड सेट को शोधकर्ता द्वारा परिभाषित किया गया है और जिस प्रश्न को वे संबोधित करना चाहते हैं। रेटर्स के बीच परिवर्तनशीलता और पौधों के बीच एक ही रेटर द्वारा व्यापक रूप से37,38 की सूचना दी गई है। उपयोग किए गए बीज की गुणवत्ता, मिट्टी की गुणवत्ता, इनोकुलम घनत्व, आइसोलेट्स की भंडारण आयु, और रेटर पूर्वाग्रह39,40 जैसे कारक सभी इस परिवर्तनशीलतामें योगदान करते हैं। इनोक्यूलेशन और पीआई कल्टीवर प्रतिक्रियाओं में इस परिवर्तनशीलता के कारण, कई प्रयोगात्मक प्रतिकृतियों की आवश्यकता होती है; आदर्श रूप से, कम से कम तीन लेकिन पांच प्रतिकृतियों की सिफारिश की जाती है, जिसमें प्रति किस्म प्रतिकृति प्रति 6 पौधे होते हैं।

जबकि आणविक assays 41,42,43 Fon आइसोलेट्स का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है, परिणाम एफ ऑक्सीस्पोरम की polyphyletic प्रकृति और प्रजातियों के जटिल44,45,46 की भौगोलिक और जीनोमिक परिवर्तनशीलता के कारण सुसंगत नहीं किया गया है। इसके अलावा, हालांकि पूर्व अनुसंधान ने जाइलम (छह) प्रभावकों में स्रावित के महत्व को पूर्ण उग्रता में स्थापित किया है, प्रभावकों का सटीक पूरक जो फोन आइसोलेट्स की नस्लीय संरचना को परिभाषित करता है, अभी तक निर्धारित नहीं किया गया है। दौड़ के लिए आणविक निदान अभी भी विकसित किए जा रहे हैं, जिसके लिए ये फेनोटाइपिक तकनीकें फोन रेस टाइपिंग19,47 में उनकी सटीकता और उपयोगिता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

हम डॉ अली और प्लांट मॉलिक्यूलर डायग्नोस्टिक लैबोरेटरी के साथ-साथ जॉर्जिया विश्वविद्यालय में डॉ पिंगशेंग जी को स्वीकार करना चाहते हैं, जिनके नेतृत्व और समर्थन ने हमारे फोन कार्यक्रम को स्थापित करने में मदद की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed - Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed - Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed - Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed - PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed

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जीव विज्ञान अंक 176
अज्ञात <em>Fusarium oxysporum</em> f.sp की दौड़ निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली तीन इनोक्यूलेशन तकनीकों का एक विपरीत। <em>निवेम</em> आइसोलेट्स
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Fulton, J. C., Cullen, M. A.,… More

Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).

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