Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En kontrast av tre inokulasjonsteknikker som brukes til å bestemme løpet av ukjent Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolerer

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63181
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 3, 4,5, 6, 1
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

Håndtering av Fusarium wilt av vannmelon krever kunnskap om patogenløpene som er tilstede. Her beskriver vi rotdipp, infisert kjernesåing og modifiserte inokulasjonsmetoder for å demonstrere deres effekt i raseskriving av den patogene sopp fusariumoksysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

Fusarium wilt av vannmelon (Citrullus lanatus), forårsaket av Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), har reemerged som en stor produksjonsbegrensning i det sørøstlige USA, spesielt i Florida. Distribusjon av integrerte pesthåndteringsstrategier, for eksempel rasespesifikke motstandsdyktige kultivarer, krever informasjon om patogenets mangfold og befolkningstetthet på dyrkerfeltene. Til tross for noen fremskritt i å utvikle molekylære diagnostiske verktøy for å identifisere patogenisolasjoner, krever rasebestemmelse ofte bioassay tilnærminger.

Racemetoden ble utført av root-dip inokulering, infisert kjerne såing metode, og den modifiserte skuff-dip metoden med hver av de fire vannmelon differensialer (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Isolasjoner tildeles en rasebetegnelse ved beregning av sykdomsforekomst fem uker etter inokulasjon. Hvis mindre enn 33% av plantene for en bestemt kultivar var symptomatiske, ble de kategorisert som motstandsdyktige. De kultivarer med forekomst større enn 33% ble ansett som utsatt. Dette dokumentet beskriver tre forskjellige metoder for inokulasjon for å fastslå rase, rotdipp, infisert kjerne og modifisert skuff-dip inokulasjon, hvis applikasjoner varierer i henhold til eksperimentell design.

Introduction

De jordbårne soppene som utgjør Fusarium oxysporum artskomplekset (FOSC) er virkningsfulle hemibiotrofiske plantepatogener som kan forårsake alvorlig sykdom og gi tap i et mangfoldig utvalg av avlinger1. Fusarium wilt av vannmelon, forårsaket av F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), har økt i omfang, forekomst og alvorlighetsgrad over hele verden de siste tiårene 2,3. I frøplanter vil symptomene på Fusarium ofte ligne demping. I eldre planter blir løvet grått, klorotisk og nekrotisk. Til slutt går vanning av plantene til full plantekollaps og død4. Direkte utbyttetap oppstår på grunn av symptomene og plantedøden, mens indirekte utbyttetap kan oppstå på grunn av solskader forårsaket av eliminering av bladtaket5. Seksuell reproduksjon og tilhørende reproduktive strukturer har aldri blitt observert i F. oksysporum. Patogenet produserer imidlertid to typer aseksuelle sporer, mikro- og makroøkonomi, samt større, langsiktige overlevelsesstrukturer kalt chlamydospores, som kan overleve i jorda i mange år6.

FOSC er klassifisert i formae spesialtilbud basert på observerte vertsområder, vanligvis begrenset til en eller noen få vertsarter1. Selv om nyere forskning har indikert at dette artskomplekset kan være en sammensetning av 15 forskjellige arter, er de spesielle artene som infiserer vannmelon for tiden ukjente7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) er navnet på gruppene av stammer som utelukkende infiserer Citrullus lanatus eller den tamme vannmelonen 8,9. F. oxysporum stammer innenfor de fleste patogene formae spesialiteter viser visse nivåer av mangfold med hensyn til deres genetiske komponenter og virulens mot en vertsart. For eksempel kan en stamme infisere alle kultivarer av en vert, mens en annen bare kan infisere de mer utsatte kultivarer. For å gjøre rede for en slik variasjon, er disse gruppene uformelt klassifisert i raser basert på evolusjonære forhold eller vanlige fenotypiske egenskaper. Innenfor Fon har fire løp (0, 1, 2 og 3) blitt karakterisert basert på deres patogenitet mot et sett med utvalgte vannmelonkulturer, med oppdagelsen av rase 3 som forekommer nylig10.

Til tross for dette tilsynelatende mangfoldet, er morfologiene til sporer eller hyphae ikke skille mellom løpene til Fon-raser, noe som betyr at molekylære eller fenotypiske analyser er nødvendige for å identifisere en isolats unike rase11. Molekylær forskning har identifisert noen genetiske forskjeller. For eksempel har rollen som utskilt i Xylem (SIX) effektorer blitt studert i årevis i F. oksysporum, og noen av disse effektorene har vært plassert på kromosomene som utveksles under horisontal genoverføring12. For eksempel finnes SIX6 i Fon løp 0 og 1, men ikke i løp 213. SEKS effektorer har blitt involvert i patogenisiteten til F. oxysporum f. sp. lycopersici og F. oxysporum f. sp. cubense, som forårsaker Fusarium wilt på tomat og banan, henholdsvis 14,15,16,17. Analysen av SEKS effektorprofiler blant stammer av F. oxysporum f. sp. spiniciae, Fusarium wilt patogen på spinat, har aktivert klassifisering som nøyaktig gjenspeiler genetisk og fenotypisk mangfold18. Forskjellene mellom virulensmekanismer for Fon-løp er imidlertid for tiden ikke helt forstått, og molekylære analyser utviklet ved bruk har vist inkonsekvente og unøyaktige resultater19. Derfor er fenotypiske resultater fra infeksjonsanalyser for tiden den beste måten å klassifisere isolasjoner på.

F. oxysporum infiserer først verter gjennom røttene før de tar seg opp xylem20. Dette gjør direkte inokulering av røttene til en gitt vertskultivar en effektiv måte å utføre race-skriving på og er grunnlaget for rotdipp- og skuff-dip-inokuleringsmetodene21. Når du ikke smitter en vert, ligger F. oxysporum i jorda og kan forbli sovende i årevis. Voksende mottakelige vannmelon kultivarer i jord fra et interessefelt er en måte å teste for tilstedeværelsen av Fon. Å utvide denne metoden til å omfatte kultivarer av forskjellige kjente nivåer av motstand i jord som bevisst er infisert med Fon, er også en god måte å utføre raseskriving (tabell 1) og er grunnlaget for den infiserte kjernesåingsmetoden. Den modifiserte skuffdippmetoden er en variant av den opprinnelige skuffdippmetoden som gir mulighet for en høy gjennomstrømningsløpsskriving der mange planter og feltisolasjoner kan undersøkes raskt22. Viktige faktorer i en rask og vellykket raseskriving bioassay inkluderer bruk av kultivarer som har dokumentert forskjeller i motstand mot de forskjellige patogenløpene, sikre at inoculum er både biologisk aktiv og rikelig under infeksjon, opprettholde et miljø som både bidrar til patogen og vert, og bruker et konsistent vurderingssystem for alvorlighetsgrad eller forekomst av sykdom. Dette dokumentet beskriver rot-dip23,24, infisert kjerne seeding25,26, og modifisert skuff-dip22 metoder for fenotypisk rase-skriving basert på prinsippene beskrevet ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bestemme rase ved root-dip metode (RDM)

  1. Forberedelse av det eksperimentelle miljøet
    1. Fordi symptomuttrykk er svært avhengig av miljøforhold, opprettholder du planter i et kontrollert område. Overvåk relativ fuktighet, temperatur, fotoperiod og lysintensitet (figur 1).
      1. Sett temperaturen til 26-28 °C, relativ fuktighet til 50-75 %, og sett en fotoperiod på 16 timer for å sikre tilstrekkelig plantevekst og helse.
        MERK: For å forhindre hypoksi, frøplante og/eller frørot må du ikke overvanne eller tillate stående vann rundt plantene.
      2. Bruk to fluorescerende rørlys, hver med minst 1850 lumen lys og en fargetemperatur på 2800 K per lysbank for å støtte fotosyntetisk vekst.
      3. Hold området rent og bruk hygieniske praksiser, inkludert fjerning av avfallsjord og planteavfall, for å forhindre skadedyrsskader og tilfeldig infeksjon.
    2. Planteforhold
      1. Fyll 8 x 16 celler (25 cm bredde x 50 cm lengde) med startflater med plantemedium og trykk ned for å komprimere jorda litt (figur 2).
      2. Få frø av de fire differensialkultivarene: Black Diamond/Sugar Baby, Charleston Grey/Allsweet/Dixielee, Calhoun Grey og PI-296341-FR.
      3. Så frø med deres topp (spiss ende) peker oppover til en dybde som er lik lengden. Etter at frøene er sådd, dekk mediet som inneholder de begravde frøene med 100% Fullers jord eller annet bentonitt leirealternativ til en dybde på 0,3175-0,635 cm.
      4. Tåke leilighetene for å dempe mediet uten å skape stående eller samlende vann. Etterpå holder du mediene fuktige ved å tåke i 20 s hver 180 min, eller vanne for hånd en gang per dag til frøspredning i ca. 5 dager. Etter spiring, vann en gang per dag og etter behov for å støtte veksten av frøplanter.
    3. Forberedelse av medier
      MERK: Begge mediene er laget fast med ekstra granulert agar for å muliggjøre sporehøsting ved å skrape overflaten.
      1. Avklart V8 juice medium (V8)
        1. Forbered 500 ml klargjort V8 juice medium (V8)27 ved å tilsette 100 ml klargjort V8 original 100% vegetabilsk juice med 1% CaCO3 til 400 ml destillert vann.
        2. Tilsett 7,5 g granulert agar.
        3. Bland ingrediensene godt, autoklaver, og la det avkjøles til 50 °C før det helles i sterile Petri-retter.
      2. Kvartstyrke potet dextrose agar media (qPDA)
        1. Forbered qPDA medium ved å legge til 4,5 g granulert agar til 500 ml destillert vann, tilsett 3,8 g potetdekstrose agar.
        2. Bland ingrediensene godt, autoklaver, og la det avkjøles til 50 °C før du heller 12-15 ml i sterile Petri-retter.
  2. Utarbeidelse av eksperimentelle behandlinger
    1. Forbered inokulumet.
      1. Fem dager etterplanting (dpp), plasser infiltrerte papirskiver (1-1,25 cm diameter) som inneholder den foretrukne F. oksysporumisolerer på en V8 og en qPDA-plate og oppbevarer dem i en inkubator (~28 °C) i åtte dager28 (figur 3A).
      2. På den åttende dagen med soppvekst og dagen før inokulering (se pkt. 1.3.2), overfør V8- og qPDA-platene fra inkubatoren til et biosikkerhetsskap.
      3. For hver isolat, dispenser 6 ml sterilisert deionisert vann på hver V8- og qPDA-kulturplate.
      4. Løsne conidia ved å skrape en steril cellespreder over middels overflate (figur 3B). Samle væskekonidialfjæringen og overfør den til et sterilt 50 ml kulturrør (figur 3C).
      5. Gjenta denne prosessen til det totale flytende krydderfjæringsvolumet i 50 ml kulturrør er ca. 12 ml.
      6. Før du går videre til en annen isolasjon, må du overflatesterilisere arbeidsområdet og cellesprederen med alkohol. Steriliser cellesprederen ved å sende den gjennom en Bunsen-brenner etter å ha dyppet den i ≥70% etanol.
      7. Når de flytende konidiale suspensjonene er overført til kulturrør for alle isolerer, kvantifiserer du sporetallene. Først vortex et individuelt 50 ml kulturrør og dispenser 10 μL inn i hvert kammer av et hemacytometer. Beregn deretter antall sporer i hemacytometeret som tidligere beskrevet29.
      8. Forbered den endelige inokulumløsningen ved å overføre det beregnede volumet for 106 + 10% til et annet sterilt kulturrør og bringe det totale volumet til 30 ml ved å legge til sterilt deionisert vann.
      9. Oppbevar disse kulturrørene over natten ved 8 ± 1 °C.
        MERK: Dette kan gjøres uten tap av konidial levedyktighet, som angitt av upubliserte data.
  3. Inoculation
    1. Forbered inokulasjonen.
      1. Før dagen for inokulering, vann robust tretten dager gamle frøplanter til jordbærende kapasitet.
      2. Formerke innsatsene med relevant informasjon, inkludert isolasjonen som skal testes, vannmelonkultivaren og datoen for inokulasjon.
      3. Plasser 6 x 12-cellers (20 cm bredde x 40 cm lengde) styrofoam leiligheter, tidligere desinfisert med 10% blekemiddel og godt skyllet, for å motta de inokulerte plantene.
      4. Preposisjoner alle nødvendige materialer (se materialtabellen).
    2. Inokuler plantens røtter.
      1. Vann plantene kraftig flere timer før du begynner inokulasjonen. Minst 2 timer etter vanning, fjern planteplantene fra de 8 x 16-cellers styrofoam-leilighetene og skyll røttene for å fjerne eventuelle tilstøtende plantematerialepartikler.
      2. Oppbevar de skyllede plantene midlertidig i rene beholdere med vann fra springen til bruk, og hold kultivarer atskilt fra hverandre (figur 4A). Del planteplantene i grupper på seks personer og hold plantegruppene pakket inn i våte papirhåndklær på en labbrett for å forhindre uttørking.
      3. Plasser 25-30 cm3 jord i bunnen av hver celle i 6 x 12 array styrofoam-brettet og bruk en spruteflaske for å fukte jorda til den er synlig fuktig.
      4. Inokuler plantene og replanter dem i rekkefølge i henhold til kultivaren, slik at Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey og deretter PI 296341 01 FR plantes fra venstre til høyre.
      5. Begynn med sunn kontroll, plasser en gruppe på seks uskadede frøplanter av samme kultivar i 50 ml rør som inneholder inoculum. Når det gjelder sunn kontroll, bruk vann fra springen i stedet for en sporfjæring. Inokuler plantene med positiv kontroll (Fon løp 3) sist.
      6. Når du er inne i røret, må du sørge for at planterøttene når og blir utsatt for inokulum (vann fra springen).
      7. Virvel rørene med planterøtter nedsenket i 30 s (figur 4B). Etter vortexing, plasser en enkelt plante per celle i 6 x 12 styrofoam leiligheter. Plasser plantene av samme kultivar i samme kolonne i brettet.
      8. Etter plassering desinfiserer du hanskede hender ved å holde dem i bøtter med 0,7% tilgjengelig kloroppløsning i 30 s, etterfulgt av en vannskylling fra springen i 1 min.
      9. Etterpå dekker du de plasserte planteplantene med plantemedium og sett forsiktig. Bruk en sprøyte eller pipette, vann forsiktig planteplantene med 20 ml per plantelet samtidig som du unngår sprut.
      10. Før du går videre til neste sett med planter, desinfiser hanskede hender igjen ved hjelp av kloroppløsning og en vannskylling fra springen.
      11. Etter at alle plantedyr har blitt replantet, vann dem igjen minimalt for å forhindre inoculum avrenning.
      12. Hold planteplantene over natten i et lukket, mørkt miljø med en gjennomsnittstemperatur på 27 °C. Neste dag, overfør plantene til drivhuset, og hold gjennomsnittstemperaturen ved 27 °C.
  4. Vedlikehold og pleie av inokulerte anlegg
    1. For å forhindre overløp av overskuddsvann, vann leilighetene lett tre ganger om dagen i 4-5 dager til plantene stabiliserer seg.
    2. Kontroller skuffene 2-3 ganger daglig i minst tre dager for å sikre tilstrekkelig og jevn dekning av vanning.
    3. Unngå tørking på grunn av sollys eller skyggelegging ved å rotere leilighetene og/eller gi ekstra skyggelegging/vanning etter behov.
    4. Ved 3 dpp befrukt plantene med en 20-20-20 hurtigfrigjørende gjødsel (10 g / 3,78 L) med en hastighet på 3-6 ml per liter vann.
    5. Gjødsle ukentlig i 3-4 uker.
    6. Oppretthold de samme lys- og miljøforholdene gjennom hele dette trinnet.

2. Bestemme rase ved infisert kjernemetode (IKM)

  1. Angrep av kjernene
    1. Forbered inokulumet.
      1. Enten fra en lagret eller nylig samlet prøve, isolere og kultur en F. oxysporum f. sp. niveum belastning av interesse på en tallerken qPDA til det punktet at veksten dekker halvparten av platen.
        MERK: Dette viser at det er aktivt og levedyktig, noe som er nødvendig for betydelig angrep av kornet i senere trinn.
    2. Forbered kjernene.
      1. På en skala måler du ut 200 g rug (Secale spp.) bær (eller Maxie var. hvete (Triticum spp.) kjerner) i en tilstrekkelig stor beholder og hell dem i en eller flere 1 L glass Erlenmeyer kolber. Tilsett sterilt vann fra springen i kolbeene for å dekke kornene helt opp til minst 5 cm (figur 5A).
      2. Bløtlegg kjernene ved romtemperatur (~24 °C) i 2 timer. Tøm vannet fra kolber; koble åpningen med et stykke bomullsrull innpakket i osteklær; og dekk åpningen med aluminiumsfolieinnpakning (figur 5B).
    3. Dekontaminere kjernene. Når kornet har imbibed vann, autoklaver det to ganger på to forskjellige måter å drepe andre uønskede mikrober før inokulering.
      1. I løpet av første gang autoklaverer du kornet i de tilberedte kolbeene på en tyngdekraftssyklus (121,2 °C, 1,06 kg/cm2) i 1 time med 5 min tørketid. La kolbeene avkjøles til romtemperatur.
      2. Før du autoklaverer andre gang, overfør kornene til en liten soppdyrkende pose med et 0,5 μm filter. Fjern luften fra posen og brett deretter overflødig plast rundt posen.
      3. Legg posen i en plastisk, autoklavsikker søppelkasse. Dekk beholderen med aluminiumsfolieinnpakning (figur 5C).
        MERK: Ikke bruk en metallbeholder når du autoklaverer kornene i posene, da det kan føre til at posene smelter.
      4. Autoklaver beholderen på en tyngdekraftssyklus i 1 time med 5 min tørketid, samme syklus som før.
        MERK: Posen må kun autoklaveres andre gang, ikke den første, da filteret og porten kan bli kompromittert hvis posene autoklaveres to ganger. Unngå kondens på filteret ved å la posene avkjøles sakte og helt før du fjerner dem fra autoklaven fordi vekstposefilteret blir kompromittert hvis det blir vått.
    4. Inokuler kjernene.
      1. Arbeide med kulturplaten og posen i et biosikkerhetsskap, kutte agarskiver, 6 mm i diameter, fra sonen av aktiv vekst på kulturplaten med en steril korkboring i # 4-størrelse. Brett ut posen. Bruk en streng steril teknikk, plasser 5 agarskiver i posen. Bruk en steril 50 ml gradert sylinder for å måle 35 ml sterilt vann fra springen og tilsett det i posen.
      2. Rull åpningen av posen noe og spray deretter utsiden med 70% etanol for å overflatesterilisere.
        MERK: Ikke spray filteret, da fuktigheten også vil kompromittere det.
      3. Lukk posen ved å brette hjørnene mot midten og deretter over to ganger over filteret. Fest posen med poseklemmer og klare vinylrør levert av produsenten.
        MERK: Klemmene kan brukes på nytt.
      4. Fjern posen fra biosikkerhetsskapet.
    5. Lagre patogenet for vekst.
      1. Oppbevar posen oppreist. Sørg for at filteret trekkes bort fra motsiden av posen for å muliggjøre maksimal gassutveksling (figur 5D).
      2. Inkuber materialene ved romtemperatur i ca. tre uker. Omfordel kornene regelmessig for å sikre jevn vekst av patogenet.
        MERK: Posene kan ikke brukes på nytt.
  2. Infeksjon av vannmelonplanter med infisert korn
    1. Kilde vannmelonfrø som tidligere beskrevet.
    2. Bestem de eksperimentelle gruppene.
      MERK: Den eneste stammen(e) av patogenet som kreves er isolasjonene som testes for løpsidentifikasjon. Imidlertid vil negative og positive kontroller bidra til å gjøre sammenligninger med planter uten infeksjon eller et bestemt infeksjonsnivå.
      1. For å forberede en negativ kontroll, bruk hvetekjerner sterilisert i henhold til den tidligere nevnte metoden, men uten inokulering.
      2. For å forberede en positiv kontroll, bruk hvetekjerner inokulert med en allerede klassifisert stamme for sammenligning mot den ukjente isolasjonen.
    3. Kombiner jord og korn.
      1. Mål 14 korn infiserte kjerner i en stor plastpose (figur 5E). Fyll plastpotter (15 cm diameter x 10 cm i høyden) med potteblanding for å måle mengden blanding som trengs. Tøm blandingen i posen. Lag en luftpute i posen og vri eller forsegle den lukket.
      2. Bland kjernene og jorda ved å invertere posen flere ganger. For en negativ kontroll, utfør den samme prosessen i en annen pose med rene kjerner. For en positiv kontroll, utfør den samme prosessen i en annen pose med kjerner infisert med sammenligningsstammen.
      3. Fyll fire overflatesteriliserte potter med den infiserte jordblandingen. For en negativ kontroll, pot den blandingen før du håndterer noen Fon-forurenset jord.
    4. Så vannmelonfrøene.
      1. Så seks frø i hver gryte. Forsikre deg om at hver gryte bare inneholder frø fra en kultivar. Plasser frøene med apex enden av frøet vendt opp for å tillate riktig vekst under fremveksten (figur 6A).
      2. Bruk en sprøyteflaske, fukt de øvre 0,3-0,6 cm jord med vann. Legg en klar plastfat (15 cm diameter) under og over hver gryte for å skape et fuktig miljø for frøspredning (figur 6B).
    5. Etablere vekstforhold.
      1. Vann grytene tre ganger om dagen med en sprøyteflaske for å opprettholde turgiditet uten avrenning til frøene har spiret (ca. 5 dager).
        MERK: Mengden vann som brukes vil øke med plantestørrelse og pottestørrelse.
      2. Når frøene har spiret, flytt toppretten til undersiden av potten.
      3. Vann plantene daglig etter behov for optimal plantevekst. Utsett plantene for en 16 h fotoperiod under lignende lysforhold som de som tidligere er beskrevet og en temperatur på 27 °C (± 1 °C).

3. Bestemme rase ved modifisert skuff-dip metode (MTDM)

  1. Forberedelse av materialene for inokulasjoner
    1. Etablere planteforhold.
      1. Fyll 48-cellers (3,68 cm bredde x 5,98 cm lengde x 4,69 cm dybde) innsatser med dampfri sand: torv: vermikulitt (4:1:1) og trykk ned for å komprimere jorda litt. Plasser innsatsene i plastskuffer (27,9 cm bredde x 53,3 cm lengde x 5,1 cm dybde).
      2. Så frøene med deres topp (proksimal ende) som peker oppover til en dybde som er lik lengden.
      3. Kilde frøene som tidligere beskrevet.
      4. Etterpå holder du mediene fuktige ved å tåke i 20 s hver 180 min eller vanne for hånd en gang per dag.
      5. Etter spiring (ca. 5 dager), vann en gang per dag og etter behov for å støtte veksten av plantene.
    2. Forbered mediet.
      1. Forbered qPDA medium ved å legge til 5.625 g granulert agar til 500 ml destillert vann; tilsett 4.875 g potet dextrose agar. Bland ingrediensene godt, autoklaver og avkjøl til 50 °C før du heller i sterile Petri-retter. Forsegle Petri-rettene med parafilm og oppbevar platene i kjøleskap (4 °C) til bruk.
      2. For å forberede kjøttkraftmedium, vei og tilsett 24 g potet dextrose i en 1 L flaske. Ta blandingen til 1000 ml ved å tilsette destillert vann til flasken, og legg flasken på en varm tallerken og rør til den er oppløst. Dispenser 100 ml av buljongen i 250 ml Erlenmeyer-kolber. Bruk osteklær til å forsegle kolber og autoklav.
    3. Forbered inokulumet.
      1. Syv dager før planting inokulerer du fem qPDA-plater med infiltrert papir28 og lagrer dem i et inkubert område i åtte dager på en 14 t / 10 t mørk syklus22.
      2. På den syvende dagen, overfør to 1 cm2 agar plugger inn i hver 250 mL Erlenmeyer kolbe som inneholder 100 ml potet dextrose. Plasser Erlenmeyer-kolber på en benkeplate shaker ved 200 rpm i 7 dager på en 14 t / 10 t lys / mørk syklus.
      3. På dagen for inokulering (14 dager etter sådd), høst sporene ved å filtrere inoculum gjennom fire lag steril osteklut.
      4. Bestem mikrokontroidiell konsentrasjon i kolber ved hjelp av et hemocytometer som tidligere beskrevet. Forbered en 7 L inoculum suspensjon i et plastkar (40,6 cm bredde x 67,3 cm lengde x 16,8 cm dybde) ved å overføre riktig volum av sporfjæring til sterilt vann for en endelig sporekonsentrasjon på 1 × 106 ml−1 (figur 7A).
  2. Inoculation
    1. Fjorten dager etter sådd (minst første sanne bladstadium), overfør celleinnleggene med plantene i webbed skuffer (26,9 cm bredde x 53,7 cm lengde x 6,28 cm dybde). Plasser forsiktig webbed skuffer med plantene i et plastbad som inneholder 7 L inoculum suspensjon. Inokuler hver skuff én om gangen (figur 7B).
    2. La plantene forbli i inoculum uforstyrret i 15 min. Etter 15 minutter overfører du forsiktig celleinnsatsene som inneholder de inokulerte plantene, til hullfrie skuffer (27,9 cm bredde x 53,3 cm lengde x 5,1 cm dybde). Gjenta denne prosessen for hver skuff.
    3. Plasser de hullfrie brettene på drivhusbenken og vannet etter behov. Opprettholde de samme lys- og miljøforholdene som beskrevet for rotdipp-bioassay.

4. Sykdomsvurdering

  1. Velg tidsintervaller for vurdering.
    1. For rotdipp og modifiserte skuffdippmetoder begynner du å vurdere en uke etter at planteplantene er inokulert og fortsetter ukentlig i fire uker til.
      MERK: Det kombinerte datasettet vil inneholde fem sett observasjoner i denne perioden.
    2. Mens du bruker kjernemetoden, begynner du bare rangeringer når plantene dukker opp og fortsetter ukentlig for totalt seks rangeringer.
  2. Observer og beregn forekomsten.
    1. Under hver vurdering, ta digitale bilder for å dokumentere sykdomsfremdriften.
    2. Rapporter forekomsten av vilje og plantedød. Beregn forekomsten ved å ta summen av symptomatiske planter sammenlignet med sunn kontroll og antall døde planter som en andel av det totale antallet planter i den kultivaren.
  3. Analyser resultatene. Sammenlign infeksjonsmønstrene mellom kultivarer og mellom eksperimentgrupper hvis kontroller ble brukt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse eksperimentene bidrar til å definere den relative motstanden til ofte dyrkede kultivarer (tabell 1). Denne informasjonen kan deretter brukes til å veilede ledelsesanbefalinger basert på lokale Fon-populasjoner. Med andre ord, hvis løp 0 eller 1 er kjent for å være til stede i et kommersielt felt, kan bonden være tilbøyelig til å vokse et "motstandsdyktig" utvalg som Calhoun Gray, Sunsugar eller tilsvarende. Resultatene av bioassayene ved hjelp av alle metoder viser at når plantene ble smittet med en Race 1-isolasjon, døde Black Diamond og Charleston Grey-kultivarer eller viste alvorlige symptomer, mens Calhoun Grey og PI-kultivarer viste motstand (tabell 2 og figur 8A).

Alle metoder viste at når plantene ble smittet med en Race 3-isolasjon, døde nesten alle plantene fra alle kultivarer eller viste alvorlige symptomer (figur 8B). Disse resultatene viser hvordan bioassays ved hjelp av begge inokulasjonsmetodene skiller mellom løp av Fon. Utseendet til syke planter bør være det samme for alle metoder. Den eneste forskjellen er hvordan kultivarer er gruppert romlig. For rotdipp og modifiserte dray-dip-metoder vil kultivarer bli organisert av kolonner i brettet, mens i kjernemetoden vil kultivarer bli gruppert i sine egne potter.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelt område for RDM. På grunn av symptomvariabilitet, som er svært avhengig av miljøforhold som relativ fuktighet, temperatur, fotoperiod og lysintensitet, er det viktig å opprettholde et regulert eksperimentelt område. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Klargjøre startflatene for RDM. Fyll 8 x 16-cellers (25 cm bredde x 50 cm lengde) startflater med plantemedium og trykk ned for å komprimere jorda litt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Fremstilling av konidial suspensjon for RDM. (A) Isolasjon og dyrking. Enten fra en lagret eller nylig samlet prøve, isolere og kultur en F. oxysporum f. sp. niveumstamme av interesse på en tallerken qPDA til det punktet at veksten dekker halvparten av platen. Dette viser at det er aktivt og levedyktig, noe som er nødvendig for betydelig angrep av kornet i senere trinn. (B) Løsne conidia. Løsne conidia ved å skrape en steril cellespreder over middels overflate. (C) Suspensjon avsetning. Samle væskekonidiafjæringen og overfør den til et sterilt 50 ml kulturrør. Forkortelse: qPDA = en fjerdedel styrke potet dextrose agar medium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Organisering og vortexing av frøplanter for RDM. (A) Separasjon av kultivarer. Oppbevar skyllede planter midlertidig i rene beholdere med vann fra springen til bruk, og hold kultivarer atskilt. (B) Vortexing av frøplanter. Vortex rørene med planterøtter nedsenket i 30 s for planting av en enkelt plante per celle i 6 x 12 styrofoam leiligheter. Planter av samme kultivar er plassert i samme kolonne i brettet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Forberedelse og angrep av kjerner for IKM. (A) Imbibition av rugbær. På en skala måler du ut 200 g rug (Secale spp.) bær (eller Maxie var. hvete (Triticum spp.) kjerner) i en tilstrekkelig stor beholder og hell dem i en eller flere 1 L glass Erlenmeyer kolber. Tilsett sterilt vann fra springen i kolbeene for å dekke kornene helt opp til minst 5 cm. (B) Drenering av kolber. Tøm vannet fra kolber, koble åpningen med et stykke bomullsrull innpakket i osteklær, og dekk åpningen med aluminiumsfoliefolie. (C) Autoklavering. Legg posen i en plastisk, autoklavsikker søppelkasse. Ikke bruk en metallbeholder når du autoklaverer kornene i posene, da det kan føre til at posene smelter. Dekk beholderen med aluminiumsfoliefolie. (D) Oppbevaring av poser. Oppbevar posen oppreist. Sørg for at filteret trekkes bort fra motsiden av posen for å muliggjøre maksimal gassutveksling. (E) Mål 14 korn av infiserte kjerner i en stor plastpose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Såing og spiring av vannmelonfrø. (A) Såing cultivar frø i potter. Så seks frø i hver gryte. Forsikre deg om at hver gryte bare inneholder frø fra en kultivar. Plasser frøene med apex enden av frøet vendt opp for å tillate riktig vekst under fremveksten. (B) Frøspredning. Bruk en sprøyteflaske, fukt de øvre 0,3-0,6 cm jord med vann. Legg en klar plastfat (15 cm diameter) under og over hver gryte for å skape et fuktig miljø for frøspredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Inokulumpreparat og frøplante inokulering for MTDM. (A) Tilberedning av inokulum. Bestem mikrokontroidiell konsentrasjon i kolber ved hjelp av et hemocytometer som tidligere beskrevet. Forbered en 7 L inoculum suspensjon i et plastkar (40,6 cm bredde × 67,3 cm lengde × 16,8 cm dybde) ved å overføre riktig volum av sporfjæring til sterilt vann for en endelig sporekonsentrasjon på 1 × 106 ml−1. (B) Inokulere plantene. Fjorten dager etter sådd (minst første sanne bladstadium), overfør celleinnleggene med plantene i webbed skuffer (26,9 cm bredde × 53,7 cm lengde × 6,28 cm dybde). Plasser forsiktig webbed skuffer med plantene i et plastbad som inneholder 7 L inoculum suspensjon. Inokuler hver skuff én om gangen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Fenotypiske resultater av raseidentifikasjonsmetoder. (A) Løp 1 resultater. Resultatene av bioassayene som bruker (A) alle metoder viser at når plantene ble smittet med en Race 1-isolasjon, døde Black Diamond og Charleston Grey-kultivarer eller viste alvorlige symptomer, mens Calhoun Grey og PI-kultivarer viste motstand. (B) Løp 3 resultater. Alle metoder viste at når plantene ble smittet med en Race 3 isolere, døde nesten alle plantene fra alle kultivarer eller viste alvorlige symptomer. (Utseendet til syke planter bør være det samme for alle metoder. Planterekkefølge (venstre mot høyre) vist med piler: Black Diamond (blå pil), Charleston Grey (lilla pil), Calhoun Grey (brun pil), Plant Introduction 296341-FR (grønn pil). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Kultivaren Løp 0 Løp 1 Løp 2 Løp 3
Sukkerbaby, svart diamant S S S S
Charleston Gray, Allsweet, Dixielee R S S S
Calhoun Gray, Sunsugar R R S S
PI-296341-FR R R R S

Tabell 1: Kappløp av Fusarium oxysporum f. sp. Niveum. Løpet av Fusarium oxysporum f. sp. niveum bestemmes av mottakelige eller motstandsdyktige reaksjoner på et sett med vannmelon differensialer. Kultivarer som er oppført i hver rad, er de mest brukte til å representere hvert motstandsnivå under evalueringen av et isolerende løp. Denne tabellen er endret fra 4. Forkortelser: S = mottakelig; R = motstandsdyktig.

Isolere Metode BD CH. G Cal G. PI Rase
S SOM S SOM S SOM S SOM
X Dyppe 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X Kjerne 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X MTD 6 0 6 0 0 6 0 6 1
Y Dyppe 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y Kjerne 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y MTD 6 0 6 0 6 0 6 0 3
S = Symptomatisk; AS = Asymptomatisk

Tabell 2: Identifikasjon av løp. Verdier som brukes i denne tabellen gjenspeiler forekomst eller antall symptomatiske planter, sammenlignet med sunn kontroll, og antall døde planter som andel av det totale antall planter i den kultivaren. Tallene i hver celle gjenspeiler forekomsten som rapporteres ved slutten av observasjonsperioden. En kultivar anses å være utsatt når minst 1/3rd eller 33% av plantene i den kultivaren er symptomatiske eller døde. Patogenets rase bestemmes deretter basert på hvilke kultivarer som har blitt ansett som utsatt. Med andre ord, hvordan patogenet utfører mot kultivarer med økende motstand bestemmer isolatens rase. Disse resultatene er ikke fra en faktisk prøve og er heller vist å formidle hvordan løp identifiseres fra resultatene av disse metodene. Forkortelser: MTD = modifisert skuff-drypp metode; BD = Svart rombe; CH. G = Charleston Grå; Cal G. = Calhoun Grå; PI = Plante introduksjon 296341-FR; S = symptomatisk; AS = asymptomatisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tre metoder for raseskriving har blitt presentert. Hver av disse metodene passer best til bestemte spørsmål og eksperimentelle forhold. Den infiserte kjerneinokulasjonsmetoden (jordinfeksjon) er kanskje enklere og enklere, noe som gjør den spesielt nyttig for vurdering av patogenitet30. Å bruke denne metoden for enkel race-skriving er svært effektiv. Det kan imidlertid være utfordrende å bruke metoden for å bestemme motstanden til en bestemt kultivar, gitt at hver plante ikke kan møte samme grad av infeksjon eller eksponering, og like høye nivåer av sykdom kan være nødvendig for å teste motstanden til kultivarer av interesse. Dette er tilfelle fordi inoculum produsert på denne måten ikke er godt kvantifisert, og andelen levedyktige propaguler, eller antall smittsomme propaguler som når rotsonen, er ikke godt regulert31. I tillegg er denne metoden begrenset av inkonsekvenser i nærheten av de plantede kjernene til rotsonen. Hvis det er for fjernt, kan sporene ikke spire, eller hyphae kan ikke utvikle seg nok til å nå røttene.

Rotdippmetoden 32,33 er mer arbeidskrevende og tidkrevende; Men fordi mengden levedyktige propaguler som samhandler med anlegget måles mer nøyaktig, kan vertsmotstanden beskrives mer nøyaktig, noe som letter motstandsscreeningen. Videre kan forskjeller i virulens i samme løp lettere oppdages. Denne metoden har den ekstra fordelen at planter generelt blir symptomatiske tidligere og mer uttrykksfulle enn i kjernemetoden. En variant av root-dip-metoden ved hjelp av klamydosporer i inokulumfjæringen i stedet for conidia kan mangle denne fordelen6. På samme måte er den modifiserte skuffdippmetoden22 arbeidsintensiv, men gir mulighet for høy gjennomstrømning fenotyping når mange isolerer og frøplanter må screenes.

Felles faktorer for de tre metodene inkluderer cultivar-utvalg, vekstforhold og krav til hygiene. Avhengig av hva som er kommersielt tilgjengelig, kan visse kultivarer erstattesmed 21,34. Sugar Baby og Black Diamond kan begge brukes til å bestemme rase 0-isolasjoner, mens Charleston Gray, Allsweet og Dixielee har blitt beskrevet som motstandsdyktige mot løp 0, men utsatt for løp 1. Calhoun Gray og Sunsugar er motstandsdyktige mot løp 0 og 1 og utsatt for løp 2 og 3. Fon sykdomsutvikling er svært avhengig av temperatur. Det bør utvises forsiktighet for å sikre at de eksperimentelle forholdene kontrollerer denne variabelen. Når du velger et plantemedium, bør generelle kommersielle blandinger som inkluderer torvmos og / eller gips og gi god lufting være tilfredsstillende. Forholdsregler bør tas for å forhindre krysskontaminering av plantemediet i begge metoder, spesielt fra kildeposen.

Etter å ha brukt en av de beskrevne metodene, må sykdommen vurderes nøyaktig og konsekvent. Tidligere forskere har typisk bestemt seg for en terskel der planter kategoriseres som enten utsatte eller resistente35,36. For eksempel, hvis mindre enn 33% av plantene til en bestemt kultivar var symptomatiske, ville den kultivaren bli kategorisert som motstandsdyktig med isolasjonen definert i forhold til kultivarens mottakelige profil. Terskelsettet defineres av forskeren og spørsmålet de ønsker å ta opp. Variasjon mellom ratere og samme rater mellom planter har blitt mye rapportert37,38. Faktorer som kvalitet på frøet som brukes, jordkvalitet, inokulumtetthet, lagringsalder for isolasjoner og rater bias39,40 bidrar alle til denne variasjonen8. På grunn av denne variasjonen i inokulering og PI-kultivarresponser, er det nødvendig med flere eksperimentelle replikasjoner; Ideelt sett anbefales minst tre, men fem replikasjoner, med 6 planter per replikering per variasjon.

Mens molekylære analyser er utviklet for å oppdage Fon isolerer 41,42,43, har resultatene ikke vært konsistente på grunn av den polyfyletiske naturen til F. oxysporum og den geografiske og genomiske variasjonen av artskomplekset 44,45,46. Videre, selv om tidligere forskning har fastslått betydningen av de utskilte i Xylem (SEKS) effektorer i full virulens, har det eksakte komplementet av effektorer som definerer rasestrukturen til Fon-isolasjoner ennå ikke blitt bestemt13. Molekylær diagnostikk for rase er fortsatt under utvikling, som disse fenotypiske teknikkene er avgjørende for å vurdere deres nøyaktighet og nytte i Fon rase skrive19,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi vil gjerne anerkjenne Dr. Ali og Plant Molecular Diagnostic Laboratory samt Dr. Pingsheng Ji ved University of Georgia, hvis ledelse og støtte bidro til å etablere vårt Fon-program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed - Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed - Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed - Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed - PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , University of Cukurova, Ziraat Fakultesi. Antalya, Turkey. 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Keinath, A. Integrated management for Fusarium wilt of watermelon. Land-Grant Press by Clemson Extension, LGP 1022. , Available from: http://lgpress.clemson.edu/publication/integrated-management-for-fusarium-wilt-of-watermelon (2019).
  6. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  7. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  8. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  9. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  10. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  11. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium laboratory manual. , John Wiley & Sons. (2008).
  12. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  13. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  14. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  15. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  16. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  17. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  18. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  19. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  20. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  21. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  22. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  23. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  24. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  25. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  26. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  27. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  28. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  29. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  30. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  31. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. Basic plant pathology methods. , CRC Press. (2017).
  32. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  33. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  34. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  35. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  36. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  37. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  38. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  39. Chiang, K. -S., Bock, C. H., Lee, I. -H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  40. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  41. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  42. Lin, Y. -H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  43. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  44. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  45. O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  46. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  47. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

Tags

Biologi utgave 176
En kontrast av tre inokulasjonsteknikker som brukes til å bestemme løpet av ukjent <em>Fusarium oxysporum</em> f.sp. <em>niveum</em> Isolerer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fulton, J. C., Cullen, M. A.,… More

Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter