Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En kontrast av tre inokuleringstekniker som används för att bestämma rasen av okända Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolat

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63181
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 3, 4,5, 6, 1
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

Hantering av Fusarium-vissnande av vattenmelon kräver kunskap om de patogenraser som finns. Här beskriver vi rotdopp, angripen kärnsådd och modifierade brick-dip-inokuleringsmetoder för att visa deras effektivitet vid rastypning av den patogena svampen Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

Fusarium vissnar av vattenmelon (Citrullus lanatus), orsakad av Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), har återkommit som en stor produktionsbegränsning i sydöstra USA, särskilt i Florida. Införandet av integrerade strategier för växtskydd, såsom rasspecifika resistenta sorter, kräver information om patogenens mångfald och befolkningstäthet på odlarnas fält. Trots vissa framsteg när det gäller att utveckla molekylära diagnostiska verktyg för att identifiera patogenisolat kräver rasbestämning ofta bioassay-metoder.

Race typing utfördes genom root-dip inokulering, infekterad kärnsåddmetod och den modifierade brickdoppmetoden med var och en av de fyra vattenmelondifferenserna (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Isolat tilldelas en rasbeteckning genom beräkning av sjukdomsincidens fem veckor efter ympning. Om mindre än 33% av växterna för en viss sort var symptomatiska, kategoriserades de som resistenta. De sorter med en incidens större än 33% betraktades som mottagliga. Denna uppsats beskriver tre olika metoder för ympning för att fastställa ras, rotdopp, infekterad kärna och modifierad brickdopp-ympning, vars tillämpningar varierar beroende på den experimentella designen.

Introduction

De jordburna svamparna som utgör Fusarium oxysporum-artkomplexet (FOSC) är påverkande hemibiotrofa växtpatogener som kan orsaka allvarlig sjukdom och avkastningsförlust i ett brett spektrum av grödor1. Fusarium vissnar av vattenmelon, orsakad av F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), har ökat i omfattning, förekomst och svårighetsgrad över hela världen under de senaste decennierna 2,3. I plantor liknar symtomen på Fusarium ofta dämpning. I äldre växter blir lövverket grått, klorotiskt och nekrotiskt. Så småningom fortskrider växternas vissnande till full växtkollaps och död4. Direkt avkastningsförlust uppstår på grund av symtomen och växtdöden, medan indirekt avkastningsförlust kan uppstå på grund av solskador orsakade av eliminering av bladtaket5. Sexuell reproduktion och tillhörande reproduktionsstrukturer har aldrig observerats i F. oxysporum. Patogenen producerar emellertid två typer av asexuella sporer, mikro- och makrokonidier, liksom större, långsiktiga överlevnadsstrukturer som kallas klamydosporer, som kan överleva i jorden i många år6.

FOSC klassificeras i formae speciales baserat på observerade värdområden, vanligtvis begränsade till en eller ett fåtal värdarter1. Även om ny forskning har visat att detta artkomplex kan vara en sammansättning av 15 olika arter, är de specifika arter som infekterar vattenmelon för närvarande okända7. niveum (Fon) är namnet på de grupper av stammar som uteslutande infekterar Citrullus lanatus eller den domesticerade vattenmelonen 8,9. F. oxysporumstammar inom de flesta patogena formae speciales uppvisar vissa nivåer av mångfald med avseende på deras genetiska komponenter och virulens mot en värdart. Till exempel kan en stam infektera alla sorter av en värd, medan en annan bara kan infektera de mer mottagliga sorterna. För att ta hänsyn till sådan variation klassificeras dessa grupper informellt i raser baserat på evolutionära relationer eller vanliga fenotypiska egenskaper. Inom Fon har fyra raser (0, 1, 2 och 3) karakteriserats baserat på deras patogenicitet mot en uppsättning utvalda vattenmelonsorter, med upptäckten av ras 3 som nyligen inträffade10.

Trots denna uppenbara mångfald kan morfologierna hos sporer eller hyfer inte särskiljas mellan raserna av Fon-raser, vilket innebär att molekylära eller fenotypiska analyser behövs för att identifiera ett isolats unika ras11. Molekylär forskning har identifierat vissa genetiska skillnader. Till exempel har rollen av utsöndrade i Xylem (SIX) effektorer studerats i åratal i F. oxysporum, och några av dessa effektorer har lokaliserats på kromosomerna som utbyts under horisontell genöverföring12. Till exempel finns SIX6 i Fon-loppen 0 och 1 men inte i lopp 213. SIX effektorer har varit inblandade i patogeniciteten hos F. oxysporum f. sp. lycopersici och F. oxysporum f. sp. cubense, vilket orsakar Fusarium-vissnande på tomat respektive banan, 14,15,16,17. Analysen av SIX effektorprofiler bland stammar av F. oxysporum f. sp. spiniciae, Fusarium-vildpatogenen på spenat, har möjliggjort klassificering som exakt återspeglar genetisk och fenotypisk mångfald18. Skillnaderna mellan virulensmekanismer hos Fon-raser är emellertid för närvarande inte helt förstådda, och molekylära analyser som utvecklats vid deras användning har visat inkonsekventa och felaktiga resultat19. Därför är fenotypiska resultat från infektionsanalyser för närvarande det bästa sättet att klassificera isolat.

F. oxysporum infekterar initialt värdar genom rötterna innan de tar sig upp i xylem20. Detta gör direkt ympning av rötterna hos en given värdsort till ett effektivt sätt att utföra rastypning och ligger till grund för rot-dip och brick-dip-inokuleringsmetoderna21. När man inte infekterar en värd ligger F. oxysporum i jorden och kan förbli vilande i flera år. Att odla mottagliga vattenmelonsorter i jord från ett intresseområde är ett sätt att testa för närvaron av Fon. Att utvidga denna metod till att omfatta sorter med olika kända resistensnivåer i jord som medvetet är angripen av Fon är också ett bra sätt att utföra race-typing (tabell 1) och är grunden för den infekterade kärnsåddmetoden. Den modifierade brickdoppmetoden är en variant av den ursprungliga brickdoppmetoden som möjliggör en racetypning med hög genomströmning där många växter och fältisolat kan undersökas snabbt22. Viktiga faktorer för en snabb och framgångsrik bioassay av rastypning inkluderar att använda sorter som har dokumenterade skillnader i resistens mot de olika patogenraserna, säkerställa att ympningen är både biologiskt aktiv och riklig under infektion, upprätthålla en miljö som både är gynnsam för patogenen och värden och använda ett konsekvent klassificeringssystem för svårighetsgrad eller förekomst av sjukdom. Detta dokument beskriver rotdopp23,24, angripen kärnsådd25,26 och modifierade brickdopp22-metoder för fenotypisk rastypning baserat på de principer som beskrivs ovan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bestämning av ras med root-dip-metod (RDM)

  1. Förberedelse av experimentmiljön
    1. Eftersom symtomuttryck är mycket beroende av miljöförhållanden, behåll växter i ett kontrollerat område. Övervaka relativ luftfuktighet, temperatur, fotoperiod och ljusintensitet (figur 1).
      1. Ställ in temperaturen på 26-28 ° C, relativ luftfuktighet till 50-75% och ställ in en 16 timmars fotoperiod för att säkerställa tillräcklig växttillväxt och hälsa.
        OBS: För att förhindra hypoxi, planta vissnar och / eller fröröta, övervattna inte eller låt stående vatten runt plantorna.
      2. Använd två lysrörslampor, var och en med minst 1850 lumen ljus och en färgtemperatur på 2 800 K per ljusbank för att stödja fotosyntetisk tillväxt.
      3. Håll området rent och använd hygieniska metoder, inklusive avlägsnande av avfallsjord och växtskräp, för att förhindra skadedjur och oavsiktlig infektion.
    2. Planteringsförhållanden
      1. Fyll 8 x 16-cell (25 cm bredd x 50 cm längd) börja lägenheter med planteringsmedium och knacka ner för att komprimera jorden något (Figur 2).
      2. Skaffa frön från de fyra differentiella sorterna: Black Diamond / Sugar Baby, Charleston Grey / Allsweet / Dixielee, Calhoun Grey och PI-296341-FR.
      3. Så frön med sin topp (spetsiga ände) som pekar uppåt till ett djup som är lika med deras längd. Efter att fröna är sådda, täck mediet som innehåller de begravda fröna med 100% Fullers jord eller annat bentonitlera alternativ till ett djup av 0,3175-0,635 cm.
      4. Dimma lägenheterna för att dämpa mediet utan att skapa stående eller poolande vatten. Håll sedan mediet fuktigt genom att dimma i 20 s var 180: e minut, eller vattna för hand en gång per dag tills frösprutning i cirka 5 dagar. Efter spiring, vatten en gång per dag och efter behov för att stödja tillväxten av plantor.
    3. Förberedelse av media
      OBS: Båda medierna är fasta med extra granulerad agar för att möjliggöra sporskörd genom att skrapa ytan.
      1. Klarat V8 juice medium (V8)
        1. Förbered 500 ml klarat V8-juicemedium (V8)27 genom att tillsätta 100 ml klarad V8 original 100% grönsaksjuice med 1% CaCO3 till 400 ml destillerat vatten.
        2. Tillsätt 7,5 g granulerad agar.
        3. Blanda ingredienserna väl, autoklav och låt svalna till 50 ° C innan du häller i sterila petriskålar.
      2. Kvartshållfast potatisdextrosagarmedia (qPDA)
        1. Förbered qPDA-medium genom att tillsätta 4,5 g granulerad agar till 500 ml destillerat vatten, tillsätt 3,8 g potatisdextrosagar.
        2. Blanda ingredienserna väl, autoklav och låt svalna till 50 ° C innan du häller 12-15 ml i sterila petriskålar.
  2. Framställning av experimentella behandlingar
    1. Förbered inokulumet.
      1. Fem dagars efterplantering (dpp), placera infiltrerade pappersskivor (1-1,25 cm diameter) som innehåller det föredragna F. oxysporumisolatet på en V8 och en qPDA-platta och förvara dem i en inkubator (~ 28 ° C) i åtta dagar28 (figur 3A).
      2. På den åttonde dagen av svamptillväxt och dagen före ympning (se avsnitt 1.3.2), överför V8- och qPDA-plattorna från inkubatorn till ett biosäkerhetsskåp.
      3. För varje isolat, dosera 6 ml steriliserat avjoniserat vatten på varje V8- och qPDA-odlingsplatta.
      4. Lossa konidier genom att skrapa en steril cellspridare över medieytan (figur 3B). Slå samman den flytande konidiala suspensionen och överför den till ett sterilt odlingsrör på 50 ml (figur 3C).
      5. Upprepa denna process tills den totala vätskekonidiala suspensionsvolymen i 50 ml odlingsröret är cirka 12 ml.
      6. Innan du fortsätter till ett annat isolat, ytsterilisera arbetsområdet och cellspridaren med alkohol. Sterilisera cellspridaren genom att föra den genom en Bunsen-brännare efter att ha doppat den i ≥70% etanol.
      7. När de flytande konidiala suspensionerna har överförts till odlingsrör för alla isolat, kvantifiera sporantalet. Först virvla ett individuellt 50 ml odlingsrör och avge 10 μL i varje kammare i en hemacytometer. Beräkna sedan antalet sporer i hemacytometern som tidigare beskrivits29.
      8. Förbered den slutliga ymplösningen genom att överföra den beräknade volymen för 106 + 10% till ett annat sterilt odlingsrör och bringa den totala volymen till 30 ml genom tillsats av sterilt avjoniserat vatten.
      9. Förvara dessa odlingsrör över natten vid 8 ± 1 °C.
        OBS: Detta kan göras utan förlust av konidial livskraft, vilket indikeras av opublicerade data.
  3. Ympning
    1. Förbered ympningen.
      1. Före dagen för ympning, vattna robust tretton dagar gamla plantor till markens bärförmåga.
      2. Förmärk insatserna med relevant information, inklusive isolatet som ska testas, vattenmelonsorten och datumet för ympning.
      3. Placera 6 x 12-celliga (20 cm bredd x 40 cm längd) styrofoam flats, tidigare sanerade med 10% blekmedel och väl sköljda, för att ta emot de inokulerade växterna.
      4. Preposition alla nödvändiga material (se materialförteckningen).
    2. Inokulera växtrötterna.
      1. Vattna plantorna kraftigt flera timmar innan ympningen påbörjas. Minst 2 timmar efter vattning, ta bort plantletterna från 8 x 16-celliga styrofoamlägenheterna och skölj deras rötter för att avlägsna eventuella vidhäftande planteringsmaterialpartiklar.
      2. Förvara tillfälligt de sköljda växterna i rena behållare med kranvatten tills de används, så att sorterna hålls åtskilda från varandra (figur 4A). Separera plantorna i grupper om sex individer och håll plantorgrupperna inslagna i våta pappershanddukar på en laboratoriebricka för att förhindra uttorkning.
      3. Placera 25-30 cm3 jord i botten av varje cell i 6 x 12 array styrofoam bricka och använd en sprutflaska för att blöta jorden tills den är synligt fuktig.
      4. Inokulera växterna och plantera om dem i ordning enligt sorten, så att Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey och sedan PI 296341 01 FR planteras från vänster till höger.
      5. Börja med den hälsosamma kontrollen, placera en grupp av sex oskadade plantor av samma sort i 50 ml rör som innehåller ympningen. När det gäller den hälsosamma kontrollen, använd kranvatten i stället för en sporsuspension. Inokulera växterna med den positiva kontrollen (Fon race 3) sist.
      6. En gång inuti röret, se till att växtrötterna når och utsätts för ympningen (kranvatten).
      7. Virvel rören med plantletrötter nedsänkta i 30 s (figur 4B). Efter virvel, placera en enda plantlet per cell i 6 x 12 styrofoam lägenheter. Placera växterna av samma sort i samma kolumn i facket.
      8. Efter placering, desinficera handskar genom att hålla dem i hinkar med 0,7% tillgänglig klorlösning i 30 s, följt av en kranvattensköljning i 1 min.
      9. Täck sedan de placerade plantorna med planteringsmedium och sätt försiktigt. Vattna plantorna försiktigt med 20 ml per planta med en spruta eller pipett samtidigt som du undviker stänk.
      10. Innan du fortsätter till nästa uppsättning växter, sanera handskarna igen med klorlösning och en kranvattensköljning.
      11. När alla plantor har planterats om, vattna dem igen minimalt för att förhindra ympavrinning.
      12. Håll plantorna över natten i en sluten, mörk miljö med en medeltemperatur på 27 °C. Följande dag, överför växterna till växthuset och håll medeltemperaturen vid 27 ° C.
  4. Underhåll och vård av inokulerade växter
    1. För att förhindra överflöde av överskottsvatten, vattna lägenheterna lätt tre gånger om dagen i 4-5 dagar tills växterna stabiliseras.
    2. Kontrollera brickorna 2-3 gånger dagligen i minst tre dagar för att säkerställa tillräcklig och jämn täckning av vattning.
    3. Undvik att torka på grund av solljus eller skuggning genom att rotera lägenheterna och / eller ge kompletterande skuggning / vattning efter behov.
    4. Vid 3 dpp befrukta växterna med ett 20-20-20 snabbfrisättningsgödselmedel (10 g / 3,78 L) med en hastighet av 3-6 ml per liter vatten.
    5. Gödsla varje vecka i 3-4 veckor.
    6. Behåll samma belysnings- och miljöförhållanden under hela detta steg.

2. Bestämning av ras med angripen kärnmetod (IKM)

  1. Angrepp av kärnorna
    1. Förbered inokulumet.
      1. Antingen från ett lagrat eller nyuppsamlat prov, isolera och odla en F. oxysporum f. sp. niveum stam av intresse på en platta av qPDA till den grad att dess tillväxt täcker halva plattan.
        OBS: Detta visar att det är aktivt och livskraftigt, vilket är nödvändigt för betydande angrepp av spannmålen i senare steg.
    2. Förbered kärnorna.
      1. Mät på en skala ut 200 g råg (Secale spp.) bär (eller Maxie var. vete (Triticum spp.) kärnor) i en tillräckligt stor behållare och häll dem i en eller flera 1 L glas Erlenmeyer kolvar. Tillsätt sterilt kranvatten till kolvarna för att helt täcka kornen upp till minst 5 cm (figur 5A).
      2. Blötlägg kärnorna vid rumstemperatur (~ 24 ° C) i 2 timmar. Töm vattnet från kolvarna; anslut öppningen med en bit bomullsrulle insvept i ostduken; och täck öppningen med aluminiumfoliefolie (figur 5B).
    3. Dekontaminera kärnorna. När kornet har inpräntat vatten, autoklaver det två gånger på två olika sätt för att döda andra oönskade mikrober före ympning.
      1. Under första gången autoklavera kornet i de beredda kolvarna under en gravitationscykel (121,2 °C, 1,06 kg/cm2) i 1 timme med 5 minuters torktid. Låt kolvarna svalna till rumstemperatur.
      2. Innan du autoklaverar andra gången, överför kornen till en liten svampodlingspåse med ett 0,5 μm filter. Ta bort luften från påsen och vik sedan överflödig plast runt påsen.
      3. Placera påsen i en plast, autoklavsäker papperskorg. Täck behållaren med aluminiumfoliefolie (figur 5C).
        OBS: Använd inte en metallbehållare när du autoklaverar kornen i påsarna, eftersom det kan få påsarna att smälta.
      4. Autoklavera papperskorgen på en gravitationscykel i 1 timme med 5 minuters torktid, samma cykel som tidigare.
        OBS: Autoklavera endast påsen andra gången, inte den första, eftersom filtret och porten kan äventyras om påsarna autoklaveras två gånger. Förhindra kondens på filtret genom att låta påsarna svalna långsamt och fullständigt innan du tar bort dem från autoklaven eftersom odlingspåsefiltret kommer att äventyras om det blir vått.
    4. Inokulera kärnorna.
      1. Arbeta med odlingsplattan och påsen i ett biosäkerhetsskåp, skär agarskivor, 6 mm i diameter, från zonen med aktiv tillväxt på odlingsplattan med en steril korkborrning i storlek # 4. Vik ut påsen. Placera 5 agarskivor i påsen med en strikt steril teknik. Använd en steril 50 ml graderad cylinder för att mäta 35 ml sterilt kranvatten och tillsätt det i påsen.
      2. Rulla påsens öppning något och spraya sedan utsidan med 70% etanol för att ytsterilisera.
        OBS: Spraya inte filtret eftersom den fukten också kommer att äventyra det.
      3. Stäng påsen genom att vika hörnen mot mitten och sedan över två gånger ovanför filtret. Säkra påsen med påsklämmor och klara vinylrör som tillhandahålls av tillverkaren.
        OBS: Klämmorna är återanvändbara.
      4. Ta bort påsen från biosäkerhetsskåpet.
    5. Förvara patogenen för tillväxt.
      1. Förvara påsen upprätt. Se till att filtret dras bort från den motsatta sidan av påsen för att möjliggöra maximalt gasutbyte (figur 5D).
      2. Inkubera materialen vid rumstemperatur i cirka tre veckor. Omfördela kornen regelbundet för att säkerställa jämn tillväxt av patogenen.
        OBS: Påsarna är inte återanvändbara.
  2. Infektion av vattenmelonplantor med infekterat spannmål
    1. Källa vattenmelonfrön som tidigare beskrivits.
    2. Bestäm experimentgrupperna.
      OBS: Den enda stam (er) av patogenen som krävs är de isolat som testas för rasidentifiering. Negativa och positiva kontroller hjälper dock till att göra jämförelser med växter utan infektion eller en specifik infektionsnivå.
      1. För att förbereda en negativ kontroll, använd vetekärnor steriliserade enligt den tidigare nämnda metoden men utan ympning.
      2. För att förbereda en positiv kontroll, använd vetekärnor inokulerade med en redan klassificerad stam för jämförelse med det okända isolatet.
    3. Kombinera jord och spannmål.
      1. Mät 14 korn av infekterade kärnor i en stor plastpåse (Figur 5E). Fyll plastkrukor (15 cm diameter x 10 cm i höjd) med krukväxtblandning för att mäta mängden blandning som behövs. Töm blandningen i påsen. Skapa en luftkudde i påsen och vrid eller försegla den stängd.
      2. Blanda kärnorna och jorden genom att invertera påsen flera gånger. För en negativ kontroll, utför samma process i en annan påse med rena kärnor. För en positiv kontroll, utför samma process i en annan påse med kärnor infekterade med jämförelsestammen.
      3. Fyll fyra ytsteriliserade krukor med den angripna jordblandningen. För en negativ kontroll, kruka den blandningen innan du hanterar någon Fon-förorenad jord.
    4. Så vattenmelonfröna.
      1. Så sex frön i varje kruka. Se till att varje kruka endast innehåller frön från en sort. Placera fröna med fröets toppände uppåt för att möjliggöra korrekt tillväxt under uppkomsten (Figur 6A).
      2. Våt den övre 0,3-0,6 cm jorden med vatten med en sprayflaska. Placera en klar plastskål (15 cm diameter) under och över varje kruka för att skapa en fuktig miljö för frösprutning (figur 6B).
    5. Upprätta odlingsförhållanden.
      1. Vattna krukorna tre gånger om dagen med en sprayflaska för att bibehålla turgiditet utan avrinning tills fröna har groddar (cirka 5 dagar).
        OBS: Mängden vatten som används kommer att öka med växtstorlek och krukstorlek.
      2. När fröna har grodd, flytta toppskålen till undersidan av potten.
      3. Vattna växterna dagligen efter behov för optimal växttillväxt. Utsätt växterna för en fotoperiod på 16 timmar under liknande ljusförhållanden som de som tidigare beskrivits och en temperatur på 27 °C (± 1 °C).

3. Bestämning av ras med modifierad brickdoppsmetod (MTDM)

  1. Framställning av material för ympningar
    1. Upprätta planteringsförhållanden.
      1. Fyll 48-cellsinsatser (3,68 cm bredd x 5,98 cm längd x 4,69 cm djup) med ångpastöriserad sand: torv: vermikulit (4:1:1) och knacka ner för att komprimera jorden något. Placera insatserna i plastbrickor (27,9 cm bredd x 53,3 cm längd x 5,1 cm djup).
      2. Så fröna med sin topp (proximala änden) som pekar uppåt till ett djup som är lika med deras längd.
      3. Källa frön som tidigare beskrivits.
      4. Håll sedan media fuktigt genom att dimma i 20 s var 180: e minut eller vattna för hand en gång per dag.
      5. Efter spiring (ca 5 dagar), vatten en gång per dag och efter behov för att stödja plantornas tillväxt.
    2. Förbered media.
      1. Förbered qPDA-medium genom tillsats av 5,625 g granulerad agar till 500 ml destillerat vatten; tillsätt 4.875 g potatisdextrosagar. Blanda ingredienserna väl, autoklav och svalna till 50 ° C innan du häller i sterila petriskålar. Försegla petriskålarna med parafilm och förvara tallrikarna i kylskåp (4 °C) tills de används.
      2. För att förbereda buljongmedium, väg och tillsätt 24 g potatisdextros i en 1 liter flaska. Ta blandningen till 1000 ml genom att tillsätta destillerat vatten till flaskan och lägg flaskan på en kokplatta och rör om tills den är upplöst. Fördela 100 ml av buljongen i 250 ml Erlenmeyer-kolvar. Använd ostduken för att försegla kolvarna och autoklaven.
    3. Förbered inokulumet.
      1. Sju dagar före plantering, inokulera fem qPDA-plattor med infiltrerat papper28 och förvara dem i ett inkuberat område i åtta dagar på en 14 h / 10 h mörk cykel22.
      2. På den sjunde dagen, överför två 1 cm2 agarpluggar till varje 250 ml Erlenmeyerkolv innehållande 100 ml potatisdextros. Placera Erlenmeyer-kolvarna på en bänkskskakning vid 200 rpm i 7 dagar på en 14 h / 10 h ljus / mörk cykel.
      3. På dagen för ympning (14 dagar efter sådd), skörda sporerna genom att filtrera ympningen genom fyra lager steril ostduk.
      4. Bestäm den mikrokonidiala koncentrationen i kolvarna med hjälp av en hemocytometer som tidigare beskrivits. Förbered en 7 L ympsuspension i ett plastkar (40,6 cm bredd x 67,3 cm längd x 16,8 cm djup) genom att överföra rätt volym sporsuspension till sterilt vatten för en slutlig sporkoncentration på 1 × 106 ml−1 (figur 7A).
  2. Ympning
    1. Fjorton dagar efter sådd (åtminstone första riktiga bladstadiet), överför cellinsatserna med plantorna till bäddbrickor (26,9 cm bredd x 53,7 cm längd x 6,28 cm djup). Placera försiktigt bäddbrickorna med plantorna i ett plastkar som innehåller 7 L ympningssuspension. Inokulera varje bricka en i taget (figur 7B).
    2. Låt plantorna förbli i ympningen ostört i 15 min. Efter 15 minuter överför du försiktigt cellinsatserna som innehåller de inokulerade plantorna till hålfria brickor (27,9 cm bredd x 53,3 cm längd x 5,1 cm djup). Upprepa denna process för varje fack.
    3. Placera de hålfria brickorna på växthusbänken och vattna efter behov. Behåll samma ljus- och miljöförhållanden som beskrivs för rotdoppbioassay.

4. Sjukdomsvärdering

  1. Välj tidsintervall för klassificering.
    1. För rotdopp och modifierade brickdoppmetoder, börja betygsätta en vecka efter att plantorna har inokulerats och fortsätt varje vecka i ytterligare fyra veckor.
      OBS: Den kombinerade datauppsättningen kommer att innehålla fem uppsättningar observationer under denna period.
    2. När du använder kärnmetoden börjar du bara betyg när plantorna dyker upp och fortsätter varje vecka för totalt sex betyg.
  2. Observera och beräkna förekomsten.
    1. Under varje betyg, ta digitala bilder för att dokumentera sjukdomsförloppet.
    2. Rapportera förekomsten av vild och växtdöd. Beräkna förekomsten genom att ta summan av symptomatiska växter jämfört med den friska kontrollen och antalet döda växter som en andel av det totala antalet växter i den sorten.
  3. Analysera resultaten. Jämför infektionsmönstren mellan sorterna och mellan experimentgrupper om kontroller användes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dessa experiment hjälper till att definiera den relativa resistensen hos vanligt odlade sorter (tabell 1). Denna information kan sedan användas för att vägleda ledningsrekommendationer baserade på lokala Fon-populationer. Med andra ord, om ras 0 eller 1 är känd för att vara närvarande i ett kommersiellt fält, kan bonden vara benägen att odla en "resistent" sort som Calhoun Gray, Sunsugar eller motsvarande. Resultaten av bioassays med alla metoder visar att när plantorna infekterades med ett Race 1-isolat dog Black Diamond och Charleston Grey-sorterna eller visade allvarliga symtom, medan Calhoun Grey- och PI-sorterna visade resistens (tabell 2 och figur 8A).

Alla metoder visade att när plantorna smittades med ett Race 3-isolat dog nästan alla växter från alla sorter eller visade allvarliga symtom (Figur 8B). Dessa resultat visar hur bioassays som använder båda ympningsmetoderna framgångsrikt skiljer mellan raser av Fon. Utseendet på sjuka växter bör vara detsamma för alla metoder. Den enda skillnaden är i hur sorterna grupperas rumsligt. För rotdopp och modifierade dray-dip-metoder kommer sorterna att organiseras av kolumner i brickan, medan i kärnmetoden kommer sorterna att grupperas i sina egna krukor.

Figure 1
Figur 1: Försöksområde för RDM. På grund av symtomvariation, som är mycket beroende av miljöförhållanden som relativ fuktighet, temperatur, fotoperiod och ljusintensitet, är det viktigt att upprätthålla ett reglerat experimentellt område. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Förbereda startlägenheterna för RDM. Fyll 8 x 16-cell (25 cm bredd x 50 cm längd) börja lägenheter med planteringsmedium och knacka ner för att komprimera jorden något. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Förberedelse av konidial suspension för RDM. (A) Isolering och odling. Antingen från ett lagrat eller nyuppsamlat prov, isolera och odla en F. oxysporum f. sp. niveum stam av intresse på en platta av qPDA till den grad att dess tillväxt täcker halva plattan. Detta visar att det är aktivt och livskraftigt, vilket är nödvändigt för betydande angrepp av spannmålen i senare steg. (B) Lösskrivning av konidier. Lossa konidier genom att skrapa en steril cellspridare över medieytan. (C) Upphängningsdeponering. Poola den flytande konidia suspensionen och överför den till ett sterilt 50 ml odlingsrör. Förkortning: qPDA = en fjärdedel styrka potatis dextros agar medium. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Organisering och virvel av plantor för RDM. (A) Separation av sorter. Förvara tillfälligt sköljda växter i rena behållare med kranvatten tills de används, så att sorterna hålls åtskilda. (B) Vortexing av plantor. Vortex rören med plantletrötter nedsänkta i 30 s för att plantera en enda plantlet per cell i 6 x 12 styrofoam flats. Växter av samma sort placeras i samma kolumn i facket. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Beredning och angrepp av kärnor för IKM. (A) Imbibition av rågbär. Mät på en skala ut 200 g råg (Secale spp.) bär (eller Maxie var. vete (Triticum spp.) kärnor) i en tillräckligt stor behållare och häll dem i en eller flera 1 L glas Erlenmeyer kolvar. Tillsätt sterilt kranvatten i kolvarna för att helt täcka kornen upp till minst 5 cm. (B) Töm kolvarna. Töm vattnet från kolvarna, anslut öppningen med en bit bomullsrulle insvept i ostduken och täck öppningen med aluminiumfoliefolie. (C) Autoklavinställning. Placera påsen i en plast, autoklavsäker papperskorg. Använd inte en metallbehållare när du autoklaverar kornen i påsarna, eftersom det kan få påsarna att smälta. Täck papperskorgen med aluminiumfoliefolie. (D) Förvaring av påsar. Förvara påsen upprätt. Se till att filtret dras bort från den motsatta sidan av påsen för att möjliggöra maximalt gasutbyte. (E) Mät 14 korn av angripna kärnor i en stor plastpåse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Såning och spiring av vattenmelonfrön. (A) Sådd av sortfrön i krukor. Så sex frön i varje kruka. Se till att varje kruka endast innehåller frön från en sort. Placera fröna med fröets toppände uppåt för att möjliggöra korrekt tillväxt under uppkomsten. (B) Frösprutning. Våt den övre 0,3-0,6 cm jorden med vatten med en sprayflaska. Placera en klar plastskål (15 cm diameter) under och över varje kruka för att skapa en fuktig miljö för frösprutning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Inokulumberedning och ympning av plantor för MTDM. (A) Beredning av ympning. Bestäm den mikrokonidiala koncentrationen i kolvarna med hjälp av en hemocytometer som tidigare beskrivits. Förbered en 7 L ympsuspension i ett plastkar (40,6 cm bredd × 67,3 cm längd × 16,8 cm djup) genom att överföra rätt volym sporsuspension till sterilt vatten för en slutlig sporkoncentration på 1 × 106 ml-1. (B) Inokulera plantorna. Fjorton dagar efter sådd (åtminstone första riktiga bladstadiet), överför cellinsatserna med plantorna till bäddbrickor (26,9 cm bredd × 53,7 cm längd × 6,28 cm djup). Placera försiktigt bäddbrickorna med plantorna i ett plastkar som innehåller 7 L ympningssuspension. Inokulera varje bricka en i taget. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Fenotypiska resultat av rasidentifieringsmetoder. (A) Lopp 1 resultat. Resultaten av bioassays med (A) alla metoder visar att när plantorna infekterades med ett Race 1-isolat dog Black Diamond och Charleston Grey-sorterna eller visade allvarliga symtom, medan Calhoun Grey- och PI-sorterna visade resistens. (B) Lopp 3 resultat. Alla metoder visade att när plantorna smittades med ett Race 3-isolat dog nästan alla växter från alla sorter eller visade allvarliga symtom. (Utseendet på sjuka växter bör vara detsamma för alla metoder. Planteringsordning (vänster till höger) som visas med pilar: Black Diamond (blå pil), Charleston Grey (lila pil), Calhoun Grey (brun pil), Plant Introduction 296341-FR (grön pil). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Sorten Lopp 0 Lopp 1 Lopp 2 Lopp 3
Socker Baby, Svart Diamant S S S S
Charleston Grå, Allsweet, Dixielee R S S S
Calhoun Grå, Solsocker R R S S
PI-296341-FR R R R S

Tabell 1: Ras av Fusarium oxysporum f. sp. Niveum. Loppet av Fusarium oxysporum f. sp. niveum bestäms av mottagliga eller resistenta reaktioner på en uppsättning vattenmelonskillnader. De sorter som listas i varje rad är de mest använda för att representera varje nivå av motstånd under utvärderingen av ett isolats ras. Denna tabell har ändrats från 4. Förkortningar: S = mottaglig; R = resistent.

Isolera Metod BD AV KAP. Cal G. PI Ras
S SOM S SOM S SOM S SOM
X Doppa 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X Kärna 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X MTD 6 0 6 0 0 6 0 6 1
Y Doppa 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y Kärna 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y MTD 6 0 6 0 6 0 6 0 3
S = Symptomatisk; AS = Asymptomatisk

Tabell 2: Identifiering av raser. Värden som används i denna tabell återspeglar incidensen eller antalet symtomatiska växter, jämfört med den friska kontrollen, och antalet döda växter som en andel av det totala antalet växter i den sorten. Siffrorna i varje cell återspeglar den incidens som rapporterats i slutet av observationsperioden. En sort anses vara mottaglig när minst 1/3rd eller 33% av växterna i den sorten är symptomatiska eller döda. Patogenens ras bestäms sedan utifrån vilka sorter som har ansetts mottagliga. Med andra ord, hur patogenen presterar mot sorter med ökande resistens bestämmer isolatets ras. Dessa resultat är inte från en faktisk prövning och visas snarare för att förmedla hur raser identifieras från resultaten av dessa metoder. Förkortningar: MTD = modifierad brickdroppsmetod; BD = Svart diamant; G = Charleston Grå; Cal G. = Calhoun Grå; PI = Växtintroduktion 296341-FR; S = symptomatisk; AS = asymptomatisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tre metoder för rasskrivning har presenterats. Var och en av dessa metoder passar bäst för särskilda frågor och experimentella förhållanden. Den infekterade kärninokuleringsmetoden (jordangrepp) är kanske enklare och enklare, vilket gör den särskilt användbar för bedömning av patogenicitet30. Att använda denna metod för enkel race-typing är mycket effektiv. Att använda metoden för att bestämma resistensen hos en viss sort kan dock vara utmanande, med tanke på att varje växt kanske inte står inför samma grad av infektion eller exponering, och lika höga sjukdomsnivåer kan behövas för att testa resistensen hos de sorter som är av intresse. Detta är fallet eftersom ympning som produceras på detta sätt inte är väl kvantifierad, och andelen livskraftiga förlämpare, eller antalet infektiösa förlämpare som når rotzonen, är inte väl reglerad31. Dessutom är denna metod begränsad av inkonsekvenser i närheten av de planterade kärnorna till rotzonen. Om det är för avlägset kan sporerna inte gro, eller hyfer kanske inte utvecklas tillräckligt för att nå rötterna.

Rotdippsmetoden 32,33 är mer mödosam och tidskrävande; Men eftersom mängden livskraftiga förökningar som interagerar med växten mäts mer exakt, kan värdmotståndet beskrivas mer exakt, vilket underlättar resistensscreening. Dessutom kan skillnader i virulens inom samma ras lättare upptäckas. Denna metod har den extra fördelen att växter i allmänhet blir symptomatiska tidigare och mer uttrycksfullt än i kärnmetoden. En variant av rotdoppmetoden med klamydosporer i ympningssuspensionen istället för konidier kan sakna denna fördel6. På samma sätt är den modifierade brickdoppmetoden22 arbetsintensiv men möjliggör fenotypning med hög genomströmning när många isolat och plantor behöver screenas.

Gemensamma faktorer för de tre metoderna inkluderar sortval, odlingsförhållanden och krav på hygien. Beroende på vad som är kommersiellt tillgängligt kan vissa sorter ersättasmed 21,34. Sugar Baby och Black Diamond kan båda användas för att bestämma ras 0-isolat, medan Charleston Gray, Allsweet och Dixielee har beskrivits som resistenta mot lopp 0 men mottagliga för lopp 1. Calhoun Gray och Sunsugar är resistenta mot lopp 0 och 1 och mottagliga för lopp 2 och 3. Fon sjukdom utveckling är mycket beroende av temperaturen. Försiktighet bör vidtas för att säkerställa att de experimentella förhållandena styr för denna variabel. Vid val av plantmedium bör allmänna kommersiella blandningar som innehåller torvmossa och/eller gips och som möjliggör god aering vara tillfredsställande. Försiktighetsåtgärder bör vidtas för att förhindra korskontaminering av planteringsmediet i båda metoderna, särskilt från källpåsen.

Efter att ha använt en av de beskrivna metoderna måste sjukdomen bedömas noggrant och konsekvent. Tidigare forskare har vanligtvis beslutat om ett tröskelvärde vid vilket växter kategoriseras som antingen mottagliga eller resistenta35,36. Till exempel, om mindre än 33% av växterna i en specifik sort var symptomatiska, skulle den sorten kategoriseras som resistent med isolatet definierat i förhållande till sortens mottagliga profil. Tröskeluppsättningen definieras av forskaren och den fråga de vill ta itu med. Variabilitet mellan raters och av samma rater mellan växter har rapporterats allmänt37,38. Faktorer som kvaliteten på det använda utsädet, markkvalitet, ymptäthet, lagringsålder för isolat och raterbias39,40 bidrar alla till denna variation 8. På grund av denna variation i ympning och PI-odlingssvar behövs flera experimentella replikationer; Helst rekommenderas minst tre men fem replikeringar, med 6 växter per replikation per sort.

Medan molekylära analyser har utvecklats för att detektera Fon-isolat 41,42,43, har resultaten inte varit konsekventa på grund av den polyfyletiska naturen hos F. oxysporum och den geografiska och genomiska variationen hos artkomplexet 44,45,46. Dessutom, även om tidigare forskning har fastställt vikten av de utsöndrade i Xylem (SIX) effektorerna i full virulens, har det exakta komplementet av effektorer som definierar rasstrukturen hos Fon-isolat ännu inte fastställts13. Molekylär diagnostik för ras utvecklas fortfarande, för vilken dessa fenotypiska tekniker är kritiska för att bedöma deras noggrannhet och användbarhet i Fon-rastypning19,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi vill erkänna Dr. Ali och Plant Molecular Diagnostic Laboratory samt Dr. Pingsheng Ji vid University of Georgia, vars ledarskap och stöd hjälpte till att etablera vårt Fon-program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed - Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed - Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed - Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed - PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , University of Cukurova, Ziraat Fakultesi. Antalya, Turkey. 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Keinath, A. Integrated management for Fusarium wilt of watermelon. Land-Grant Press by Clemson Extension, LGP 1022. , Available from: http://lgpress.clemson.edu/publication/integrated-management-for-fusarium-wilt-of-watermelon (2019).
  6. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  7. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  8. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  9. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  10. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  11. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium laboratory manual. , John Wiley & Sons. (2008).
  12. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  13. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  14. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  15. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  16. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  17. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  18. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  19. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  20. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  21. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  22. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  23. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  24. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  25. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  26. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  27. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  28. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  29. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  30. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  31. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. Basic plant pathology methods. , CRC Press. (2017).
  32. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  33. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  34. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  35. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  36. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  37. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  38. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  39. Chiang, K. -S., Bock, C. H., Lee, I. -H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  40. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  41. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  42. Lin, Y. -H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  43. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  44. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  45. O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  46. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  47. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

Tags

Biologi utgåva 176
En kontrast av tre inokuleringstekniker som används för att bestämma rasen av okända <em>Fusarium oxysporum</em> f.sp. <em>niveum</em> Isolat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fulton, J. C., Cullen, M. A.,… More

Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter