Summary
Denna artikel ger detaljerade protokoll för att orsaka penetrerande traumatisk hjärnskada (PTBI) till vuxna Drosophila och undersöka den resulterande neurogenes.
Abstract
De molekylära och cellulära mekanismerna bakom neurogenes som svar på sjukdom eller skada är inte väl förstådda. Att förstå dessa mekanismer är dock avgörande för att utveckla neurala regenerativa terapier. Drosophila melanogaster är en ledande modell för studier av neural utveckling men har historiskt inte utnyttjats för att undersöka vuxen hjärnregenerering. Detta beror främst på att den vuxna hjärnan uppvisar mycket låg mitotisk aktivitet. Ändå utlöser genomträngande traumatisk hjärnskada (PTBI) till den vuxna Drosophila centrala hjärnan genereringen av nya nervceller och nya glia. De kraftfulla genetiska verktygen som finns i Drosophila i kombination med det enkla men rigorösa skadeprotokollet som beskrivs här gör nu vuxen Drosophila hjärna till en robust modell för neural regenereringsforskning. Här finns detaljerade instruktioner för (1) genomträngande skador på den vuxna centrala hjärnan och (2) dissekering, immunohistokemi och bildbehandling efter skada. Dessa protokoll ger mycket reproducerbara resultat och kommer att underlätta ytterligare studier för att dissekera mekanismer som ligger till grund för neural regenerering.
Introduction
Skador på hjärnan och nervsystemet är en viktig orsak till dödsfall och funktionshinder över hela världen. Cirka 1,5 miljoner amerikaner drabbas av traumatiska hjärnskador (TBI) varje år1, medan uppskattningsvis 6 miljoner individer bara i USA lider av neurodegenerativa sjukdomar, såsom Parkinsons och Alzheimers sjukdom2. Både sjukdom och skada på hjärnan kan orsaka neural degeneration, vilket leder till sensoriska, kognitiva och motoriska defekter3. Att utveckla terapeutiska strategier för mänsklig hjärnreparation har varit svårt på grund av hjärnans komplexa fysiologi. Modellorganismer som Drosophila melanogaster ger ett enkelt system för att identifiera de grundläggande mekanismerna bakom neurodegeneration och potentiella terapeutiska mål4.
Fruktflugan Drosophila melanogaster har varit en kraftfull modellorganism i mer än ett sekel och avancerar inom genetik, utvecklingsbiologi och neurovetenskap5,6. Drosophila hjärnan består endast ~ 90,000 nervceller7, en miljon gånger färre än den genomsnittliga mänskliga hjärnan8, men de har många likheter. Både mänskliga och flughjärnor använder signalsubstanserna GABA, glutamat, acetylkolin, och biogena aminer dopamin och serotonin9. Drosophila och mänskliga nervceller fungerar också på samma sätt, med en delad synaptisk arkitektur och analoga neurala celltyper10. Den mindre hjärnstorleken hos Drosophila och tillgången till avancerade genetiktekniker, i kombination med bevarandet av molekylära, cellulära och fysiologiska mekanismer mellan Drosophila och däggdjur, tillåter Drosophila-forskare att ställa frågor som är opraktiska eller svåra att svara på i däggdjursmodeller.
Vår nuvarande förståelse för vuxna neurogenes i Drosophila, både under homeostas och efter skada, är fortfarande begränsad. Mer är känt om neurogenes under normal utveckling. Till exempel skapas nervceller och glia under utveckling från prekursorceller, så kallade neuroblaster10,11. Minst tre olika typer av neuroblaster har särskiljts i den centrala hjärnan. Både typ I och typ II härstamning neuroblaster lämnar cellcykeln ~20-30 h efter pupariumbildning12. Däremot är svampkroppens neuroblaster de sista som avslutar celldelningen och gör det via Reaper-beroende apoptos ~ 85-90 h efter pupariumbildning13. Efter eklosion har den vuxna Drosophila hjärnan få delningsceller (~ 1 cell / hjärna), främst glia14. De vuxna optiska lober har långsamt cykling neuroblaster som kan neurogenes15, medan den vuxna centrala hjärnan har inga kända neuroblaster. Bristen på neurala stamceller och begränsad cellproliferation liknar starkt situationen i den vuxna däggdjurshjärnan, vilket understryker den potentiella relevansen av mekanismerna hos vuxna neurogenes i Drosophila för människor.
Upptäckten av låga nivåer av vuxna neurogenes i vuxna Drosophila optik lober efter skada15 ledde till hypotesen att den vuxna Drosophila centrala hjärnan också kan vara kapabel till vuxna neurogenes16. Detta protokoll beskriver att skapa en rigorös, reproducerbar modell av centrala hjärnan skada i vuxna Drosophila som kan användas för att undersöka neurogenes i den vuxna centrala hjärnan. Med tanke på likheterna mellan mänsklig och Drosophila hjärnans arkitektur och funktion, kan dessa upptäckter leda till identifiering av kritiska mål för terapeutisk neurogenes i skadade och sjuka mänskliga hjärnor.
Protocol
Detta protokoll följer UW-Madisons riktlinjer för djurvård.
1. Generera vuxen Drosophila för PTBI
- För det standarda argt, förlägga 20 jungfru y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL417 vuxna honor och 10 y[1] w[1]17 vuxna hanar flyger tillsammans i flaskor (se Tabell över material) som innehåller mat. För att ha ett stort antal synkrona avkommor, ställ in 10-20 kors samtidigt. Det standart argt ger löneförhöjning till F1 avkomma av genotypen: y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+.
- Placera injektionsflaskan vid 25 °C för parning och äggläggning. För att maximera avkomman, överför föräldrar till nya injektionsflaska var 2-4 dagar och behåll de tidigare injektionsflaskan vid 25 °C. Kassera varje flaska 18 dagar efter att föräldrarna först placerades i den för att säkerställa att det inte finns någon F2-avkomma.
OBS: 3 uppsättningar av avkommor ("kullar") kan genereras från varje uppsättning föräldrar. - Kontrollera efter ~ 10 dagar, när F1-avkomman börjar eklosera.
- Placera injektionsflaskan vid 25 °C för parning och äggläggning. För att maximera avkomman, överför föräldrar till nya injektionsflaska var 2-4 dagar och behåll de tidigare injektionsflaskan vid 25 °C. Kassera varje flaska 18 dagar efter att föräldrarna först placerades i den för att säkerställa att det inte finns någon F2-avkomma.
- För härstamningsstudier, använd F1 perma-twin hanar15 av genotyp: w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; tub-GAL80ts/act-GAL4 UAS-flp. För konsekvens, gör detta kors i samma riktning varje gång.
- För att generera perma-twin män, placera 20 jungfru w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-Mir; tub-GAL80ts/TM6B honor och 10 w; FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-Mir; act-GAL4 UAS-flp/TM6B15 vuxna hanar tillsammans i injektionsflaska innehållande mat.
- Placera injektionsflaskan vid 17 °C för parning och äggläggning. Överför föräldrar till flaskor med ny mat var 7: e dag och håll alla injektionsflaska vid 17 °C. Kassera varje injektionsflaska 35 dagar efter att föräldrarna först placerades i den för att säkerställa att det inte finns någon F2-avkomma.
- Kontrollera efter ~ 21 dagar, när F1-avkomman börjar eklosera.
2. Penetrerande traumatisk hjärnskada (PTBI; Bild 1)
- Sortera nyemitterade F1-flugor. Välj unga män inom 6 h efter eclosion. Placera dessa män i rena flaskor som innehåller mat, med 40 eller färre flugor per flaska.
OBS: Detta uppnås lättast på förmiddagen genom att bedöva flugor på CO2-kudden och identifiera vuxna män som fortfarande har mekonium (synlig som en mörkgrön fläck genom bukväggen) i tarmarna. - Förmatning med 5-etynyl-2'-deoxyuridin (EdU) (se Tabell över material) i 6 timmar före skadan om du planerar att märka delningsceller med EdU. Se steg 3 för mer information.
- Sanera Minutien stift (se Tabell över material) i minst 5 min genom att placera ~ 100 stift i ett 1,5 mL microcentrifuge rör fyllt med 70% etanol.
- Sanera CO2-dynan och en pensel genom att spruta 70% etanol och torka torr med en ren luddfri vävnad. När verktygen är rena och torra, överför 40 eller färre sorterade F1-hanar tillbaka till den rena dynan.
- Dela upp F1-männen i 2 grupper på flugplattan. En grupp kommer att fungera som en kontroll, oskadda flugor. Den andra försöksgruppen kommer att utsättas för PTBI.
- Använd tång, dra 4-5 nya Minutien stift ur mikrocentrifuge röret och placera dem nära kanten av CO2 pad. Under dissekeringsomfånget väljer du en rak Minutien-stift med en skarp punkt.
OBS: Att använda en enda Minutien-stift för ett experiment minskar variabiliteten. Återanvänd vassa stift. Placera skadade eller trubbiga stift i ett separat 1,5 ml mikrocentrifugerör som innehåller 70 % etanol för säkert bortskaffande. - Om du arbetar med flugor från standardkorset, slå på stereomikroskopljusdiodlampan (LED) utrustad med lämpliga excitations- och emissionsfilter för grönt fluorescensprotein (GFP). Detta tillåter excitation vid 440-460 nM och möjliggör visualisering av 500-560 nM.
OBS: Med denna lampa och filteruppsättning kommer svampkroppens cellkroppar att fluorescera grönt genom huvud nagelbandet (figur 1C). För perma-twin flugor eller flugor av andra genotyper kan en standard vit ljusbelysning för stereomikroskopet användas för att visualisera landmärken på huvud nagelbandet för att rikta skadan på svampkroppen (figur 1C). - Använd tången för att plocka upp och hålla den valda Minutien-stiftet i ena handen (för högerhänta personer är detta vanligtvis höger hand) och penseln i den andra (vanligtvis vänster) hand. Välj en fluga från experimentgruppen och placera flugan så att du har en dorsal vy över huvudkapseln med flugans huvud till höger. Placera borsten på den främre delen av dorsala bröstkorgen och tryck försiktigt ner för att stabilisera flugan.
- Sikta Minutien-stiftets spets mot svampkroppens cellkroppar på höger sida av huvudet och penetrera huvudkapseln. Om du använder landmärken, rikta in dig på dorsala huvud nagelband mellan ocelli och dorsala kanten av ögat (bild 1).
- När du har slutfört skadan, använd penseln för att trycka huvudet försiktigt från Minutien-stiftet.
- Om du använder hjärnan för RNA-Seq eller qRT-PCR, gör en andra skada på vänster sida av huvudet.
- Upprepa steg 2.8-2.10 för att skada alla flugor i försöksgruppen.
- När alla flugor har skadats, placera kontrollen och skadade flugor i märkta, separata flaskor som innehåller mat. Lägg injektionsflaskan horisontellt (dvs. på sidorna) medan flugorna återhämtar sig från anestesin och under efterföljande åldrande för att förhindra att flugor fastnar i maten.
- Placera standardkorsflugor vid 25 °C och perma-twin flugor vid 30 °C till ålder.
- För flugor som är längre än 24 timmar, placera dem på ren mat var 1-2 dag.
3. EdU-märkning
- Förbered ett lager på 10 mM 5-etynyl-2'-deoxyuridin (EdU) i dimetylsulfoxid (DMSO). Detta kan förvaras vid -20 °C i upp till 12 månader.
- Förbered 200 μL 50 μM EdU i 10% sackaros. Förmatning flyger med EdU i 6 timmar före PTBI.
- Placera 200 μL 50 μM EdU i 10 % sackaros på ett 23 mm rundt filterpapper av klass 3 (se Materialtabell) i en annars tom flaska.
- Placera flugorna i injektionsflaskan. Försegla sedan injektionsflaskan med en bomullsplugg.
- Lägg injektionsflaskan horisontellt i en fuktad inkubator vid 25 °C i 6 timmar.
- Utför PTBI enligt beskrivningen i steg 2.3-2.10.
- Placera flugorna tillbaka i den EdU-innehållande injektionsflaskan. Försegla injektionsflaskan med en bomullsplugg.
- Lägg injektionsflaskan horisontellt i en fuktad inkubator vid 25 °C i upp till 24 timmar. Följ ett av stegen nedan (steg 3.8.1-3.8.3).
- Dissekera och fixera hjärnor enligt beskrivningen i steg 4 med fixativ, tvättbuffert och blockeringsbuffert utan azid och med EdU-detektionsreaktionen utförd före antikroppsfärgning.
- Överför flugorna till en ren flaska som innehåller ett nytt filterpapper och 200 μL 50 μM EdU i 10% sackaros. Lägg injektionsflaskan horisontellt i en inkubator på 25 °C. Upprepa var 24:e timme under märkningens varaktighet. Dissekera och fixera sedan hjärnor enligt beskrivningen i steg 4 med hjälp av buffertar utan azid med EdU-detektionsreaktionen som utförs före antikroppsfärgning.
- För att pulsjaga etiketten med EdU, mata EdU för pulsperioden, överför flugorna var 24: e timme till en ren flaska som innehåller ett nytt filterpapper och 200 μL 50 μM i 10% sackaros. Efter pulsperioden (t.ex. 4 dagar) överför flugorna till en flaska som innehåller standard Drosophila-mat. Placera injektionsflaskan på sidan i en inkubator på 25 °C i ytterligare 3 dagar. Dissekera och fixera sedan hjärnor enligt beskrivningen i steg 4 med hjälp av buffertar utan azid med EdU-detektionsreaktionen som utförs före antikroppsfärgning.
4. Dissekering, immunohistokemi och montering
- Förbered 1,5 mL mikrocentrifugerör med 100 μL fixativ: 4% formaldehyd i PEM (100 mM piperazin-N,N'-bis(2-etanesulfonsyra) [RÖR], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0) (se Tabell över material) och placera på is.
OBS: Så många som 20 hjärnor av en enda genotyp och tillstånd kan bearbetas i ett enda rör. - Förbered en dissekeringsplatta med en liten pool (~100 μL) av 70% etanol och tre små pooler av fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 100 mM K2HPO4, 140 mM NaCl, pH 7,0).
- Bedöva ~10 kontroll eller experimentella flugor på en CO2 pad som har sanerats med 70% etanol.
- Separera huvudet från stammen på varje fluga med en skalpell.
- Samla huvudena med en pensel fuktad i 70% etanol och placera huvuden i 2-5 min i etanolpoolen på dissekeringsplattan.
OBS: Detta torkar ut hjärnan något och gör dem lättare att dissekera bort från nagelbandet. - Överför huvudena till en ~100 μL pool av PBS och dissekera ut hjärnan, flytta varje hjärna till en ren ~ 100 μL pool av PBS. Utför detta med två par Urmakare tång för att öppna baksidan av huvud nagelbandet och hålla nagelbandet med ett par tång medan försiktigt bända hjärnan ur nagelbandet med hjälp av den stängda spetsen av det andra paret tång.
- Överför de dissekerade hjärnorna till ett mikrocentrifugerör som innehåller 100 μL av fixeringslösningen med hjälp av en P200-pipetor utrustad med en plastspets som har skurits och avfasats för att tillåta inresa för hjärnan.
- Fix i 20-25 min vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort fixen med antingen en P200 eller en glaspipett.
- Tvätta de fasta hjärnorna fyra gånger med 1 ml "PT" (PBS plus 0,1% Triton X-100), så att hjärnan kan nöja sig i flera minuter mellan varje tvätt.
OBS: Om hjärnorna inte sätter sig snabbt mellan tvättarna, är det troligt att de har fortfarande fett kropp och / eller luftstrupe bifogad. - Blockera prover i 1 ml PBS plus 0,1% Triton X-100 och 2% bovint serumalbumin (PBT) i ~1 h vid rumstemperatur.
- Ta bort blockeringslösningen och inkubera prover med 100 μL primär antikroppslösning över natten vid 4 °C i PBT. De primära antikropparna som används i denna studie är kanin anti-PH3 (1:500) och mus anti-Fasiclin II (1:20) (se Tabell över material).
- Tvätta prover fem gånger med 1 ml PT, så att hjärnan kan nöja sig i flera minuter mellan varje tvätt.
- Ta bort den slutliga tvätten och inkubera i 100 μL sekundär antikroppslösning över natten vid 4 °C. De sekundära antikropparna som används här är antikanin 568 (1:400) och antimus Cy5 (1:100) (se Materialförteckning).
- Tvätta prover fem gånger med 1 ml PT, så att hjärnan kan nöja sig i flera minuter mellan varje tvätt. Tillsätt 4',6-Diamidino-2-Fenylindole, Dihydroklorid (DAPI; 1:100 av en 10 μM-lösning) i 10 minuter för att färga atomkärnorna. Ta bort tvätten och lämna 50-100 μL i varje rör.
- Förbered mikroskopbilder genom att placera en enda självhäftande förstärkningsetikett i mitten av varje bild och en 50 μL-droppe antiblekningsmonteringsmedier i mitten av varje etikett (se Materialtabell). Förstärkningsetiketten håller täckslipen något ovanför rutschkanorna och förhindrar att de monterade hjärnorna blir alltför utplattade.
- Överför försiktigt hjärnan från varje mikrocentrifugerör till en förberedd rutschkana med så lite tvättbuffert som möjligt med en P200 utrustad med en skuren och fasad plastspets. Så många som 10 hjärnor kan monteras på en enda bild.
- Använd tång för att försiktigt flytta hjärnan innan du placerar ett täckslip på varje rutschkana och förseglar rutschkanan med nagellack. Orientera hjärnan med antingen bakre sida upp eller främre sida upp men bör inte röra varandra.
OBS: Eftersom det är svårt att få högkvalitativa konfokala bilder genom en hel hjärna, bör vissa hjärnor monteras i varje orientering. - Förvara förberedda diabilder platta och i mörker vid 4 °C tills bilden. För långtidslagring (upp till 1 år) kan diabilder förvaras vid -20 °C.
5. Konfokal avbildning
OBS: Bildhjärnor som använder ett laserskanningskonfokalt mikroskop med excitationslasrar och emissionsfilterkuber som är lämpliga för DAPI och de fluorescerande sekundära antikropparna (dvs. 405 nm, 488 nm respektive 568 nm, 633 nm).
- Slå på kraften i mikroskopet, lasrarna, styrenheten och datorn.
- Öppna programvaran Förvärv.
- I förvärvsläget väljer du upp till fyra kanaler och ställer in parametern för sekventiell skanning av önskade kanaler. Öka lasereffekten för varje kanal till 5-10%.
- Placera en bild på mikroskopet.
- Välj en hjärna som ska avbildas med epifluorescensbilaga (se Tabell över material).
- I anskaffningsläget väljer du 1 024 x 1 024 pixlar som ramdimension.
- I förvärvsläget väljer du alternativet Z-stack, anger att Z-stack ska tas vid 2 μm-sektioner och fokuserar genom provet och väljer de övre och nedre fokalplan som ska avbildas.
- Samla Z-stack bilder av hela hjärnor med hjälp av en 20x mål och specifika hjärnregioner såsom svamp kroppen med hjälp av ett 60x mål.
6. Dataanalys
- Kvantifiera de expanderande cellerna och antalet perma-twin kloner manuellt och/eller med hjälp av bildanalysprogramvaran (se Tabell över material). Vid användning av programvara väljer du regioner av intresse (ROI) med områden på minst 10 μm.
Representative Results
PTBI stimulerar cellproliferation
För att fastställa omfattningen av neurogenes efter en central hjärna PTBI, mättes proliferative svar hos unga vuxna män som samlats in och skadats inom 6 h av eklosion. En betydande ökning av spridningen observerades 24 h efter skada med anti-phosphohistone 3 (PH3), en markör för celler som aktivt genomgår mitos. Cirka 3 PH3+ celler i kontrollera centrala hjärnor och 11 PH3 + celler i de skadade centrala hjärnorna observeras 24 h post-PTBI (figur 2A-D). Majoriteten av delningscellerna ligger nära skadeplatsen. En andra analys för celldelning användes för att kvantifiera den kumulativa cellproliferationen från en enda skada och för att bedöma i vilken utsträckning de nyskapade cellerna överlevde. 5-etynyl-2'-deoxyuridin (EdU) är en tymidinanalog som kan införlivas i nysyntetiserat DNA och permanent märka celler som har genomgått DNA-syntes. Flugor fick en 4-dagars puls av EdU, följt av en 3-dagars jakt. Detta visade att de märkta cellerna var livskraftiga och överlevde minst 3 dagar efter spridning. Vid 7 dagar fanns det i genomsnitt 2 EdU + celler i kontroll centrala hjärnor och i genomsnitt 11 EdU + celler i de skadade centrala hjärnorna, respektive (figur 2E). Detta liknar de erhållna resultaten 24 timmar efter skada med ph3-antikroppen. När cellproliferation mäts vid 14 dagar, de oskadade kontrollerna i genomsnitt 1 EdU + cell per central hjärna, medan de skadade hjärnorna i genomsnitt 29 EdU + celler (figur 2E), visar att cellproliferation fortsätter åtminstone in i den andra veckan efter en PTBI.
Cellproliferation är åldersberoende
Det största proliferativa svaret i den centrala hjärnan observerades inom de första 24 h efter eklosion (figur 3). Vid 7 dagar post-eclosion, en genomträngande skada orsakar fortfarande en betydande ökning av spridningen, med ett genomsnitt av 6 PH3 + celler per central hjärna. Fortfarande, med 14 dagar efter eclosion, minskar förmågan för celler att dela sig efter PTBI avsevärt till 1 delningscell, liknande den för kontrollhjärnor (figur 3). Således är potentialen för cellproliferation post-PTBI åldersberoende.
Nyskapade nervceller kan projicera för att korrigera målområden
För att utvärdera neural regenerering post-PTBI användes perma-twin märkning system15. Perma-twin härstamning spårar permanent etiketter dela celler och deras avkomma med ett grönt fluorescerande protein (GFP) eller rött fluorescerande protein (RFP)15. Fler perma-twin kloner upptäcktes i skadade prover, vid 2 dagar och 2 veckor, än i kontroller (figur 4A-E). Noterbart, det fanns nya svamp kroppen nervceller i ~ 50% av PTBI hjärnor 2 veckor efter skada (figur 4N). Dessa nya nervceller projicerade sina dendriter på lämpligt sätt till svampkroppen calyx och deras axoner på lämpligt sätt till svampkroppsloberna (figur 4D, F, G). Detta indikerar att de nyskapade cellerna kan vara funktionella nervceller som är involverade i reparationen av de skadade svampkropparna. Andra områden i hjärnan som tycktes regenerera inkluderar ellipsoidkroppen (EB) (figur 4H,I), antennloberna (AL) (figur 4J, K) och sidohornet (LH) (figur 4L, M) som hade stora kloner cirka 26%, 26% respektive 20% av tiden (figur 4N). Dessa resultat understryker nyttan av detta system för undersökning av vuxna neurogenes. En föreslagen modell för händelseförloppet efter PTBI och som leder till generering av nya nervceller visas i figur 5.
Figur 1: Penetrerande traumatisk hjärnskada (PTBI) till den vuxna centrala hjärnan i Drosophila . (A) Schematisk av utsidan av ett vuxet flyghuvud. Det här är en frontvy. Således är djurets högra sida till betraktarens vänstra. (B) Schematiskt av insidan av ett vuxet Drosophila huvud med den skadebana som anges i grått. Det här är en bakre vy. Således, i denna bild och efterföljande figurer, är höger sida av hjärnan till höger. Centrala hjärnan PTBI påverkar flera hjärnstrukturer, inklusive svampkroppen (grön) och vävnader utanför hjärnan, inklusive fettkroppen (blå) och hemocyter (röd). CB = centrala hjärnregionen. OL= optisk lobregion. (C) Dorsal vy över ett levande vuxenhuvud där svampkroppar (pilspetsar) är märkta med ett grönt fluorescerande protein (GFP). Detta är "standardgenotypen" (se text för mer information). PTBI-protokollet resulterar reproducerbart i skador på svampkropparna. Denna siffra har anpassats från Reference16. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: PTBI stimulerar cellproliferation. Oskadad kontroll (A) och PTBI (B) scheman. De blå rutorna i de övre högra hörnen anger de hjärnregioner som visas vid högre förstoring i paneler (C) och (D). (C,D) PH3 antikropp (röd) användes för att analysera cellproliferation 24 h efter skada. I kontrollhjärnor (C) finns det få PH3 + celler och ingen nära MB. Men i PTBI-hjärnor (D) finns det PH3 + celler nära MB. E) Kvantifiering av förökande celler. Siffrorna återspeglar prolifererande celler i hela hjärnan, inte bara i närheten av svampkroppen. Vid 24 h hade oskadda kontrollhjärnor i genomsnitt 3 PH3 + celler / hjärna (n = 11 hjärnor, 28 celler), medan 24 h post-PTBI, hjärnor hade i genomsnitt 11 PH3 + celler / hjärna (n = 17 hjärnor, 181 celler). Vid 7 dagar har oskadda kontroller få EdU+ celler, med i genomsnitt 2 EdU+ celler/ hjärna (n = 15 hjärnor, 24 celler), medan 7-dagars post-PTBI-hjärnor hade i genomsnitt 11 EdU + celler / hjärna (n = 22 hjärnor, 238 celler). Vid 14 dagar har oskadda kontroller i genomsnitt 1 EdU + cell / hjärna (n = 8 hjärnor, 11 celler), medan 14-dagars post-PTBI-hjärnor har i genomsnitt 29 EdU + celler / hjärna (n = 14 hjärnor, 400 celler). För denna uppsättning experiment användes unga vuxna män inom 6 h av eklosion. Oparerade t-kontroll- och PTBI-prover vid 3-punktsavkastningsvärdena p<0,0001, s<0.0001 respektive p<0.0002. Felstaplar återspeglar standardavvikelsen (SD). Denna siffra har anpassats från Reference16. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Det proliferativa svaret på PTBI minskar med åldern. För att undersöka om ålder påverkar mängden cellproliferation som uppstår efter skada jämfördes nyligen eclosed vuxna män med djur i åldern 7 dagar, 14 dagar och 28 dagar före PTBI, med hjälp av anti-PH3 för att analysera cellproliferation 24 h efter skada. Flugor som skadades inom 6 h av utgående hade i genomsnitt 11 PH3 + celler / hjärna (n = 17 hjärnor, 182 celler) jämfört med i genomsnitt 3 PH3 + celler / hjärna i åldersmatchade kontroller (n = 11 hjärnor, 28 celler). Flugor i åldern 7 dagar, sedan utsatta för PTBI, hade i genomsnitt 6 PH3 + celler / hjärna (n = 11 hjärnor, 65 celler) jämfört med åldersmatchade kontroller med i genomsnitt 2 PH3 + celler / hjärna (n = 5 hjärnor, 12 celler). När flugor var i åldern till 14 dagar före PTBI och analyseras 24 h senare, fanns det i genomsnitt 1 PH3 + cell / hjärna (n = 8 hjärnor, 11 celler) som liknar åldersmatchade kontroller, som också i genomsnitt 1 PH3 + cell / hjärna (n = 4 hjärnor, 2 celler). 28-dagars oskadad kontroll (n = 4, 1 cell) och PTBI (n = 3, 1 cell) flyger båda i genomsnitt 0 PH3 + celler / hjärna. Oparerade t-tester för PTBI för att kontrollera jämförelser vid dessa 4-tidpunkter är p<0.0001, p<0.04, p<0.07 respektive p<0.84. Denna siffra har anpassats från Reference16. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Perma-twin härstamning spårning visar hjärnan regenerering och lämplig inriktning av axoner efter PTBI. Perma-twin härstamning-spårning system15 användes för att analysera neurogenesis efter PTBI. Detta system märker permanent dela celler och avkomma med ett grönt fluorescerande protein (GFP) eller rött fluorescerande protein (RFP). Flugor uppföddes vid 17 °C för att hålla systemet av under utveckling. F1 hanar som bär perma-twin transgenes samlades på eclosion, därefter sårades och förlades på °C för att återställa för 2 eller 14 dagar. (A) I 2-dagars oskadda kontroller finns det några GFP + celler spridda över hela hjärnan. (B) Vid 14 dagar finns det relativt få GFP + celler närvarande i kontrollen central hjärna. (C) I jämförelse har 2-dagars skadade hjärnor fler GFP + celler som tenderar att kluster nära skadan (pilspets). D) Vid 14 dagar efter skadan finns det stora kloner nära skadeplatsen. Några av dessa kloner har axoner som projicerar längs svampkroppsvägarna (pilspetsen). Endast GFP-kanalen visas här; det fanns liknande RFP+-kloner i PTBI-proverna. (E) Antalet kloner ökar med tiden efter PTBI.Control oskadda hjärnor (n = 13) har i genomsnitt 10 kloner vid 2 dagar, medan 2-dagars PTBI-hjärnor (n = 20) har i genomsnitt 23 kloner (p<0.00002). Vid 7 dagar hade kontrollhjärnor i genomsnitt 9 kloner per hjärna (n = 18), medan 7-dagars PTBI-hjärnor hade i genomsnitt 39 kloner per hjärna (n = 16) (p-värde<0.0000000002). Detta är betydligt mer än antalet kloner som ses vid 2 dagar efter skada (p-värde<0.0009). I 14-dagars kontrollhjärnor finns det i genomsnitt 10 kloner per hjärna, vilket inte skiljer sig avsevärt från 2-dagars- och 7-dagarskontrollerna. Men efter 14 dagar efter PTBI finns det i genomsnitt 66 GFP+-kloner, vilket är betydligt mer än antingen åldersmatchade kontroller (p<0.0000003) eller 2-dagars post-PTBI-hjärnor (p-värde<0.0001). Felstaplar återspeglar SD. (F-M) PTBI stimulerar klonbildning i flera regioner i hjärnan. Paneler på vänster sida är scheman av hjärnregioner där stora kloner hittades 14 dagar efter PTBI (A, H, J, L). Paneler till höger visar höga förstoringar av representativa hjärnor (G, I, K, M). Många 14-dagars hjärnor hade kloner som projicerades till specifika målområden. Dessa inkluderade svampkroppen (MB) (F,G), ellipsoidkroppen (EB) (H,I), antennalloben (AL) (J,K) och sidohornet (LH) (L,M). (N) Både klonantalet och klonstorleken ökar med tiden efter PTBI.Proportionerna av hjärnregioner med stora kloner beräknades till 2, 7 och 14 dagar i kontroller och skadade hjärnor. Vid 2 dagar visade ~ 8% av kontrollhjärnorna (n = 13) AL-kloner, medan det inte fanns några AL-kloner i 2-dagars skadade hjärnor (n = 20). I 7-dagars kontrollhjärnor (n = 18) hade 6% AL och 6% eb kloner. Vid 7 dagar efter PTBI (n = 16), hade 6% av hjärnorna också AL kloner, 6% hade EB kloner och 19% hade stora MB kloner. Vid 14 dagar uppvisade kontrollhjärnor (n = 9) inte några specifika områden med kloner, medan 47% av PTBI-hjärnorna (n = 15) hade MB-kloner, 20% av PTBI-hjärnorna hade AL-kloner och 27% av PTBI-hjärnorna hade EB-kloner och 27% hade LH-kloner. Denna siffra har anpassats från Reference16. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Sammanfattande modell för regenerering efter genomträngande traumatisk hjärnskada (PTBI). Hos unga vuxna Drosophila finns det quiescent neuroblastliknande celler i den centrala hjärnan som saknar uttryck för kanoniska neuroblastgener. Vid 24 h post-PTBI aktiveras de quiescent neuroblastliknande cellerna, uttrycker neuroblast gener och har börjat föröka sig. Vid både 4 h och 24 h efter PTBI finns det en våg av celldöd16. På 7 dagar är spridningshastigheten fortfarande hög, och många av de nya cellerna har antagit mogna cellidentiteter och blivit nervceller eller glia. Vid 14 dagar post-PTBI, stora kloner av nya nervceller med axoner och dendriter korrekt projicera till sina respektive målområden. Locomotor defekter återställs också av 14 dagar, vilket tyder på att vuxna Drosophila kan regenerera funktionellt och strukturellt. Denna siffra har anpassats från Reference16. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Även om genomträngande skador på den vuxna Drosophila hjärnan har beskrivits tidigare15,17,18, dessa skador fokuserade på optik lober och inte den centrala hjärnan. Dessutom saknas detaljerade instruktioner för hur skadorna ska utföras. Detta protokoll beskriver en modell för penetrerande skada på den vuxna Drosophila centrala hjärnan som reproducerar statistiskt signifikanta bevis för vuxna neurogenes efter PTBI.
Reproducerbarheten av detta PTBI protokoll beror delvis på svamp kroppen som skada mål region. Svampkroppen är stor, bestående av ~ 2200 nervceller med komplexa dendrit och axon arbors i stora och mycket stereotypa matriser18. Cellkropparna av svampkroppsneuroner ligger nära hjärnans yta och kan visualiseras genom huvud nagelbandet med hjälp av uttrycket av grönt fluorescerande protein (GFP) (figur 1C). Svampkroppsprekursorer är de sista neurala stamcellerna som genomgår apoptos under utveckling13,12,19. Således är många svampkroppsneuroner ganska unga vid tidpunkten för eklosion. Detta ledde till hypotesen att svampkroppen kan ha mer mitotisk potential än andra hjärnregioner16. Dessutom är svampkroppen avgörande för lärande och minne18. Detta gör att man kan fråga om PTBI-utlöst neurogenes leder till funktionell återhämtning.
Andra faktorer som bidrar till resultatens reproducerbarhet inkluderar att använda utkorsade flugor av konsekventa genotyper, utföra kors i samma riktning varje gång, exakt kontrollera uppfödnings- och åldringstemperaturerna och analysera män och kvinnor separat. Att använda F1-flugor från en outcross minskar sannolikheten för att analysera hjärnor homozygous för spontana mutationer. Det standart argt av y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 vuxna kvinnlig till y[1] w[1] vuxna maleflugor resulterar i F1 avkomma av genotypen y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 uttrycks i alla inneboende nervceller i svampkroppen och driver uttryck för den membranbundna reportern UAS-mCD8-GFP tillåter visualisering av svampkroppar och deras projektioner. För perma-twin-korsen skall korsen alltid ligga kvar vid 17 °C för att hålla härstamningssystemet avstängt. Detta säkerställer att inga delningsceller märks under utvecklingen och att endast vuxenfödda nervceller och glia är märkta. För detta ändamål kan flygrummet också bibehållas vid 17 °C. Även om den första beskrivningen av perma-twin systemet15 rekommenderade uppfödning flyger vid 18 °C, kan detta leda till betydande bakgrundsmärkning.
För konsistens rekommenderas också att hålla kontrollen oskadda flugor på CO2-kudden när man utför PTBI. Detta säkerställer att båda uppsättningarna av flugor har identisk anestesiexponering. Dessutom är det önskvärt att reproducerbarheten helt tränger in i huvudet. Man måste dock vara försiktig så att stiftets spets inte böjs mot dynan, vilket gör den oanvändbar för framtida skador. För skickliga utövare finns det lite oavsiktlig skada på PTBI-flugor. Ändå kan det vara dödligt att trycka för hårt på bröstkorgen för att stabilisera flugan under skada. Ett sätt att bedöma omfattningen av den oavsiktliga skadan är att kvantifiera dödligheten hos PTBI flyger 24 timmar efter skadan. För ensidigt skadade flugor kan detta vara 50% eller högre för nybörjare. För att säkerställa att observerade resultat beror på PTBI och inte oavsiktlig skada, rekommenderas därför att nybörjare övar på att administrera PTBI på ~ 20 flugor dagligen under flera veckor och analyserar inte de resulterande hjärnorna förrän 24 h dödligheten konsekvent <10%.
För att kvantifiera mängden spridning stimuleras av centrala hjärnan PTBI, både anti-phosphohistone H3 (PH3) immunostaining och 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) införlivande kan användas. Anti-PH3 etiketterar celler före och genom metafas, vilket begränsar detektion till endast en bråkdel av de aktivt delande cellerna. Således ger anti-PH3 färgning bara en partiell glimt av spridning. EdU är en tymidinanalog som kan införlivas i nysyntetiserat DNA. Genom att mata flugor EdU före och efter skada är det möjligt att få en mer fullständig bild av cellerna som antingen delar sig eller har delats efter skadan. Det faktum att alla celler som delar sig är permanent markerade är till hjälp både för identifiering av långsamt cyklande celler och analysera cellernas överlevnad efter den första spridningen. Av oklara skäl, men kanske på grund av begränsad permeabilitet av blod - hjärnbarriären, EdU märkning är ineffektiv och underrapporterar cellproliferation i den vuxna hjärnan. Detta framgår av liknande antal PH3 + och EdU + celler i både kontroll och experimentella hjärnor vid 24 h post-PTBI och genom att observera att endast en delmängd av nya celler i perma-twin kloner införlivar EdU16. För maximal märkning är det viktigt att förmata flugorna med EdU eftersom skadade flugor inte återupptar utfodringen i flera timmar efter PTBI. Utfodring bedömdes genom att tillsätta matfärgning till EdU-lösningen och övervaka mängden färgämne i tarmen genom buk nagelbandet16.
Det bör noteras att medan vi har tillhandahållit ett hjärn dissekeringsprotokoll i steg 4, kan alternativa tekniker användas. Flera av dessa finns i tidigare publicerade protokoll20,21,22. Drosophila melanogaster erbjuder en billig modell med kraftfulla genetiska och molekylära verktyg som kan användas för att studera mekanismerna bakom regenerering av flera vävnader, inklusive tarmen och komponenter i nervsystemet. En ny och reproducerbar skademodell som kan användas för att studera svaret på hjärnskada beskrivs här. Data som erhållits med hjälp av dessa protokoll stöder tanken att den vuxna Drosophila centrala hjärnan behåller den proliferativa förmågan, genererar nya nervceller som svar på skada. Dessa observationer motiverar ytterligare undersökning av både omfattningen av vuxna neurogenesis och dess underliggande molekylära mekanismer. När komponenterna som är involverade i neural regenerering identifieras i detta system kan vi konvertera vår kunskap om vuxna Drosophila neurogenes till människor.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Stacey Rimkus och Becky Katzenberger för tekniskt bistånd och Eduardo Moreno för att de delar perma-twin-bestånden. Vi vill tacka Barry Ganetzky och David Wassarman för livliga diskussioner som utan tvekan förbättrade vetenskapen och Kent Mok, Cayla Guerra och Bailey Spiegelberg för deras bidrag till laboratoriet. FasII-antikropparna utvecklades av Corey Goodman och erhölls från Developmental Studies Hybridoma Bank, skapad av NICHD av NIH och underhålls vid University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. De flesta av de Drosophila stammar som användes i denna studie erhölls från Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; NIH P40OD018537). Detta arbete stöddes av NIH T32 GM007133 (KLC); NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); Universitetar av Wisconsin forskarutbildning (GBF); och UW-Madison Women in Science and Engineering Leadership Institute (WISELI) (GBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
| 150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
| 18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
| 70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
| anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
| anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
| bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
| Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
| Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
| CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
| CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
| Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
| cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
| Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
| Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
| Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
| Microscope slides | any | for mounting brains | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
| mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
| NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
| P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
| phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
| rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
| Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
| Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
| Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |
References
- Thurman, D., et al. Report to Congress: Traumatic brain injury in the United States. , Available from: https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/pubs/tbi_report_to_congress.html (1999).
- NIEHS. , Available from: https://www.nih.gov/research/supported/health/neurodegenerative/index.cfm (2021).
- Morton, N. V., Wehman, P. Psychosocial and emotional sequelae of individuals with traumatic brain injury: A literature review and recommendations. Brain Injury. 9 (1), 81-92 (2017).
- Bonini, N. M., Berger, S. L. The sustained impact of model organisms-in genetics and epigenetics. Genetics. 205, 1-4 (2017).
- Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Experimental Neurology. 287, Pt 3 310-317 (2017).
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Current Opinion in Genetics & Development. 44, 84-91 (2017).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Meinertzhagen, I. A. The organisation of invertebrate brains: cells, synapses and circuits. Acta Zoologica. 91 (1), 64-71 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: A history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Developmental Neurobiology. 68 (9), 1185-1195 (2008).
- Ito, K., Hotta, Y. Proliferation pattern of postembryonic neuroblasts in the brain of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 149 (1), 134-148 (1992).
- Siegrist, S. E., Haque, N. S., Chen, C. H., Hay, B. A., Hariharan, I. K. Inactivation of both Foxo and reaper promotes long-term adult neurogenesis in Drosophila. Current Biology. 20 (7), 643-648 (2010).
- von Trotha, J. W., Egger, B., Brand, A. H. Cell proliferation in the Drosophila adult brain revealed by clonal analysis and bromodeoxyuridine labelling. Neural Development. 4, 9 (2009).
- Fernandez-Hernandez, I., Rhiner, C., Moreno, E. Adult neurogenesis in Drosophila. Cell Reports. 3 (6), 1857-1865 (2013).
- Crocker, K. L., et al. Neurogenesis in the adult Drosophila brain. Genetics. , (2021).
- Plavicki, J., Mader, S., Pueschel, E., Peebles, P., Boekhoff-Falk, G. Homeobox gene distal-less is required for neuronal differentiation and neurite outgrowth in the Drosophila olfactory system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1578-1583 (2012).
- Aso, Y. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Ito, K., Awano, W., Suzuki, K., Hiromi, Y., Yamamoto, D. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A. Simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments. (118), e55128 (2016).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Arain, U., Valentino, P., Islam, I. M., Erclik, T. Dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult Drosophila brains for optic lobe visualization. Journal of Visualized Experiments. (170), e61273 (2021).
