Cet article décrit un flux de travail de techniques utilisées pour tester de nouveaux médiateurs candidats de métastases de mélanome et leur(s) mécanisme(s) d’action.
La métastase est un processus complexe, qui oblige les cellules à surmonter des barrières qui ne sont que partiellement modélisées par des essais in vitro . Un flux de travail systématique a été établi à l’aide de modèles in vivo robustes et reproductibles et de méthodes normalisées pour identifier de nouveaux acteurs dans les métastases du mélanome. Cette approche permet d’inférer des données à des stades expérimentaux spécifiques pour caractériser avec précision le rôle d’un gène dans les métastases. Les modèles sont établis en introduisant des cellules de mélanome génétiquement modifiées par injection intracardiaque, intradermique ou sous-cutanée chez la souris, suivie d’une surveillance par imagerie in vivo en série. Une fois les critères d’évaluation préétablis atteints, les tumeurs primaires et/ou les organes porteurs de métastases sont prélevés et traités pour diverses analyses. Les cellules tumorales peuvent être triées et soumises à l’une des nombreuses plates-formes « omiques », y compris le séquençage de l’ARN unicellulaire. Les organes subissent des analyses d’imagerie et d’immunohistopathologie pour quantifier le fardeau global des métastases et cartographier leur emplacement anatomique spécifique. Ce pipeline optimisé, y compris des protocoles normalisés pour la greffe, la surveillance, la récolte, le traitement et l’analyse des tissus, peut être adopté pour les cultures à court terme dérivées de patients et les lignées cellulaires humaines et murines établies de divers types de cancer solide.
La mortalité élevée associée au mélanome métastatique combinée à une incidence croissante de mélanome dans le monde1 (une augmentation estimée à 7,86 % d’ici 2025) nécessite de nouvelles approches thérapeutiques. Les progrès dans la découverte de cibles reposent sur des modèles reproductibles de métastases, un processus très complexe. Tout au long des étapes de la cascade métastatique, les cellules du mélanome doivent surmonter d’innombrables obstacles pour atteindre l’évasion du système immunitaire et la colonisation des tissus éloignés2. La résilience et l’adaptabilité des cellules du mélanome proviennent d’une multitude de facteurs, notamment leur charge mutationnelle génétique élevée3 et leur origine de crête neurale, qui confèrent une plasticité phénotypique cruciale 3,4,5. À chaque étape, les programmes transcriptionnels permettent aux cellules métastasantes du mélanome de passer d’un état à l’autre en fonction des signaux de la diaphonie avec le microenvironnement, comprenant le système immunitaire6, le milieu extracellulaire 7,8 et l’architecture cellulaire des barrières physiques 9 avec lesquelles elles entrent en contact. Par exemple, les cellules de mélanome échappent à la surveillance immunitaire en régulant à la baisse l’expression d’importants facteurs sécrétés par la tumeur d’amorçage immunitaire6.
Des études décrivent une « niche prémétastatique », dans laquelle les cellules du mélanome sécrètent des chimiokines et des cytokines pour amorcer l’organe « cible » distant pour les métastases10. Ces résultats soulèvent des questions importantes sur le tropisme organique des cellules de mélanome métastatique et la voie anatomique qu’elles empruntent pour accéder aux tissus éloignés. Après intravasation, on sait que les cellules du mélanome métastasent par les lymphatiques (propagation lymphatique) et les vaisseaux sanguins (propagation hématogène)2,11. Alors que la plupart des patients présentent une maladie localisée, un petit sous-ensemble de cas présente une maladie métastatique à distance et aucune dissémination lymphatique (atteinte négative des ganglions lymphatiques)11, ce qui suggère l’existence d’autres voies métastatiques pour le mélanome.
Lorsqu’elles colonisent un site métastatique, les cellules du mélanome subissent des adaptations épigénétiques et métaboliques12,13. Pour accéder et envahir de nouveaux compartiments, les cellules de mélanome utilisent des protéases14 et des modifications cytosquelettiques 11,15, qui leur permettent de traverser et de se développer dans leur nouvel emplacement. La difficulté de cibler les cellules du mélanome réside dans la complexité et le nombre de telles adaptations; ainsi, le domaine devrait s’efforcer de recréer expérimentalement autant d’étapes et d’adaptations que possible. Malgré de nombreuses avancées dans les essais in vitro tels que les organoïdes et les cultures 3D16,17, ces modèles ne récapitulent qu’incomplètement la cascade métastatique in vivo.
Les modèles murins ont montré de la valeur en trouvant un équilibre entre la reproductibilité, la faisabilité technique et la simulation de la maladie humaine. Les cellules de mélanome implantées par voie intravasculaire, orthotopique et hétérotopique à partir de xénogreffes dérivées de patients ou de cultures à court terme dans des souris immunodéprimées ou humanisées représentent l’épine dorsale de la découverte de cibles dans le mélanome métastatique. Cependant, ces systèmes manquent souvent d’une contrainte biologique cruciale sur les métastases: le système immunitaire. Les modèles de métastases de mélanome syngénique qui possèdent cette contrainte sont relativement rares sur le terrain. Ces systèmes, développés chez des souris immunocompétentes, dont B16-F1018, la famille YUMM des lignées cellulaires19, SM120, D4M321, RIM322 ou plus récemment, les lignées cellulaires de mélanome RMS23 et M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 , facilitent l’étude du rôle complexe de la réponse immunitaire de l’hôte dans la progression du mélanome.
Ici, un pipeline pour l’identification de la cible des métastases du mélanome est présenté. Avec l’augmentation et l’augmentation des ensembles de données « omiques » générés à partir de cohortes de patients atteints de mélanome, nous postulons que les études les plus prometteuses sur le plan clinique sont celles qui découlent de l’intégration de données volumineuses, conduisant à un interrogatoire fonctionnel et mécaniste méticuleux 25,26,27,28. En utilisant des modèles murins pour étudier des cibles potentielles dans le processus métastatique, on peut rendre compte des événements in vivo spécifiques et des interactions tissulaires, augmentant ainsi la probabilité de traduction clinique. Plusieurs méthodes pour quantifier la charge métastatique sont décrites, fournissant des données complémentaires sur les résultats d’une expérience donnée. Un protocole d’isolement unicellulaire des tumeurs dans divers organes est décrit pour aider à la caractérisation impartiale de l’expression des gènes dans les cellules métastatiques, qui peuvent précéder le séquençage de l’ARN unicellulaire ou en vrac.
L’objectif de ce rapport technique est d’offrir un flux de travail standardisé de haut en bas pour l’étude des acteurs potentiels dans les métastases du mélanome. Comme les expériences in vivo peuvent être coûteuses et prendre beaucoup de temps, les stratégies visant à maximiser l’efficacité et à augmenter la valeur des informations obtenues sont primordiales.
Il est impératif d’utiliser des approches complémentaires tout au long de la procédure pour valider le…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions la Division des technologies de recherche avancées (DART) de NYU Langone Health, et en particulier le laboratoire de recherche en pathologie expérimentale, le centre de technologie du génome, le laboratoire de cytométrie et de tri cellulaire, le noyau d’imagerie préclinique, qui sont partiellement soutenus par la subvention de soutien du Perlmutter Cancer Center NIH / NCI 5P30CA016087. Nous remercions le NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr Iman Osman) d’avoir donné accès à des cultures à court terme de mélanome dérivées de patients + (10-230BM et 12-273BM), qui ont été obtenues grâce à des protocoles approuvés par la CISR (étude de consentement universel #s16-00122 et étude interdisciplinaire du groupe coopératif sur le mélanome n ° 10362). Nous remercions le Dr Robert Kerbel (Université de Toronto) d’avoir fourni des lignées cellulaires de mélanome 113/6-4L et 131/4-5B1* et le Dr Meenhard Herlyn (Wistar Institute) d’avoir fourni des cultures à court terme de mélanome WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2**. E.H. est soutenu par NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, un American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award, et un NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI : I.O.). La figure 1 a été créée avec Biorender.com.
#15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
#3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |