Summary

Une plateforme de découverte robuste pour l’identification de nouveaux médiateurs de métastases de mélanome

Published: March 08, 2022
doi:

Summary

Cet article décrit un flux de travail de techniques utilisées pour tester de nouveaux médiateurs candidats de métastases de mélanome et leur(s) mécanisme(s) d’action.

Abstract

La métastase est un processus complexe, qui oblige les cellules à surmonter des barrières qui ne sont que partiellement modélisées par des essais in vitro . Un flux de travail systématique a été établi à l’aide de modèles in vivo robustes et reproductibles et de méthodes normalisées pour identifier de nouveaux acteurs dans les métastases du mélanome. Cette approche permet d’inférer des données à des stades expérimentaux spécifiques pour caractériser avec précision le rôle d’un gène dans les métastases. Les modèles sont établis en introduisant des cellules de mélanome génétiquement modifiées par injection intracardiaque, intradermique ou sous-cutanée chez la souris, suivie d’une surveillance par imagerie in vivo en série. Une fois les critères d’évaluation préétablis atteints, les tumeurs primaires et/ou les organes porteurs de métastases sont prélevés et traités pour diverses analyses. Les cellules tumorales peuvent être triées et soumises à l’une des nombreuses plates-formes « omiques », y compris le séquençage de l’ARN unicellulaire. Les organes subissent des analyses d’imagerie et d’immunohistopathologie pour quantifier le fardeau global des métastases et cartographier leur emplacement anatomique spécifique. Ce pipeline optimisé, y compris des protocoles normalisés pour la greffe, la surveillance, la récolte, le traitement et l’analyse des tissus, peut être adopté pour les cultures à court terme dérivées de patients et les lignées cellulaires humaines et murines établies de divers types de cancer solide.

Introduction

La mortalité élevée associée au mélanome métastatique combinée à une incidence croissante de mélanome dans le monde1 (une augmentation estimée à 7,86 % d’ici 2025) nécessite de nouvelles approches thérapeutiques. Les progrès dans la découverte de cibles reposent sur des modèles reproductibles de métastases, un processus très complexe. Tout au long des étapes de la cascade métastatique, les cellules du mélanome doivent surmonter d’innombrables obstacles pour atteindre l’évasion du système immunitaire et la colonisation des tissus éloignés2. La résilience et l’adaptabilité des cellules du mélanome proviennent d’une multitude de facteurs, notamment leur charge mutationnelle génétique élevée3 et leur origine de crête neurale, qui confèrent une plasticité phénotypique cruciale 3,4,5. À chaque étape, les programmes transcriptionnels permettent aux cellules métastasantes du mélanome de passer d’un état à l’autre en fonction des signaux de la diaphonie avec le microenvironnement, comprenant le système immunitaire6, le milieu extracellulaire 7,8 et l’architecture cellulaire des barrières physiques 9 avec lesquelles elles entrent en contact. Par exemple, les cellules de mélanome échappent à la surveillance immunitaire en régulant à la baisse l’expression d’importants facteurs sécrétés par la tumeur d’amorçage immunitaire6.

Des études décrivent une « niche prémétastatique », dans laquelle les cellules du mélanome sécrètent des chimiokines et des cytokines pour amorcer l’organe « cible » distant pour les métastases10. Ces résultats soulèvent des questions importantes sur le tropisme organique des cellules de mélanome métastatique et la voie anatomique qu’elles empruntent pour accéder aux tissus éloignés. Après intravasation, on sait que les cellules du mélanome métastasent par les lymphatiques (propagation lymphatique) et les vaisseaux sanguins (propagation hématogène)2,11. Alors que la plupart des patients présentent une maladie localisée, un petit sous-ensemble de cas présente une maladie métastatique à distance et aucune dissémination lymphatique (atteinte négative des ganglions lymphatiques)11, ce qui suggère l’existence d’autres voies métastatiques pour le mélanome.

Lorsqu’elles colonisent un site métastatique, les cellules du mélanome subissent des adaptations épigénétiques et métaboliques12,13. Pour accéder et envahir de nouveaux compartiments, les cellules de mélanome utilisent des protéases14 et des modifications cytosquelettiques 11,15, qui leur permettent de traverser et de se développer dans leur nouvel emplacement. La difficulté de cibler les cellules du mélanome réside dans la complexité et le nombre de telles adaptations; ainsi, le domaine devrait s’efforcer de recréer expérimentalement autant d’étapes et d’adaptations que possible. Malgré de nombreuses avancées dans les essais in vitro tels que les organoïdes et les cultures 3D16,17, ces modèles ne récapitulent qu’incomplètement la cascade métastatique in vivo.

Les modèles murins ont montré de la valeur en trouvant un équilibre entre la reproductibilité, la faisabilité technique et la simulation de la maladie humaine. Les cellules de mélanome implantées par voie intravasculaire, orthotopique et hétérotopique à partir de xénogreffes dérivées de patients ou de cultures à court terme dans des souris immunodéprimées ou humanisées représentent l’épine dorsale de la découverte de cibles dans le mélanome métastatique. Cependant, ces systèmes manquent souvent d’une contrainte biologique cruciale sur les métastases: le système immunitaire. Les modèles de métastases de mélanome syngénique qui possèdent cette contrainte sont relativement rares sur le terrain. Ces systèmes, développés chez des souris immunocompétentes, dont B16-F1018, la famille YUMM des lignées cellulaires19, SM120, D4M321, RIM322 ou plus récemment, les lignées cellulaires de mélanome RMS23 et M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 , facilitent l’étude du rôle complexe de la réponse immunitaire de l’hôte dans la progression du mélanome.

Ici, un pipeline pour l’identification de la cible des métastases du mélanome est présenté. Avec l’augmentation et l’augmentation des ensembles de données « omiques » générés à partir de cohortes de patients atteints de mélanome, nous postulons que les études les plus prometteuses sur le plan clinique sont celles qui découlent de l’intégration de données volumineuses, conduisant à un interrogatoire fonctionnel et mécaniste méticuleux 25,26,27,28. En utilisant des modèles murins pour étudier des cibles potentielles dans le processus métastatique, on peut rendre compte des événements in vivo spécifiques et des interactions tissulaires, augmentant ainsi la probabilité de traduction clinique. Plusieurs méthodes pour quantifier la charge métastatique sont décrites, fournissant des données complémentaires sur les résultats d’une expérience donnée. Un protocole d’isolement unicellulaire des tumeurs dans divers organes est décrit pour aider à la caractérisation impartiale de l’expression des gènes dans les cellules métastatiques, qui peuvent précéder le séquençage de l’ARN unicellulaire ou en vrac.

Protocol

REMARQUE: Les procédures animales impliquées dans le protocole suivant ont été approuvées par le New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Toutes les procédures sont effectuées dans des installations approuvées par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). La figure 1 illustre l’approche expérimentale générale. 1. Cultures à court terme de mélanome dérivé…

Representative Results

Les figures suivantes illustrent comment le flux de travail décrit a été appliqué pour l’identification de nouveaux facteurs de métastases de mélanome. La figure 2 résume les résultats d’une étude publiée dans laquelle les effets du silence de la fucosyltransférase FUT8 dans les métastases in vivo du mélanome ont été étudiés26. En bref, l’analyse des données glycomiques des patients humains (obtenues par des réseaux de lectines) et le…

Discussion

L’objectif de ce rapport technique est d’offrir un flux de travail standardisé de haut en bas pour l’étude des acteurs potentiels dans les métastases du mélanome. Comme les expériences in vivo peuvent être coûteuses et prendre beaucoup de temps, les stratégies visant à maximiser l’efficacité et à augmenter la valeur des informations obtenues sont primordiales.

Il est impératif d’utiliser des approches complémentaires tout au long de la procédure pour valider le…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions la Division des technologies de recherche avancées (DART) de NYU Langone Health, et en particulier le laboratoire de recherche en pathologie expérimentale, le centre de technologie du génome, le laboratoire de cytométrie et de tri cellulaire, le noyau d’imagerie préclinique, qui sont partiellement soutenus par la subvention de soutien du Perlmutter Cancer Center NIH / NCI 5P30CA016087. Nous remercions le NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr Iman Osman) d’avoir donné accès à des cultures à court terme de mélanome dérivées de patients + (10-230BM et 12-273BM), qui ont été obtenues grâce à des protocoles approuvés par la CISR (étude de consentement universel #s16-00122 et étude interdisciplinaire du groupe coopératif sur le mélanome n ° 10362). Nous remercions le Dr Robert Kerbel (Université de Toronto) d’avoir fourni des lignées cellulaires de mélanome 113/6-4L et 131/4-5B1* et le Dr Meenhard Herlyn (Wistar Institute) d’avoir fourni des cultures à court terme de mélanome WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2**. E.H. est soutenu par NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, un American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award, et un NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI : I.O.). La figure 1 a été créée avec Biorender.com.

Materials

#15 Scapel Blade  WPI 500242 For surgical procedures
#3 Scapel Handle WPI 500236 For surgical procedures
1 mL Tuberculin syringe, slip tip  BD 309626 Injections
10 mL syringe, slip tip  BD 301029 Perfusion
10% Formalin Sodium Buffered EK Industries 4499-20L For perfusion/tissue fixative
15 mL Conical Corning  430052 Cell culture
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Falcon 352196 Cell culture
200 Proof Ethanol Deacon Labs 04-355-223 Histology
22G – 22mm needle BD 305156 Perfusion
4-0 Vicryl Suture Ethicon J464G Suture
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde  EMS 15733-10 For perfusion/tissue fixative
40µm Corning 431750 Tissue processing
5-0 Absorbable Suture  Ethicon 6542000 Closure
50 mL Conical  Corning  430828 Cell culture
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Falcon 352070 Cell culture
7-0 Silk suture  FST 18020-70 Ligature
70µm Corning 431751 Tissue processing
Anti-fade mounting media   Vector Labs H-1000-10 Immunofluorescence
Approximator applying Forceps, 10cm  WPI 14189 For microsurgical procedures
Avance Bruker 3 HD NMR Console 
Biospec 7030  Bruker 7030 Micro MRI
BSA Bioreg A941 NuMA Staining
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm  WPI WP5025501 For microsurgical procedures
Coplin Staining Jar Bel-Art  F44208-1000 Histology
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG Immunofluorescence
dCas9-KRAB Addgene 110820 Genetic manipulation
DNase I NEB M0303L Tissue processing
DPBS Corning 21-030-CM Tissue processing
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade GEM 62-0167 Tissue processing
Extracellular Matrix Substrate  Corning 354234 Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative 
FBS Cytiva SH30910.03 Cell culture
Fiji Image J Fiji Image J Software Immunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer  Thermo Fisher A16104 NuMA Staining
Goat Serum Gibco PCN5000 Immunofluorescence
HBSS Corning 21-020-CV Tissue processing
Hematoxylin  Richard-Allan Scientific  7231 Histology
Illumina III  PerkinElmer CLS136334 BLI Instrument
Insulin syringe 28G – 8mm needle BD 329424 Injections
Insulin syringe 31G – 6mm needle  BD 326730 Injections
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated WPI 504478 For perfusion and surgical procedures
Isoflurane USP Covetrus 11695067772 Anesthesia
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip WPI WP6570 For microsurgical procedures
Ketamine HCl 100mg/mL Mylan Ind. 1049007 Anesthesia
lentiCRISPRv2 Addgene 98290 Genetic manipulation
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 Invitrogen L32472 Vascular endothelial cells marker
MEM non-essential amino acids X 100 Corning 25-025-CI Cell culture
Metzenbaum Scissors WPI 503269 For surgical procedures
Microinjection Unit KOPF 5000 Intracardiac injections
NaCl Fisher S25877  NuMA Staining
Needle 30G x 25mm BD 305128 Intracardiac Injection
Needle 33G x 15mm Hamilton 7747-01 Intracarotid Injection
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws WPI 14137-G For microsurgical procedures
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice The Jackson Laboratory 005557 Murine model
NU/J mice The Jackson Laboratory 002019 Murine model
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human  Abcam 97585 NuMA Staining
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL Gibco 15140122 Cell culture
Percoll GE 0891-01 density separation solution 
PI Classic Surgical Gloves Cardinal Health 2D72PT75X Surgery
pLKO Tet-On Addgene 21915 Genetic manipulation
Povidone-Iodine 10% Solution Medline MDS093943 Surgery
Proparacaine Drops 0.5% Akorn Pharma AX0501 Opthalmic local anesthetic
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment Dechra 83592 Anesthesia
Razor Blade Double Edge Blades  EMS 72000 Shaving and Vibrotome Brain Slicing 
Reflex 9mm EZ Clip  Braintree EZC- KIT Wound closure
RPMI 1640  Corning 10-040-CM Cell culture
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades WPI 501235 For microsurgical procedures
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome Leica VT1200 Brain Slice Immunofluorescence
Single Channel Anesthesia Vaporizer System Kent Scientific VetFlo-1210S  Anesthesia
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower EZ Systems TT4000 CO2 Euthanasia
Sterile Fenestrated Disposable Drape Medline NON21002 Surgery
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves Medline DYNJP2715 Surgery
T25 Flask Corning  430639 Cell culture
Tris Corning 46-031-CM NuMA Staining
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML Immunofluorescence
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform WPI WP505210 For microsurgical procedures
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg WPI 15911 For microsurgical procedures
Visiopharm Visiopharm Visiopharm NuMA Staining Quantification Software
Xylasine 100mg/mL Akorn Pharma 59399-111-50 Anesthesia
Xylene Fisher X3P-1GAL Histology

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Shadaloey, A. A. S., Karz, A., Moubarak, R. S., Agrawal, P., Levinson, G., Kleffman, K., Aristizabal, O., Osman, I., Wadghiri, Y. Z., Hernando, E. A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis. J. Vis. Exp. (181), e63186, doi:10.3791/63186 (2022).

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