Summary

Исследование сердечного метаболизма в изолированном перфузированном сердце мыши с помощью гиперполяризованной [1-13 C] пируватной и 13C/31P ЯМР-спектроскопии

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

Мы описываем экспериментальную установку для введения гиперполяризованных 13-меченных 13С-метаболитов в режиме непрерывной перфузии изолированному перфузированному сердцу мыши. Специальный подход к сбору данных 13С-ЯМР позволил количественно оценить активность метаболических ферментов в режиме реального времени, а многопараметрический анализ 31Р-ЯМР позволил определить содержание АТФ в ткани и рН.

Abstract

Обмен веществ является основой важных процессов в клеточной жизни. Характеристика того, как функционируют метаболические сети в живых тканях, дает важную информацию для понимания механизма заболеваний и разработки методов лечения. В данной работе мы описываем процедуры и методики изучения внутриклеточной метаболической активности в ретроградно перфузированном сердце мыши в режиме реального времени. Сердце было изолировано in situ в сочетании с остановкой сердца, чтобы свести к минимуму ишемию миокарда, и перфузировалось внутри спектрометра ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В то время как в спектрометре и при непрерывной перфузии гиперполяризованный [1-13 C] пируват вводили в сердце, а последующие гиперполяризованные [1-13 C] лактат и [13C] бикарбонат служили для определения в режиме реального времени скорости производства лактатдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы. Эта метаболическая активность гиперполяризованного [1-13C]пирувата была количественно определена с помощью ЯМР-спектроскопии в свободной модели с использованием метода получения селективного насыщения-возбуждения продукта. 31 См. В промежутках между гиперполяризованными исследованиями применялась P-спектроскопия для мониторинга сердечной энергетики и рН. Эта система уникально полезна для изучения метаболической активности в здоровом и больном сердце мыши.

Introduction

Изменения в сердечном метаболизме связаны с различными кардиомиопатиями и часто составляют основу основных патофизиологических механизмов1. Тем не менее, существует множество препятствий для изучения метаболизма в живых тканях, поскольку большинство биохимических анализов требуют гомогенизации ткани и лизиса клеток и/или радиоактивного отслеживания. Поэтому существует острая потребность в новых инструментах для исследования метаболизма миокарда в живых тканях. Магнитный резонанс (МРТ) гиперполяризованных 13С-меченных субстратов позволяет в режиме реального времени измерять метаболизм в живых тканях2 без использования ионизирующего излучения путем увеличения отношения сигнал/шум МР-сигнал/шум (SNR) меченого сайта (сайтов) на несколько порядков3. Здесь мы описываем экспериментальную установку, подход к приобретению и аналитический подход для изучения быстрого метаболизма в изолированном сердце мыши и, параллельно, представляем показатели общей тканевой энергетики и кислотности. рН сердца является ценным показателем, так как кислотно-щелочной баланс нарушается на ранних стадиях сердечных заболеваний и таких состояний, как ишемия миокарда, дезадаптивная гипертрофия исердечная недостаточность6.

Гиперполяризованное производство [1-13 C]лактата и [13 C]бикарбоната из гиперполяризованного [1-13C] пирувата помогает определить скорость производства лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и пируватдегидрогеназы (ПДГ). В большинстве предыдущих исследований, выполненных с использованием гиперполяризованных субстратов в изолированном сердце грызуна, либо использовались сложные кинетические модели для получения ферментативной активности ЛДГ и ФДГ, либо сообщалось об отношениях интенсивности сигнала гиперполяризованного продукта к субстрату без расчета фактических скоростей активности ферментов 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Здесь мы использовали метод 15 селективного насыщения-возбуждения продукта, который позволяет контролировать активность фермента без моделирования15,16. Таким образом, были определены абсолютные ферментативные скорости (т.е. количество молей продукта, произведенного в единицу времени). 31 См. P-спектроскопия использовалась для наблюдения сигналов неорганического фосфата (Pi), фосфокреатина (PCr) и аденозинтрифосфата (АТФ). Многопараметрический анализ был использован для характеристики распределения рН сердца, о чем свидетельствует гетерогенный химический сдвиг в Pi-сигнале ткани.

Ретроградно перфузированное сердце мыши (сердце Лангендорфа)17,18,19 является моделью ex vivo для неповрежденного бьющегося сердца. В этой модели жизнеспособность сердца и рН сохраняются в течение не менее 80 мин20, и она показала потенциал для восстановления после длительного ишемического повреждения21,22. Тем не менее, непреднамеренная вариабельность во время микрохирургии может привести к вариабельности жизнеспособности тканей в сердцах. В предыдущих исследованиях сообщалось об ухудшении состояния этого сердца с течением времени19; Например, наблюдалось снижение сократительной функции на 5-10% в час18. Ранее было показано, что сигнал аденозинтрифосфата (АТФ) сообщает об энергетическом статусе и жизнеспособности миокарда23. Здесь мы отметили, что перфузированное сердце может иногда демонстрировать непреднамеренную вариабельность уровней жизнеспособности, о чем свидетельствует содержание АТФ, несмотря на то, что у нас была непрерывная перфузия и снабжение кислородом. Здесь мы демонстрируем, что нормализация показателей ЛДГ и ФДГ к содержанию АТФ в сердце снижает межсердечную вариабельность этих показателей.

В следующем протоколе мы описываем хирургическую процедуру, используемую для канюляции сердца, выделения и последующей перфузии в ЯМР-спектрометре. Следует отметить, что другие хирургические подходы, направленные на изоляцию и перфузию сердца мыши, были описаны до24,25.

Также описаны методики, используемые для получения данных, связанных с ферментативными скоростями в работающем сердце (с использованием спектроскопии 13 C и гиперполяризованного [1-13C] пирувата), а также жизнеспособностью и кислотностью сердца (с использованием 31P ЯМР-спектроскопии). Наконец, объясняются аналитические методологии определения активности метаболических ферментов, жизнеспособности и кислотности тканей.

Protocol

Объединенный комитет по этике (IACUC) Еврейского университета и медицинского центра «Хадасса» одобрил протокол исследования по благополучию животных (MD-19-15827-1). 1. Подготовка буфера Кребса-Хензеляйта За сутки до эксперимента приготовьте модифицированный вар?…

Representative Results

На рисунке 1А показаны 31спектры P, записанные в сердце мыши, перфузированном KHB, и только в буфере. В сердце наблюдались сигналы α-, β- и γ-АТФ, PCr и Pi. Пи-сигнал состоял из двух основных компонентов: в более высоком поле (левая часть сигнала) пи-сигнал был в основном обусл…

Discussion

Мы демонстрируем экспериментальную установку, предназначенную для исследования гиперполяризованного [1-13C] пируватного метаболизма, тканевой энергетики и рН в изолированной модели сердца мыши.

Важнейшими шагами в рамках протокола являются следующие: 1) обеспечени…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот проект финансировался Израильским научным фондом в рамках грантового соглашения No 1379/18; стипендия Жаботинского Министерства науки и технологий Израиля по прикладным и инженерным наукам для прямых аспирантов No 3-15892 для докторов наук; и исследовательская и инновационная программа Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research

References

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff’s isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury – A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O’Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model – ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Cancer Research. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Cancer Research. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Play Video

Cite This Article
Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).

View Video