Мы описываем экспериментальную установку для введения гиперполяризованных 13-меченных 13С-метаболитов в режиме непрерывной перфузии изолированному перфузированному сердцу мыши. Специальный подход к сбору данных 13С-ЯМР позволил количественно оценить активность метаболических ферментов в режиме реального времени, а многопараметрический анализ 31Р-ЯМР позволил определить содержание АТФ в ткани и рН.
Обмен веществ является основой важных процессов в клеточной жизни. Характеристика того, как функционируют метаболические сети в живых тканях, дает важную информацию для понимания механизма заболеваний и разработки методов лечения. В данной работе мы описываем процедуры и методики изучения внутриклеточной метаболической активности в ретроградно перфузированном сердце мыши в режиме реального времени. Сердце было изолировано in situ в сочетании с остановкой сердца, чтобы свести к минимуму ишемию миокарда, и перфузировалось внутри спектрометра ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В то время как в спектрометре и при непрерывной перфузии гиперполяризованный [1-13 C] пируват вводили в сердце, а последующие гиперполяризованные [1-13 C] лактат и [13C] бикарбонат служили для определения в режиме реального времени скорости производства лактатдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы. Эта метаболическая активность гиперполяризованного [1-13C]пирувата была количественно определена с помощью ЯМР-спектроскопии в свободной модели с использованием метода получения селективного насыщения-возбуждения продукта. 31 См. В промежутках между гиперполяризованными исследованиями применялась P-спектроскопия для мониторинга сердечной энергетики и рН. Эта система уникально полезна для изучения метаболической активности в здоровом и больном сердце мыши.
Изменения в сердечном метаболизме связаны с различными кардиомиопатиями и часто составляют основу основных патофизиологических механизмов1. Тем не менее, существует множество препятствий для изучения метаболизма в живых тканях, поскольку большинство биохимических анализов требуют гомогенизации ткани и лизиса клеток и/или радиоактивного отслеживания. Поэтому существует острая потребность в новых инструментах для исследования метаболизма миокарда в живых тканях. Магнитный резонанс (МРТ) гиперполяризованных 13С-меченных субстратов позволяет в режиме реального времени измерять метаболизм в живых тканях2 без использования ионизирующего излучения путем увеличения отношения сигнал/шум МР-сигнал/шум (SNR) меченого сайта (сайтов) на несколько порядков3. Здесь мы описываем экспериментальную установку, подход к приобретению и аналитический подход для изучения быстрого метаболизма в изолированном сердце мыши и, параллельно, представляем показатели общей тканевой энергетики и кислотности. рН сердца является ценным показателем, так как кислотно-щелочной баланс нарушается на ранних стадиях сердечных заболеваний и таких состояний, как ишемия миокарда, дезадаптивная гипертрофия исердечная недостаточность6.
Гиперполяризованное производство [1-13 C]лактата и [13 C]бикарбоната из гиперполяризованного [1-13C] пирувата помогает определить скорость производства лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и пируватдегидрогеназы (ПДГ). В большинстве предыдущих исследований, выполненных с использованием гиперполяризованных субстратов в изолированном сердце грызуна, либо использовались сложные кинетические модели для получения ферментативной активности ЛДГ и ФДГ, либо сообщалось об отношениях интенсивности сигнала гиперполяризованного продукта к субстрату без расчета фактических скоростей активности ферментов 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Здесь мы использовали метод 15 селективного насыщения-возбуждения продукта, который позволяет контролировать активность фермента без моделирования15,16. Таким образом, были определены абсолютные ферментативные скорости (т.е. количество молей продукта, произведенного в единицу времени). 31 См. P-спектроскопия использовалась для наблюдения сигналов неорганического фосфата (Pi), фосфокреатина (PCr) и аденозинтрифосфата (АТФ). Многопараметрический анализ был использован для характеристики распределения рН сердца, о чем свидетельствует гетерогенный химический сдвиг в Pi-сигнале ткани.
Ретроградно перфузированное сердце мыши (сердце Лангендорфа)17,18,19 является моделью ex vivo для неповрежденного бьющегося сердца. В этой модели жизнеспособность сердца и рН сохраняются в течение не менее 80 мин20, и она показала потенциал для восстановления после длительного ишемического повреждения21,22. Тем не менее, непреднамеренная вариабельность во время микрохирургии может привести к вариабельности жизнеспособности тканей в сердцах. В предыдущих исследованиях сообщалось об ухудшении состояния этого сердца с течением времени19; Например, наблюдалось снижение сократительной функции на 5-10% в час18. Ранее было показано, что сигнал аденозинтрифосфата (АТФ) сообщает об энергетическом статусе и жизнеспособности миокарда23. Здесь мы отметили, что перфузированное сердце может иногда демонстрировать непреднамеренную вариабельность уровней жизнеспособности, о чем свидетельствует содержание АТФ, несмотря на то, что у нас была непрерывная перфузия и снабжение кислородом. Здесь мы демонстрируем, что нормализация показателей ЛДГ и ФДГ к содержанию АТФ в сердце снижает межсердечную вариабельность этих показателей.
В следующем протоколе мы описываем хирургическую процедуру, используемую для канюляции сердца, выделения и последующей перфузии в ЯМР-спектрометре. Следует отметить, что другие хирургические подходы, направленные на изоляцию и перфузию сердца мыши, были описаны до24,25.
Также описаны методики, используемые для получения данных, связанных с ферментативными скоростями в работающем сердце (с использованием спектроскопии 13 C и гиперполяризованного [1-13C] пирувата), а также жизнеспособностью и кислотностью сердца (с использованием 31P ЯМР-спектроскопии). Наконец, объясняются аналитические методологии определения активности метаболических ферментов, жизнеспособности и кислотности тканей.
Мы демонстрируем экспериментальную установку, предназначенную для исследования гиперполяризованного [1-13C] пируватного метаболизма, тканевой энергетики и рН в изолированной модели сердца мыши.
Важнейшими шагами в рамках протокола являются следующие: 1) обеспечени…
The authors have nothing to disclose.
Этот проект финансировался Израильским научным фондом в рамках грантового соглашения No 1379/18; стипендия Жаботинского Министерства науки и технологий Израиля по прикладным и инженерным наукам для прямых аспирантов No 3-15892 для докторов наук; и исследовательская и инновационная программа Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 858149 (AlternativesToGd).
Equipment | |||
HyperSense DNP Polariser | Oxford Instruments | 52-ZNP91000 | HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer |
NMR spectrometer | RS2D | NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe | |
Peristaltic pump | Cole-Parmer | 07554-95 | |
Temperature probe | Osensa | FTX-100-LUX+ | NMR compatible temprature probe |
Somnosuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | ||
Lines, tubings, suture | |||
Platinum cured silicone tubes | Cole-Parmer | HV-96119-16 | L/S 16 I.D. 3.1 mm |
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines | Upchurch Scientific | id. 0.040” | |
Intravenous catheter | BD Medical | 381323 | 22 G |
Silk suture | Ethicon | W577H | Wire diameter of 3-0 |
Chemicals and pharmaceuticals | |||
[1-13C]pyruvic acid | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-8077-1 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | CAS: 10043-52-4 |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | CAS: 50-99-77 |
Heparin sodium | Rotexmedica | HEP5A0130C0160 | |
Hydrochloric acid 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | CAS: 7647-01-0 |
Insulin aspart (NovoLog) | Novo Nordisk | ||
Isoflurane | Terrel | ||
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 793612 | CAS: 7487-88-9 |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | CAS: 7447-40-7 |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | CAS: 7778-77-0 |
Sodium bicarbonate | Gadot Group | CAS: 144-55-8 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | CAS: 7647-14-5 |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 655104 | CAS: 1310-73-2 |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S7907 | CAS: 7558-79-4 |
Sodium phosphate monbasic dihydrate | Merck | 6345 | CAS: 13472-35-0 |
TRIS (biotechnology grade) | Amresco | 0826 | CAS: 77-86-1 |
Trityl radical OX063 | GE Healthcare AS | NC100136 | OX063 |
NMR standards | |||
13C standard sample | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-72A | 40% p-dioxane in benzene-D6 |
31P standard sample | Made in house | 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O | |
Software | |||
Excel 2016 | Microsoft | ||
MNova | Mestrelab Research |