Describimos una configuración experimental para administrar metabolitos hiperpolarizados marcados con 13C en modo de perfusión continua a un corazón de ratón perfundido aislado. Un enfoque dedicado de adquisición de 13C-RMN permitió la cuantificación de la actividad enzimática metabólica en tiempo real, y un análisis multiparamétrico de 31R-P permitió la determinación del contenido de ATP tisular y el pH.
El metabolismo es la base de procesos importantes en la vida celular. La caracterización de cómo funcionan las redes metabólicas en los tejidos vivos proporciona información crucial para comprender el mecanismo de las enfermedades y diseñar tratamientos. En este trabajo, describimos procedimientos y metodologías para estudiar la actividad metabólica en la célula en un corazón de ratón retrógradamente perfundido en tiempo real. El corazón se aisló in situ, junto con un paro cardíaco para minimizar la isquemia miocárdica y se perfundió dentro de un espectrómetro de resonancia magnética nuclear (RMN). Mientras estaba en el espectrómetro y bajo perfusión continua, se administró piruvato hiperpolarizado [1-13 C] al corazón, y las posteriores tasas de producción hiperpolarizadas de [1-13 C] lactato y [13C] bicarbonato sirvieron para determinar, en tiempo real, las tasas de producción de lactato deshidrogenasa y piruvato deshidrogenasa. Esta actividad metabólica del piruvato hiperpolarizado [1-13C] se cuantificó con espectroscopia de RMN en un modelo de manera libre utilizando el enfoque de adquisición de excitaciones de saturación selectivas del producto. 31 La espectroscopia P se aplicó entre las adquisiciones hiperpolarizadas para monitorear la energética cardíaca y el pH. Este sistema es excepcionalmente útil para estudiar la actividad metabólica en el corazón sano y enfermo del ratón.
Las alteraciones en el metabolismo cardíaco están asociadas con una variedad de miocardiopatías y a menudo forman la base de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes1. Sin embargo, existen numerosos obstáculos para estudiar el metabolismo en tejidos vivos, ya que la mayoría de los ensayos bioquímicos requieren la homogeneización de la lisis tisular y celular y / o el trazado radiactivo. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de nuevas herramientas para investigar el metabolismo miocárdico en tejidos vivos. La resonancia magnética (RM) de sustratos hiperpolarizados marcados con 13C permite mediciones en tiempo real del metabolismo en tejidos vivos2, sin el uso de radiación ionizante, al aumentar la relación señal-ruido (SNR) de MR del sitio (s) marcado en varios órdenes de magnitud3. Aquí, describimos una configuración experimental, un enfoque de adquisición y un enfoque analítico para estudiar el metabolismo rápido en el corazón de ratón aislado y, en paralelo, presentamos indicadores de energía y acidez tisular general. El pH cardíaco es un indicador valioso, ya que el equilibrio ácido-base se interrumpe en las primeras etapas de enfermedades cardíacas y afecciones como isquemia miocárdica, hipertrofia desadaptativa e insuficiencia cardíaca6.
La producción hiperpolarizada de [1-13 C]lactato y [13 C]bicarbonato a partir de piruvato hiperpolarizado [1-13C]ayuda a determinar las tasas de producción de lactato deshidrogenasa (LDH) y piruvato deshidrogenasa (PDH). La mayoría de los estudios previos realizados utilizando sustratos hiperpolarizados en el corazón de roedor aislado utilizaron modelos cinéticos complejos para derivar la actividad enzimática de LDH y PDH, o informaron las relaciones de intensidad de señal del producto hiperpolarizado a un sustrato sin calcular las tasas reales de actividad enzimática 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Aquí, utilizamos el enfoque de saturación-excitaciones selectivas del producto 15, que permite el monitoreo de la actividad enzimática de manera libre de modelo15,16. De esta manera, se determinaron las tasas enzimáticas absolutas (es decir, el número de moles de producto producido por unidad de tiempo). 31 La espectroscopia P se utilizó para observar las señales de fosfato inorgánico (Pi), fosfocreatina (PCr) y trifosfato de adenosina (ATP). Se utilizó un análisis multiparamétrico para caracterizar la distribución del pH del corazón, como lo demuestra el cambio químico heterogéneo en la señal Pi del tejido.
El corazón de ratón retrógrado perfundido (corazón de Langendorff)17,18,19 es un modelo ex vivo para el corazón latente intacto. En este modelo, la viabilidad cardíaca y el pH se conservan durante al menos 80 min20, y ha mostrado potencial de recuperación después de una lesión isquémica prolongada21,22. Sin embargo, la variabilidad inadvertida durante la microcirugía puede conducir a la variabilidad en la viabilidad del tejido a través de los corazones. Estudios previos han reportado sobre el deterioro de este corazón a lo largo del tiempo19; Por ejemplo, se ha observado una reducción de la función contráctil del 5%-10% por hora18. La señal de trifosfato de adenosina (ATP) ha demostrado previamente que informa sobre el estado energético miocárdico y la viabilidad23. Aquí, notamos que el corazón perfundido ocasionalmente puede mostrar una variabilidad involuntaria en los niveles de viabilidad, como lo demuestra el contenido de ATP, a pesar del hecho de que tuvimos un suministro ininterrumpido de perfusión y oxígeno. Demostramos aquí que normalizar las tasas de LDH y PDH al contenido de ATP del corazón reduce la variabilidad intercardíaca en estas tasas.
En el siguiente protocolo, describimos el procedimiento quirúrgico utilizado para la canulación cardíaca, el aislamiento y la consiguiente perfusión en el espectrómetro de RMN. Cabe destacar que otros enfoques quirúrgicos dirigidos a aislar y perfundir el corazón del ratón se han descrito antes de24,25.
También se describen las metodologías utilizadas para adquirir datos relacionados con las tasas enzimáticas en el corazón latiendo (utilizando espectroscopia 13 C y piruvato hiperpolarizado [1-13C]) y la viabilidad y acidez del corazón (utilizando espectroscopia de RMN 31P). Finalmente, se explican las metodologías analíticas para determinar las actividades enzimáticas metabólicas y la viabilidad y acidez de los tejidos.
Demostramos una configuración experimental que está diseñada para investigar el metabolismo hiperpolarizado del piruvato [1-13C], la energética de los tejidos y el pH en un modelo de corazón de ratón aislado.
Los pasos críticos dentro del protocolo son los siguientes: 1) asegurar que el pH del tampón sea 7.4; 2) garantizar que se incluyan todos los componentes del búfer; 3) evitar la coagulación de la sangre en los vasos cardíacos mediante inyecciones de heparina; 4) evit…
The authors have nothing to disclose.
Este proyecto recibió financiación de la Fundación Científica de Israel en virtud del acuerdo de subvención Nº 1379/18; la Beca Jabotinsky del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel para Ciencias Aplicadas y de Ingeniería para estudiantes de doctorado directos No. 3-15892 para D.S.; y el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención No. 858149 (AlternativesToGd).
Equipment | |||
HyperSense DNP Polariser | Oxford Instruments | 52-ZNP91000 | HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer |
NMR spectrometer | RS2D | NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe | |
Peristaltic pump | Cole-Parmer | 07554-95 | |
Temperature probe | Osensa | FTX-100-LUX+ | NMR compatible temprature probe |
Somnosuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | ||
Lines, tubings, suture | |||
Platinum cured silicone tubes | Cole-Parmer | HV-96119-16 | L/S 16 I.D. 3.1 mm |
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines | Upchurch Scientific | id. 0.040” | |
Intravenous catheter | BD Medical | 381323 | 22 G |
Silk suture | Ethicon | W577H | Wire diameter of 3-0 |
Chemicals and pharmaceuticals | |||
[1-13C]pyruvic acid | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-8077-1 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | CAS: 10043-52-4 |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | CAS: 50-99-77 |
Heparin sodium | Rotexmedica | HEP5A0130C0160 | |
Hydrochloric acid 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | CAS: 7647-01-0 |
Insulin aspart (NovoLog) | Novo Nordisk | ||
Isoflurane | Terrel | ||
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 793612 | CAS: 7487-88-9 |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | CAS: 7447-40-7 |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | CAS: 7778-77-0 |
Sodium bicarbonate | Gadot Group | CAS: 144-55-8 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | CAS: 7647-14-5 |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 655104 | CAS: 1310-73-2 |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S7907 | CAS: 7558-79-4 |
Sodium phosphate monbasic dihydrate | Merck | 6345 | CAS: 13472-35-0 |
TRIS (biotechnology grade) | Amresco | 0826 | CAS: 77-86-1 |
Trityl radical OX063 | GE Healthcare AS | NC100136 | OX063 |
NMR standards | |||
13C standard sample | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-72A | 40% p-dioxane in benzene-D6 |
31P standard sample | Made in house | 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O | |
Software | |||
Excel 2016 | Microsoft | ||
MNova | Mestrelab Research |