Summary
सुसंस्कृत ड्रोसोफिला मस्तिष्क स्पष्टीकरण में quiescent तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को फिर से सक्रिय करने के लिए एक विधि स्थापित की गई है। इस विधि का उपयोग करते हुए, प्रणालीगत संकेतों की भूमिका को तंत्रिका स्टेम सेल क्विसेंस, प्रवेश और निकास के विनियमन में ऊतक-आंतरिक संकेतों से जोड़ा जा सकता है।
Abstract
तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) में एपोप्टोसिस को फैलाने, अलग करने, गुजरने और यहां तक कि प्रवेश करने और बाहर निकलने की क्षमता होती है। इनमें से कई प्रक्रियाओं को एनएससी बाहरी कारकों, स्थानीय और प्रणालीगत के साथ एनएससी आंतरिक आनुवंशिक कार्यक्रमों के बीच जटिल इंटरप्ले द्वारा नियंत्रित किया जाता है। आनुवांशिक मॉडल जीव में, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, एनएससी, जिसे न्यूरोब्लास्ट्स (एनबीएस) के रूप में जाना जाता है, भ्रूण से लार्वा संक्रमण के दौरान प्रसार के लिए क्विसेंस से स्विच करते हैं। इस समय के दौरान, लार्वा उनके अंडे के छिलके से उभरते हैं और आहार पोषक तत्वों की तलाश में रेंगना शुरू करते हैं। पशु आहार के जवाब में, वसा शरीर, लिपिड भंडारण क्षमता के साथ एक अंतःस्रावी अंग, एक संकेत का उत्पादन करता है, जिसे परिसंचारी हेमोलिम्फ में व्यवस्थित रूप से जारी किया जाता है। वसा शरीर व्युत्पन्न संकेत (एफबीडीएस) के जवाब में, ड्रोसोफिला इंसुलिन जैसे पेप्टाइड्स (डिल्प्स) का उत्पादन और मस्तिष्क न्यूरोसेक्रेटरी न्यूरॉन्स और ग्लिया से जारी किया जाता है, जिससे एनबीएस में पीआई 3-किनेज विकास सिग्नलिंग के डाउनस्ट्रीम सक्रियण और उनके ग्लियाल और श्वासनली आला। यद्यपि यह वर्तमान मॉडल है कि कैसे एनबीए क्विसेंस से प्रसार के लिए स्विच करते हैं, एफबीडीएस बाहरी क्यू की प्रकृति मायावी बनी हुई है। बेहतर ढंग से समझने के लिए कि एनबी बाह्य प्रणालीगत संकेत क्विसेंस से बाहर निकलने को कैसे विनियमित करते हैं, पशु आहार से पहले विट्रो में शुरुआती लार्वा दिमाग को संस्कृति करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी। इस विधि के साथ, बहिर्जात कारकों को संस्कृति मीडिया और एनबी को आपूर्ति की जा सकती है जो कि परीक्षित से बाहर निकलते हैं। हमने पाया कि बहिर्जात इंसुलिन पूरे मस्तिष्क स्पष्टीकरण में क्विसेंस से एनबीए को फिर से सक्रिय करने के लिए पर्याप्त है। क्योंकि यह विधि बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, इसलिए हम अतिरिक्त बाहरी संकेतों की पहचान करने का लक्ष्य रखते हैं जो एनबी क्विसेंस बनाम प्रसार निर्णयों को विनियमित करते हैं। क्योंकि जीन और मार्ग जो एनएससी प्रसार निर्णयों को विनियमित करते हैं, वे विकासवादी रूप से संरक्षित होते हैं, इस परख के परिणाम क्लिनिक में पुनर्योजी उपचारों में सुधार करने में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।
Introduction
पुनर्योजी चिकित्सा 1,2 में उपयोग के लिए उनकी क्षमता के कारण स्टेम कोशिकाएं बहुत रुचि रखती हैं। कई जानवर, विशेष रूप से वे जो लंबे समय तक रहते हैं, अपने वयस्क ऊतकों के भीतर स्टेम कोशिकाओं को बनाए रखते हैं। ये निवासी स्टेम कोशिकाएं ऊतक होमोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए कार्य करती हैं और शारीरिक चोट या बीमारी 3,4 के बाद मरम्मत के लिए उपयोग की जाती हैं। वयस्क जानवरों में अधिकांश स्टेम कोशिकाएं क्विसेंट होती हैं, जो एक अपेक्षाकृत निष्क्रिय अवस्था होती है जो सेल चक्र गिरफ्तारी और विकास सिग्नलिंग 5 की निष्क्रियता की विशेषता होतीहै। बाहरी संकेतों के जवाब में, स्टेम कोशिकाएं क्विसेंस से बाहर निकलती हैं, सेल चक्र में प्रवेश करती हैं और अपने ऊतक प्रकार के लिए विशिष्ट बेटी संतान पैदा करना शुरू कर देती हैं। उदाहरण के लिए, एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को माउंट करने के लिए, एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाएं कोशिका चक्र में प्रवेश करने और क्लोनल रूप से 6 का विस्तार करने के लिए क्विसेंट भोले टी कोशिकाओं को प्रेरित करतीहैं। कंकाल की मांसपेशियों की क्षति के जवाब में, मांसपेशियों की उपग्रह स्टेम कोशिकाएं कोशिका चक्र में प्रवेश करती हैं और क्षतिग्रस्त मायोफिब्रिल 5,7 को बदलने के लिए बेटी मायोब्लास्ट उत्पन्न करती हैं। हालांकि यह स्पष्ट है कि क्विसेंट स्टेम कोशिकाएं बाहरी संकेतों का जवाब देती हैं, कई मामलों में, बाहरी क्यू की प्रकृति अस्पष्ट रहती है और साथ ही क्यू-प्रेरित स्टेम सेल सक्रियण का तंत्र भी। क्विसेंट स्टेम कोशिकाएं बाहरी संकेतों का जवाब देने और सेल चक्र में प्रवेश करने की बेहतर समझ प्राप्त करना क्लिनिक में बेहतर स्टेम सेल उपचार के विकास में सहायता करेगा और वैज्ञानिक ज्ञान में वृद्धि करेगा।
अब दशकों से, मॉडल जीवों का उपयोग जीन और सेल सिग्नलिंग मार्गों को उजागर करने के लिए किया गया है जो विकास के दौरान और वयस्कता में स्टेम सेल प्रसार को विनियमित करते हैं। ड्रोसोफिला में, तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी), जिसे न्यूरोब्लास्ट्स (एनबी) के रूप में जाना जाता है, सभी न्यूरॉन्स और ग्लिया उत्पन्न करने के लिए पूरे विकास में विभाजित होता है जो अंततः एकीकृत होता है, मस्तिष्क समारोह 8,9 के लिए आवश्यक तंत्रिका सर्किटी बनाता है। अन्य स्टेम कोशिकाओं की तरह, एनबीए स्वयं को नवीनीकृत करने के लिए असममित रूप से विभाजित होते हैं और कुछ मामलों में, स्टेम सेल पूल का विस्तार करने के लिए सममित रूप से विभाजित होते हैं। एनबी को भ्रूणजनन के दौरान निर्दिष्ट किया जाता है और अधिकांश अंत की ओर क्विसेंस दर्ज करते हैं, जो घटते मातृ पोषक तत्वों के भंडार (चित्रा 1) के साथ संयोग है। भ्रूणजनन पूरा होने के बाद, लार्वा हैच और खिलाना शुरू कर देता है। पशु आहार के जवाब में, एनबीए क्विसेंस से फिर से सक्रिय हो जाते हैं और सेल डिवीजनोंको फिर से शुरू करते हैं 10,11,12,13,14,15,16। क्योंकि ड्रोसोफिला सीएनएस अपेक्षाकृत सरल है और क्योंकि एनबीए परिभाषित समय पर क्विसेंस में प्रवेश करते हैं और बाहर निकलते हैं, ड्रोसोफिला का उपयोग करके क्विसेंस, प्रवेश और निकास के विनियमन की जांच करने के लिए, आदर्श साबित होता है।
चित्रा 1: सीबी एनबी (केंद्रीय मस्तिष्क न्यूरोब्लास्ट्स, लाल) और एमबी एनबीए (मशरूम बॉडी न्यूरोब्लास्ट्स, नीले) के सापेक्ष प्रसार विकास के समय पर। Embryogenesis के अंत में, अधिकांश NBs (लाल रेखा) प्रसार बंद कर देते हैं और quiescence में प्रवेश करते हैं। Quiescence तब तक जारी रहता है जब तक कि ताजा हैच किए गए लार्वा अपने पहले पूर्ण भोजन का उपभोग नहीं करते। इस पद्धति के लिए फोकस के समय बिंदुओं को लाल हलकों (1, क्विसेंस और 2, पुनर्सक्रियन) में दर्शाया जाता है। एमबी एनबीए (नीला) केंद्रीय मस्तिष्क एनबीए का एक सबसेट है जो पूरे विकास (4 प्रति मस्तिष्क गोलार्ध) में लगातार विभाजित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पशु आहार के जवाब में, PI3-kinase और TOR विकास सिग्नलिंग मार्ग NBs में और उनके glial और श्वासनली आला10,11,15,16 में सक्रिय हो जाते हैं। जब आहार पोषक तत्वों को वापस ले लिया जाता है या जब पीआई 3-किनेज के स्तर को कम कर दिया जाता है, तो एनबीए पुन: सक्रिय करने में विफल रहते हैं और ग्लिया और श्वासनली की वृद्धि भी10,11,15,16 कम हो जाती है। वर्तमान मॉडल यह मानता है कि एनबी पुनर्सक्रियन को वसा शरीर द्वारा लार्वा विकास के लिए युग्मित किया जाता है, जोपशु आहार 12,17,18 के जवाब में एक प्रणालीगत संकेत जारी करता है। यह संकेत, जो मायावी बना हुआ है, संभवतः मस्तिष्क में ड्रोसोफिला इंसुलिन जैसे पेप्टाइड (डिल्प्स) की अभिव्यक्ति और रिहाई को बढ़ावा देता है, जो एनबीए में पीआई 3-किनेज के डाउनस्ट्रीम सक्रियण और उनके ग्लियाल और श्वासनली आला की ओर जाता है। प्रणालीगत क्यू (ओं) की प्रकृति को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमने सुसंस्कृत मस्तिष्क स्पष्टीकरण में क्विसेंट एनबीए को फिर से सक्रिय करने के लिए एक विधि विकसित की। इस विधि के साथ, पूरे पशु प्रणालीगत संकेतों की अनुपस्थिति में NBs के पुनर्सक्रियन को परखा जा सकता है। बहिर्जात कारकों को संस्कृति मीडिया और एनबी पुनर्सक्रियन को फिर से आपूर्ति की जा सकती है, जो थाइमिडिन एनालॉग, ईडीयू के निगमन के आधार पर परखा जाता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने निर्धारित किया कि बहिर्जात इंसुलिन मस्तिष्क स्पष्टीकरण में क्विसेंट एनबीए को फिर से सक्रिय करने के लिए पर्याप्त है। भविष्य के काम का उद्देश्य अतिरिक्त कारकों की पहचान करना होगा, जब वापस जोड़ा जाता है, तो या तो सकारात्मक या नकारात्मक रूप से मस्तिष्क स्पष्टीकरण में एनबी क्विसेंस को विनियमित करता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ड्रोसोफिला लार्वा संग्रह
नोट: खमीर प्लेट, अंगूर पेस्ट, और फ्लाई कॉन्डो शुरू करने से पहले तैयार करें:
- खमीर पेस्ट: एक छोटे से कंटेनर में, 10 मिलीलीटर पानी के साथ 5 ग्राम सक्रिय शुष्क खमीर को मिलाकर एक पेस्ट बनाएं जिसमें मूंगफली के मक्खन की स्थिरता होती है। प्लास्टिक रैप के साथ खमीर पेस्ट को कवर करें और कंटेनर में मजबूती से संलग्न करने के लिए एक रबर बैंड का उपयोग करें।
नोट: ताजा खमीर पेस्ट अपने कंटेनर में विस्तार होगा और ढक्कन बंद पॉप होगा जब तक कि दृढ़ता से संलग्न. खमीर पेस्ट कमरे के तापमान (आरटी) पर कई दिनों तक चलेगा। - अंगूर प्लेटें: अंगूर प्लेटें बनाने के लिए नुस्खा का पालन करें (तालिका 1)। यदि 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्लेटों का उपयोग कर रहे हैं, तो उन्हें 1 घंटे के लिए आरटी पर रखकर उपयोग करने से पहले प्री-वार्म प्लेटों को सुनिश्चित करें।
- 4 एल फ्लास्क में पानी (750 मिलीलीटर) और आगर (18.75 ग्राम) को मिलाएं, घुमावें, और 20 मिनट (तरल चक्र) के लिए आटोक्लेव।
- अंगूर का रस (250 मिलीलीटर) और सुक्रोज (25 ग्राम) को एक गर्म प्लेट (कम गर्मी) पर एक बड़ी हलचल बार के साथ 1 एल फ्लास्क में मिलाएं। जब सुक्रोज भंग हो जाता है, तो गर्मी को बंद कर दें, तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि टेगोसेप्ट (10%, 4 एमएल) और प्रोपियोनिक एसिड (5 एमएल) जोड़ने से पहले फ्लास्क को छुआ न जा सके। हलचल पट्टी पर रखें।
- जब ऑटोक्लेविंग पूरा हो जाता है, तो इसे तब तक ठंडा होने दें जब तक कि फ्लास्क को छुआ नहीं जा सकता (~ 60 डिग्री सेल्सियस), फिर अंगूर के रस के मिश्रण में मिलाएं।
- एक फ्लास्क में सभी समाधानों को संयोजित करें और प्लेट पर हलचल करें।
- छोटे आकार के पेट्री व्यंजनों (35 मिमी) के ढक्कन में समाधान को पिपेट करें। पिपेट लगभग 9 एमएल प्रति ढक्कन या जब तक एक उत्तल गुंबद प्राप्त नहीं होता है।
- वैकल्पिक: किसी भी बुलबुले से छुटकारा पाने के लिए ढक्कन लौ.
- जब प्लेटें जम जाती हैं, तो अंगूर की प्लेटों को एक एयरटाइट ढक्कन के साथ एक बॉक्स में ढेर करें और बॉक्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। प्लेटों को 1 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।
- कोंडो फ्लाई: एक 18 जी सुई का उपयोग करके एक 6-औंस वर्ग तल पॉलीप्रोपाइलीन ड्रोसोफिला बोतल में पंच ~ 20 छेद।
- वयस्क मक्खियों (~ 100 ओरेगनआर या किसी भी जीनोटाइप) को एक मक्खी कोंडो में स्थानांतरित करें और खमीर पेस्ट के एक थपकी के साथ सबसे ऊपर एक अंगूर अगर प्लेट के साथ कॉन्डो को कैप करें। प्लेट के केंद्र की ओर थपकी रखें और प्लेट को लैब टेप के साथ कॉन्डो पर चिपकाएं।
- कंटेनर को उलटें ताकि अंगूर अगर प्लेट तल पर हो और इसे 24 घंटे (चित्रा 2) के लिए 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
चित्रा 2: पुरुष और महिला ड्रोसोफिला वयस्कों के साथ उल्टे मक्खी की बोतल (कोंडो) का दृश्य प्रतिनिधित्व। प्लास्टिक की बोतल में छोटे पंचर होते हैं, जो ऑक्सीजन एक्सचेंज के लिए 18 जी सुई के साथ उत्पन्न होते हैं। बोतल के मुंह को आगर अंगूर के रस की टोपी के साथ सील कर दिया जाता है और इसे उलटा किया जाता है और 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संग्रहीत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
- 24 घंटे के बाद, अंगूर अगर प्लेट को बदलें और इसे खमीर पेस्ट के साथ सबसे ऊपर एक नई प्लेट के साथ बदलें। बेंच पर कोंडो को लगातार हल्के से टैप करते हुए जल्दी से दो प्लेटों को स्विच करें ताकि वयस्क मक्खियां बच न सकें।
- प्लेट को आंखों से जांचें और प्लेट पर भ्रूण की संख्या का आकलन करें। ड्रोसोफिला भ्रूण आयताकार और सफेद होते हैं जिनमें दो स्ट्रिंग जैसे उपांग होते हैं।
- यदि प्लेट पर बहुत कम भ्रूण हैं (100 से कम), तो प्लेट को छोड़ दें (अगर को मक्खी कचरे में स्क्रैप करें और पुन: उपयोग के लिए प्लास्टिक के ढक्कन को सहेजें)। कई मामलों में, वयस्क मादाएं एक नए कॉन्डो में पहली रात को कई भ्रूण नहीं रखेंगी। यदि यह मामला है, तो वयस्क मक्खियों को acclimate करने के लिए एक और 24 घंटे दें।
- यदि प्लेट पर बड़ी संख्या में भ्रूण हैं (कम से कम 100), तो इसे रखें, और एक फ्लैट बॉटम स्पैटुला का उपयोग करके खमीर पेस्ट को सावधानीपूर्वक हटा दें।
- एक बार खमीर पेस्ट हटा दिया जाता है, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत अंगूर प्लेट से सभी लार्वा को मैन्युअल रूप से हटाने के लिए एक धातु पिक का उपयोग करें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत प्लेट को देखते समय, रेंगने वाले लार्वा को भ्रूण के साथ-साथ देखा जाना चाहिए।
- एक लार्वा के पक्ष की ओर धातु लेने ब्रश करके सभी लार्वा निकालें। लार्वा चिपचिपा कर रहे हैं और लेने के लिए छड़ी होगी. एक बार जब एक लार्वा पिक पर होता है, तो अतिरिक्त लार्वा को अधिक संलग्न करने के लिए उपकरण पर लार्वा का उपयोग करके आसानी से उठाया जा सकता है।
नोट: लार्वा एक दूसरे से चिपके रहना पसंद करते हैं। इस बिंदु पर, इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि लार्वा क्षतिग्रस्त हो जाता है या नहीं। इन लार्वा को छोड़ दिया जाएगा। - सभी लार्वा को चुनने और हटाने के बाद, प्लेट को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस रखें। प्लेट को एक बड़े कंटेनर में रखना सुनिश्चित करें जिसे सील किया जा सकता है। नमी में रखने के लिए बड़े कंटेनर के तल में गीले कागज के तौलिए रखें।
- 30-60 मिनट के बाद, प्लेट को विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर वापस ले जाएं और अब, ध्यान से एक ही अंगूर अगर प्लेट से ~ 20-25 लार्वा चुनें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि चुने गए लार्वा ताजा समय की 30-60 मिनट की खिड़की के भीतर हैंच किए गए हैं।
- 20-25 ताजा हैच किए गए लार्वा के साथ उपकरण की नोक को एक पेट्री डिश (60 मिमी) में डुबोएं, जो 2 मिनट के लिए 1x फॉस्फेट बफ़र्ड सेलाइन (पीबीएस) के 1-2 मिलीलीटर से भरा हुआ है।
- 2 मिनट के बाद, नीचे तरल पूल करने के लिए एक कोण पर पकवान टिप। एक छोटे से पेंटब्रश का उपयोग करके, लार्वा को तरल से बाहर निकालकर पेट्री डिश के नीचे तक ब्रश करें।
- पेंटब्रश पर सभी लार्वा एकत्र करें और लार्वा को एक नए पेट्री डिश (60 मिमी) में स्थानांतरित करें जिसमें 70% इथेनॉल के 1-2 एमएल शामिल हैं। एक पेंटब्रश के साथ लार्वा एकत्र करने के लिए चरणों 1.15 को दोहराएं और उन्हें 1x पीबीएस के 1-2 एमएल के साथ एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
2. संस्कृति मीडिया और उपकरण की तैयारी
- 70% इथेनॉल के साथ बेंच और कार्य क्षेत्र का छिड़काव करें और सूखने दें।
- विच्छेदन उपकरण, संदंश, और दो ग्लास घड़ी व्यंजन स्प्रे, 70% इथेनॉल के साथ और उन्हें बेंच पर सूखने दें।
- पूरक श्नाइडर के मीडिया (एसएसएम, टेबल 2) को बनाएं और इसे बर्फ पर रखें।
- पिपेट ग्लास घड़ी व्यंजनों में से प्रत्येक में एसएसएम के 1 एमएल।
- एक बाँझ टिप के साथ एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करते हुए, पहले ग्लास वॉच डिश में एसएसएम में पीबीएस की प्लेट से ताजा हैच किए गए लार्वा को स्थानांतरित करें। एक बाँझ टिप के साथ एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करते हुए, दूसरे ग्लास वॉच डिश में एसएसएम में ताजा हैच किए गए लार्वा को स्थानांतरित करें।
3. विच्छेदन और मस्तिष्क संस्कृतियों
- एक बार जब लार्वा एसएसएम के साथ दूसरे ग्लास वॉच डिश में होते हैं, तो संदंश और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लार्वा से बाहर मस्तिष्क को विच्छेदित करें। आवर्धन को आवश्यकतानुसार समायोजित करें.
- मुंह के हुक को पकड़ने के लिए एक संदंश का उपयोग करें और दूसरे के साथ, धीरे से शरीर को आधे रास्ते से नीचे ले जाएं और लार्वा को दो टुकड़ों में विभाजित करने के लिए विपरीत दिशा (चित्रा 3) में खींचें।
नोट: मस्तिष्क मुंह के हुक के ठीक पीछे स्थित होगा। ध्यान दें कि मस्तिष्क के आसपास अन्य ऊतक हो सकते हैं। इन ऊतकों को हटाते समय बहुत सावधान रहें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप मस्तिष्क को नुकसान हो सकता है
चित्रा 3: एसएसएम के साथ एक ग्लास वॉच डिश में ड्रोसोफिला लार्वा। संदंश विच्छेदन के लिए ठीक से तैनात हैं। लार्वा मस्तिष्क (गहरे भूरे) का स्थान मुंह के हुक (काले) के पीछे है, और दोनों को लार्वा के अंदर दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
- एक बार जब 15-20 दिमाग को विच्छेदित कर दिया जाता है, तो एक बाँझ 12-अच्छी तरह से संस्कृति ट्रे के एक कुएं में एसएसएम के 1 एमएल जोड़ें। एक माइक्रोपिपेट और एक बाँझ टिप (चित्रा 4 ए) का उपयोग करके एसएसएम में ताजा विच्छेदित दिमाग को स्थानांतरित करें।
- 12-वेल कल्चर ट्रे में एसएसएम मीडिया में दिमाग को 24 घंटे (चित्रा 4 ए) के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें।
चित्रा 4: मस्तिष्क संस्कृति और immunostaining. (ए) एसएसएम के 1 मिलीलीटर युक्त एक 12-अच्छी तरह से संस्कृति पकवान में पूरे दिमाग। संस्कृति पकवान को तब 24 घंटे (बी) 72-अच्छी तरह से मिनी ट्रे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जाता है जो इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान मस्तिष्क के स्पष्टीकरण को रखता है। दिमाग को धोया जाता है और 10 μL पर सेट किए गए P20 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके समाधान स्थानांतरित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
4. प्रसार परख, मस्तिष्क निर्धारण, और एंटीबॉडी धुंधला
- अगले दिन, EdU SSM समाधान के 1 mL बनाएँ। पिपेट 10 μL एक 10 mM स्टॉक के 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) SSM के 990 μL के साथ (अंतिम EdU एकाग्रता 0.1 mM के बराबर है) एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब और मिश्रण में. 24 घंटे इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद, EdU SSM के 1 मिलीलीटर को बाँझ 12-अच्छी तरह से संस्कृति ट्रे के एक कुएं में पिपेट करें।
- अच्छी तरह से युक्त एसएसएम से एक बाँझ टिप के साथ एक माइक्रोपिपेट का उपयोग कर दिमाग को स्थानांतरित करें, केवल ईडीयू एसएसएम समाधान युक्त नए कुएं के लिए। 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- इसके बाद, EdU-लेबल वाले दिमाग को उसी संस्कृति ट्रे में एक और अच्छी तरह से स्थानांतरित करें जिसमें 20 मिनट के लिए फिक्सेटिव (4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड, नुस्खा के लिए तालिका 3 देखें) का 1 मिलीलीटर शामिल है।
सावधानी: पैराफॉर्मेल्डिहाइड एक जैविक खतरा है और इसे ठीक से निपटाया जाना चाहिए। - निर्धारण के बाद, जल्दी से एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 72-अच्छी तरह से मिनी ट्रे के कुओं में दिमाग को स्थानांतरित करें। प्रत्येक अच्छी तरह से 10 दिमाग और तरल के 10-15 μL (चित्रा 4B) पकड़ सकते हैं। एक बार जब दिमाग मिनी ट्रे में स्थानांतरित हो जाता है (प्रति अच्छी तरह से 10 से अधिक दिमाग नहीं), फिक्स को हटा दें और 1x पीबीटी (फॉस्फेट बफर, पीएच 7.4 0.1% ट्राइटन-एक्स 100 युक्त) के 10 μL में 3 बार दिमाग को कुल्ला करें।
नोट: Rinsing का मतलब है दिमाग पर 1x PBT के 10 μL pipetting, हटाने, और 3 बार दोहराने. - इसके बाद, 10 मिनट के लिए मस्तिष्क को 3 बार धोएं, फिर से 10 μL 1x PBT में। सुनिश्चित करें कि दिमाग हर समय कुछ तरल के साथ कवर कर रहे हैं।
- धोने के पूरा होने के बाद, दिमाग पर ब्लॉकिंग समाधान (10% सामान्य बकरी सीरम के साथ 1x PBT) के पिपेट 10 μL। ट्रे को कवर करें और किनारे के चारों ओर पैराफिल्म की एक पट्टी का उपयोग करके इसे सील करें।
- एक बार सील होने के बाद, मिनी ट्रे को गीले तौलिए के साथ एक सीलबंद बॉक्स में रखें ताकि वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक नम वातावरण प्रदान किया जा सके। ट्रे वाले बॉक्स को रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- अगले दिन, एक प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान बनाएं।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, खरगोश विरोधी scribble neuroblasts लेबल करने के लिए सेल झिल्ली और चूहे विरोधी deadpan लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, हालांकि अन्य प्राथमिक एंटीबॉडी की किसी भी संख्या का उपयोग किया जा सकता है।- प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान बनाने के लिए, सबसे पहले, अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने का निर्माण करें। उदाहरण के लिए, खरगोश विरोधी scribble 1: 1000 की एक अंतिम एकाग्रता पर प्रयोग किया जाता है। इसलिए, सबसे पहले, खरगोश विरोधी स्क्रिबल एंटीबॉडी को 1: 100 पर पतला करें (एंटीबॉडी के 1 μL प्लस ब्लॉकिंग समाधान के 99 μL)। रैट-डेडपैन का उपयोग 1: 100 की अंतिम एकाग्रता पर किया जाता है। इसलिए, सबसे पहले, 1:10 पर चूहे-डेडपैन एंटीबॉडी को पतला करें (एंटीबॉडी का 1 μL प्लस ब्लॉकिंग समाधान का 9 μL)।
नोट: इन dilutions 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है यदि सोडियम azide (0.05%) भी जीवाणु विकास को रोकने के लिए जोड़ा जाता है। - इसके बाद, उन कुओं की संख्या की गणना करें जिनमें दिमाग होते हैं। कुओं की संख्या बनाने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की मात्रा निर्धारित करती है। उदाहरण के लिए, यदि दिमाग के 2 कुएं हैं, तो प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 20 μL (10 कुओं, 100 μL, आदि के लिए) तैयार करें। एक 20 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान बनाने के लिए, प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 2 μL और ब्लॉकिंग समाधान के 16 μL जोड़ें।
नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी में से प्रत्येक की अंतिम एकाग्रता क्रमशः 1: 1000 और 1: 100 है। संक्षेप में, प्राथमिक एंटीबॉडी का पहला पतलापन एक एकाग्रता पर करें ताकि संबंधित अंतिम सांद्रता पर पहुंचने के लिए दूसरा कमजोर पड़ने वाला हमेशा 1: 10 हो। इस मामले में, खरगोश विरोधी scribble के लिए 1: 1000 और चूहे विरोधी deadpan के लिए 1: 100.
- प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान बनाने के लिए, सबसे पहले, अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने का निर्माण करें। उदाहरण के लिए, खरगोश विरोधी scribble 1: 1000 की एक अंतिम एकाग्रता पर प्रयोग किया जाता है। इसलिए, सबसे पहले, खरगोश विरोधी स्क्रिबल एंटीबॉडी को 1: 100 पर पतला करें (एंटीबॉडी के 1 μL प्लस ब्लॉकिंग समाधान के 99 μL)। रैट-डेडपैन का उपयोग 1: 100 की अंतिम एकाग्रता पर किया जाता है। इसलिए, सबसे पहले, 1:10 पर चूहे-डेडपैन एंटीबॉडी को पतला करें (एंटीबॉडी का 1 μL प्लस ब्लॉकिंग समाधान का 9 μL)।
- माइक्रोपिपेट के साथ ब्लॉकिंग समाधान को 10 μL और पिपेट 10 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के प्रत्येक कुएं में सेट करें।
- कवर और पैराफिल्म का उपयोग कर ट्रे सील और गीले तौलिए के साथ सील बॉक्स में वापस जगह है. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
नोट: मिलाते हुए आवश्यक नहीं है और दृढ़ता से हतोत्साहित है। एंटीबॉडी हिलाने या मिश्रण के बिना दिमाग में प्रवेश करेंगे। - अगले दिन, एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और 1x PBT के 10 μL के साथ 3 बार दिमाग को कुल्ला करें। इसके बाद, प्रत्येक 10 मिनट के लिए 1x PBT के 10 μL के साथ दिमाग को 4 बार धोएं। 10 मिनट धोने के दौरान, द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
- द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान बनाने के लिए, द्वितीयक एंटीबॉडी चुनें जो प्राथमिक एंटीबॉडी को पहचानते हैं। इस प्रोटोकॉल में बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर 488 और बकरी विरोधी चूहा एलेक्सा 555 का उपयोग किया गया था।
- प्रत्येक द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए अंतिम एकाग्रता 1: 300 बनाने के लिए ब्लॉकिंग समाधान के 298 μL के साथ एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में द्वितीयक एंटीबॉडी में से प्रत्येक के पिपेट 1 μL।
- पिछले 10 मिनट धोने के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 1x PBT और पिपेट 10 μL को हटा दें। पैराफिल्म का उपयोग करके ट्रे को सील करें और इसे नम तौलिए के साथ बॉक्स में वापस रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
नोट: कुल्ला, धोने, या प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ते समय कुओं में हर आखिरी μL को हटाने के बारे में चिंता न करें। दिमाग हमेशा तरल के कुछ μL में डूबा रहेगा, जो सिर्फ ठीक है। - अगले दिन, एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और 1x पीबीटी के प्रत्येक 10 μL के साथ मस्तिष्क को 3 बार कुल्ला करें। इसके बाद, 10 मिनट प्रत्येक के लिए 1x PBT के प्रत्येक 10 μL के साथ 4 बार दिमाग को धोएं।
- 10 मिनट धोने के दौरान, EdU निगमन का पता लगाने के लिए EdU प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। निर्माताओं के दिशानिर्देशों के अनुसार EdU प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें।
- अंतिम धोने के बाद, 1x PBT और पिपेट 10 μL EdU प्रतिक्रिया मिश्रण के दिमाग के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से में निकालें। पैराफिल्म के साथ माइक्रोवेल प्लेट को सील करें और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें। 30 मिनट के लिए बेंच पर प्लेट छोड़ दें।
- 30 मिनट के बाद, 1x PBT में से प्रत्येक 10 μL के साथ दिमाग को 3 बार कुल्ला करें और 5 मिनट के लिए 1x PBT में से प्रत्येक 10 μL के साथ 3 बार दिमाग को धोएं।
- अंतिम धोने के बाद, ग्लिसरॉल-आधारित बढ़ते मीडिया समाधान के 1x PBT और पिपेट 10 μL को हटा दें। प्लेट को सील करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
5. बढ़ते और मस्तिष्क इमेजिंग
- अगले दिन, माइक्रोस्कोप स्लाइड (25 मिमी x 75 मिमी x 1 मिमी) तैयार करें: गोंद (उदाहरण के लिए, सुपरग्लू) माइक्रोस्कोप स्लाइड के प्रत्येक छोर पर एक 22 मिमी x 22 मिमी x 1 मिमी वर्ग कवर ग्लास एक 'पुल' बनाने के लिए जिस पर स्लाइड और बड़े कवरस्लिप (चित्रा 5 ए) के बीच एक स्थान बनाने के लिए बड़े 22 मिमी x 50 मिमी x 1 मिमी कवरस्लिप को रखा जाएगा। यह स्थान मस्तिष्क को कुचलने से रोकते हुए सही ढंग से उन्मुख होने के लिए पर्याप्त आंदोलन की अनुमति देगा।
चित्र5: लार्वा मस्तिष्क में माइक्रोस्कोप स्लाइड, अभिविन्यास और सेल प्रकारों को दिखाने वाली योजनाबद्ध। (ए) माइक्रोस्कोप स्लाइड का दृश्य प्रतिनिधित्व जिस पर एक लार्वा मस्तिष्क लगाया जाता है और छवि के लिए तैयार होता है। (बी) ऊतक अभिविन्यास के लिए उपयोग करने के लिए एक दिशानिर्देश भी दिखाया गया है। (सी) एक confocal माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए तैयार माइक्रोस्कोप स्लाइड. (डी) लार्वा मस्तिष्क में सेल प्रकारों में से कुछ को दिखाने वाला कार्टून। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
- माइक्रोस्कोप स्लाइड के लिए 22 मिमी x 22 मिमी x 1 मिमी कवर चश्मे को चिपकाने के बाद, ग्लिसरॉल-आधारित बढ़ते मीडिया समाधान के पिपेट 9.3 μL माइक्रोवेल प्लेट के कुएं से एक मस्तिष्क युक्त होता है और इसे स्लाइड के केंद्र पर रखता है (चित्रा 5 ए)।
नोट: लार्वा दिमाग पिपेट टिप का पालन कर सकते हैं, इसलिए सावधान रहें। आसंजन से बचने के लिए, एंटीफ़ेड को एस्पिरेट करके शुरू करें और फिर 9.3 μL वॉल्यूम के अंत में एकल मस्तिष्क को एस्पिरेट करें। - एक बार जब मस्तिष्क स्लाइड पर होता है, तो धीरे से शीर्ष पर 22 मिमी x 50 मिमी x 1 मिमी कवरस्लिप रखें। मस्तिष्क को चित्र 5B में देखे गए अनुसार स्थिति दें। मस्तिष्क को उन्मुख करने के लिए धीरे से कवरस्लिप को चारों ओर ले जाएं। नमूना तब इमेजिंग के लिए तैयार है।
- सबसे अच्छी छवियों को प्राप्त करने के लिए उच्च आवर्धन और एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य (चित्रा 5 सी) से सुसज्जित एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। उदाहरण के लिए: 60x या 63x, 1.4 NA तेल-विसर्जन लेंस।
- कवरस्लिप (और उद्देश्य) के निकटतम पृष्ठीय सतह के साथ दिमाग की छवि। 1 μm अंतराल या Z चरण आकार पर वेंट्रल सतह (उद्देश्य से सबसे दूर) पर शुरू होने वाले पूरे मस्तिष्क गोलार्ध के माध्यम से Z स्टैक प्राप्त करें।
नोट: उपयोग किए जाने वाले लेजर द्वितीयक एंटीबॉडी पर निर्भर करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, उपयोग की जाने वाली लेजर लाइनें स्क्रिबल स्टेनिंग का पता लगाने के लिए 488 एनएम, डेडपैन का पता लगाने के लिए 555 एनएम और ईडीयू का पता लगाने के लिए 633 एनएम थीं।
- कवरस्लिप (और उद्देश्य) के निकटतम पृष्ठीय सतह के साथ दिमाग की छवि। 1 μm अंतराल या Z चरण आकार पर वेंट्रल सतह (उद्देश्य से सबसे दूर) पर शुरू होने वाले पूरे मस्तिष्क गोलार्ध के माध्यम से Z स्टैक प्राप्त करें।
6. डेटा विश्लेषण
- मस्तिष्क गोलार्धों का विश्लेषण करने और कोशिकाओं की गिनती करने के लिए फिजी सेल काउंटर प्लगइन का उपयोग करने के लिए फिजी ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ताजा हैच किए गए ओरेगनआर जंगली-प्रकार के दिमाग को इंसुलिन के साथ पूरक श्नाइडर के मीडिया (एसएसएम) में 24 घंटे के लिए विच्छेदित और सुसंस्कृत किया गया था। ऊतकों को प्रोटोकॉल के अनुसार तय और दाग दिया गया था। एनबी का पता लगाने के लिए डेडपैन (डीपीएन) के खिलाफ उत्पन्न प्राथमिक एंटीबॉडी और सेल झिल्ली को लेबल करने के लिए स्क्रिबल का उपयोग किया गया था। Thymidine एनालॉग 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) एस-चरण प्रविष्टि और एनबी पुनर्सक्रियन का पता लगाने के लिए जोड़ा गया था। हमने संस्कृति में 24 घंटे के बाद बड़े आकार के Edu सकारात्मक और Dpn सकारात्मक NBs पाए (चित्रा 6A-C)। अगला, ताजा हैच किए गए ओरेगनआर जंगली-प्रकार के दिमाग को इंसुलिन के बिना पूरक श्नाइडर्स मीडिया में 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था। संस्कृति में 24 घंटे के बाद, हमें चार मशरूम बॉडी एनबीए और एक वेंट्रोलेटरल एनबी (चित्रा 6 डी-एफ) के अलावा कोई बड़े आकार के एडु पॉजिटिव और डीपीएन पॉजिटिव एनबीए नहीं मिले। मशरूम शरीर और वेंट्रोलेटरल न्यूरोब्लास्ट्स केंद्रीय मस्तिष्क न्यूरोब्लास्ट्स का एक सबसेट है जो भ्रूण से लार्वा संक्रमण के दौरान लगातार विभाजित होता है। हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि बहिर्जात इंसुलिन श्नाइडर के मीडिया में सुसंस्कृत मस्तिष्क में क्विसेंस से न्यूरोब्लास्ट्स को फिर से सक्रिय करने के लिए पर्याप्त है।
कॉन्फोकल इमेजिंग के दौरान, क्षति के साथ कुछ मस्तिष्क गोलार्धों को कभी-कभी देखा गया था। हमने जो नुकसान पाया, उसमें मस्तिष्क के ऊतकों में छोटे से बड़े आकार के छेद शामिल थे (चित्रा 6 जी, एच)। इन ऊतकों को विश्लेषण से बाहर रखा गया था। 24 घंटे के समय बिंदु के अलावा, मस्तिष्क को 48 घंटे (डेटा नहीं दिखाया गया है) के लिए सफलतापूर्वक सुसंस्कृत किया गया था। संस्कृति में 48 घंटे के बाद, हमने डीपीएन पॉजिटिव ईडीयू पॉजिटिव सीबी एनबीएस की संख्या में और वृद्धि और ऊतक क्षति के साथ दिमाग की संख्या में वृद्धि पाई। इससे पता चलता है कि लंबे समय तक दिमाग को कल्चर करना संभवतः संभव है; हालांकि, ऊतक क्षति से बचने के लिए बहुत सावधानी बरतनी चाहिए।
चित्रा 6: Confocal इमेजिंग( A-C) बहिर्जात इंसुलिन quiescent NBs को पुन: सक्रिय करने के लिए पर्याप्त है। (A) इंसुलिन की उपस्थिति में संस्कृति के 24 घंटे के बाद डेडपैन (Dpn) और Edu सकारात्मक NBs को दिखाने वाले एक मस्तिष्क गोलार्ध का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण। (बी) स्क्रिबल (स्क्रिब) इम्युनोस्टेनिंग सेल झिल्ली के साथ एक ही मस्तिष्क गोलार्ध की एक एकल जेड स्लाइस छवि। (C) पैनल B में इनसेट में NB का उच्च आवर्धन एकल-चैनल ग्रेस्केल छवियों के साथ रंग मर्ज नीचे दाईं ओर। (D-F) बहिर्जात इंसुलिन की अनुपस्थिति में एनबीए क्विसेंट रहते हैं। (d) इंसुलिन की अनुपस्थिति में संस्कृति के 24 घंटे के बाद Dpn और Edu positive NBs को दिखाने वाले एक मस्तिष्क गोलार्ध का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण। (ई) स्क्रिब इम्युनोस्टेनिंग के साथ एक ही मस्तिष्क गोलार्ध का एक एकल जेड स्टैक। (एफ) पैनल ई में इनसेट में एनबी का उच्च आवर्धन एकल-चैनल ग्रेस्केल छवियों के साथ रंग मर्ज नीचे दाईं ओर। एरोहेड 4 एमबी एनबीए में से एक को दर्शाता है, जो लगातार विभाजित होता है और क्विसेंस में प्रवेश नहीं करता है और बाहर निकलता है (चित्रा 1 को देखें)। (G,H) क्षतिग्रस्त मस्तिष्क स्पष्टीकरण के उदाहरण, विश्लेषण में उपयोग नहीं किया जाता है। (जी) ऊतक में बड़े छेद के साथ एक मस्तिष्क गोलार्ध का एक एकल जेड टुकड़ा। (एच) एक मस्तिष्क गोलार्ध का एक एकल जेड टुकड़ा ऊतक में छोटे छेद दिखाता है। स्केल बार: 10 μm. सफेद डैश्ड लाइन मध्यरेखा को इंगित करती है। पूर्वकाल ऊपर है, और पीछे नीचे है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| सामग्री / राशि | 1 एल (~ 125 अंगूर प्लेटों) |
| अंगूर का रस | 250 mL |
| शर्करा | 25 ग्राम |
| पानी | 750 mL |
| Bacto आगर | 18.75 ग्राम |
| टेगोसेप्ट (10%) | 4 मिलीलीटर |
| प्रोपियोनिक अम्ल | 5 mL |
टेबल 1: अंगूर की प्लेटें बनाने के लिए नुस्खा। अनुभाग 1.2 में वर्णित चरणों का पालन करें।
| घटक (एकाग्रता शुरू) | 5 mL बनाने के लिए | अंतिम एकाग्रता |
| श्नाइडर ड्रोसोफिला मीडिया | 3.89 mL | |
| भ्रूण गोजातीय सीरम (100%) | 500 μL | 10% |
| ग्लूटामाइन (200 mM) | 500 μL | 20 mM |
| पेनिसिलिन (5000 इकाइयाँ/एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (50,000 μg/mL) | 100 μL | 1000 U/mL पेन, 1 mg/mL Strep |
| इंसुलिन (10 mg/mL) | 10 μL | 0.02 mg/mL |
| ग्लूटाथियोन (50 mg/mL) | 5 μL | 0.05 mg/mL |
| बाँझ हुड में, बाँझ तकनीक का उपयोग करके, 14 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सभी अवयवों को एक साथ जोड़ें। इसे उपयोग करने तक बर्फ पर रखें। | ||
तालिका 2: पूरक श्नाइडर के मीडिया (एसएसएम) बनाने के लिए नुस्खा। तालिका एसएसएम के 5 एमएल तैयार करने के लिए आवश्यक सभी अवयवों की मात्रा को सूचीबद्ध करती है।
| फिक्सेटिव बनाने की विधि | ||
| घटक (एकाग्रता शुरू) | 40 mL बनाने के लिए | अंतिम एकाग्रता |
| EM ग्रेड formaldehyde 16% | 10 mL | 4% |
| PEM बफर पीएच 7.0 | 29.96 mL | |
| ट्राइटन एक्स-100 | 40 mL | 0.10% |
| सभी सामग्रियों को एक साथ मिलाएं। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1 मिलीलीटर ऐलीकोट करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। पिघलने के बाद एलीकोट को फिर से फ्रीज न करें। | ||
| PEM बफर के लिए नुस्खा | ||
| घटक (एकाग्रता शुरू) | 100 mL बनाने के लिए | अंतिम एकाग्रता |
| पाइप पीएच 6.8 (500 mM) | 20 mL | 100 mM |
| ईजीटीए (500 mM) | 2 मिलीलीटर | 10 mM |
| MgSO4 (1 M) | 100 mL | 1 mM |
| पानी | 77.9 mL | |
तालिका 3: fixative और पीईएम बफर बनाने के लिए नुस्खा. तालिका फिक्सेटिव और पीईएम बफर तैयार करने के लिए रसायनों और उनके संबंधित सांद्रता को सूचीबद्ध करती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
संस्कृति मस्तिष्क स्पष्टीकरण के लिए यहां वर्णित विधि को अधिकांश प्रयोगशाला वातावरण में किया जा सकता है। आवश्यक उपकरण, साथ ही साथ प्रक्रिया और डेटा संग्रह, सरल और सरल हैं। इस विधि के साथ, कोई भी विभिन्न प्रकार की परिकल्पनाओं का परीक्षण कर सकता है, जिसमें सेल सिग्नलिंग कैस्केड और बाहरी कारक शामिल हैं जो एनबी पुनर्सक्रियन और प्रसार को विनियमित करते हैं। यहां, जंगली-प्रकार के ओरेगोनआर जानवरों का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि बहिर्जात इंसुलिन अन्य पशु-विशिष्ट प्रणालीगत संकेतों से स्वतंत्र क्विसेंस से एनबीए को फिर से सक्रिय करने के लिए पर्याप्त था। GAL4 / UAS प्रणाली का उपयोग करते हुए, कोई भी एनबी पुनर्सक्रियन में PI3-kinase सिग्नलिंग की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए सेल प्रकार-विशिष्ट तरीके से इंसुलिन मार्ग घटकों को नॉकडाउन या ओवरएक्सप्रेस कर सकता है। आनुवांशिकी का उपयोग करने के अलावा, मीडिया में घटकों को भी बाहरी संकेतों या संकेतों का परीक्षण करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है जो एनबी पुनर्सक्रियन और प्रसार को बढ़ावा देते हैं। उदाहरण के लिए, कोई भी इस परिकल्पना का परीक्षण कर सकता है कि स्टेरॉयड हार्मोन ecdysone के अलावा एनबी पुनर्सक्रियन और संस्कृति में प्रसार के प्रतिशत में वृद्धि होगी।
यद्यपि यह विधि सीधी है, हमने शुरुआती दिनों में कई तकनीकी कठिनाइयों का अनुभव किया। पहली तकनीकी कठिनाई मीडिया परिवर्तनों के दौरान विच्छेदित, अनिर्धारित दिमाग को नुकसान पहुंचाना था। हमने पाया कि अच्छी तरह से मीडिया को बदलने के बजाय संस्कृति पकवान के एक नए कुएं में दिमाग को स्थानांतरित करने के परिणामस्वरूप कम ऊतक क्षति हुई क्योंकि मस्तिष्क में छेद तब उत्पन्न हुए जब मीडिया को कुएं से हटा दिया गया था और स्पष्टीकरण कुएं के नीचे फंस गए थे। इस समस्या को हल करने के लिए, मस्तिष्क को एक पिपेट का उपयोग करके समाधान में स्थानांतरित किया गया था और इसलिए, लगातार जलमग्न रहा। एक और तकनीकी पहलू जिसे बदल दिया गया था, वह विच्छेदन उपकरणों की नसबंदी थी। एक मुखौटा और दस्ताने हर समय पहने जाते थे। इथेनॉल (70%) का उपयोग विच्छेदन उपकरण और विच्छेदन ट्रे को स्प्रे करने के लिए किया गया था। इसने बैक्टीरिया के भार को कम से कम रखने की अनुमति दी। निर्धारण से पहले के चरणों को यथासंभव बाँझ वातावरण में किया जाना चाहिए, अधिमानतः एक बाँझ हुड, और सटीक और बेहद कोमल आंदोलनों के साथ। आखिरी कठिनाई जो हमने सामना की वह यह थी कि दिमाग चिपचिपा था। अक्सर दिमाग पिपेट टिप की आंतरिक दीवारों का पालन करेगा जब हमने उन्हें इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखने का प्रयास किया। इस समस्या को ठीक करने के लिए, हमने माइक्रोवेल मिनी ट्रे के बीच मस्तिष्क को माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरित करने की विधि को संशोधित किया, जैसा कि ऊपर वर्णित है, मस्तिष्क को पिपेट टिप में एस्पिरेट करने से पहले बढ़ते मीडिया के साथ पिपेट टिप को भरना। इस विधि ने ग्लिसरॉल-आधारित बढ़ते मीडिया के साथ पिपेट टिप को चिकना कर दिया और चिपकने को बहुत कम कर दिया।
ड्रोसोफिला मस्तिष्क स्पष्टीकरण को संस्कृति करने के तरीके पहले12,19,20,21,22 प्रकाशित किए गए हैं। पृथ्वीराज एट अल द्वारा प्रकाशित एक विधि देर से लार्वा और प्रारंभिक प्यूपल दिमाग की खेती की रिपोर्ट करती है। इस मामले में, स्टेरॉयड हार्मोन ecdysone संस्कृति मीडिया में जोड़ा गया था और मस्तिष्क 10 ज20 तक के लिए संस्कृति में बनाए रखा गया था। Bobstock et al. देर से L1 / शुरुआती L2 जानवरों और वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड में कई घंटों के लिए लाइव इमेजिंग NBs से मस्तिष्क की खेती की रिपोर्ट। वे युवा लार्वा21 से दिमाग को संभालने में कठिनाई की भी रिपोर्ट करते हैं। Siller एट अल लार्वा दिमाग culturing और लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग करने के लिए मध्य से देर से लार्वा चरणों में न्यूरोब्लास्ट डिवीजनों के दौरान स्पिंडल गतिशीलता परख का उपयोग कररिपोर्ट 19. पहले प्रकाशित सभी तरीके एक अपवाद के साथ, पशु आहार से पहले ताजा हैच किए गए लार्वा चरण के बाद समय बिंदुओं पर ध्यान केंद्रित करते हैं। Britton et al. में, यह बताया गया है कि NBs quiescence से फिर से सक्रिय हो जाते हैं जब मस्तिष्क स्पष्टीकरण वसा शरीर12 के साथ सह-सुसंस्कृत होते हैं। हैरानी की बात है, ब्रिटन एट अल यह भी रिपोर्ट करते हैं कि बहिर्जात इंसुलिन क्विसेंट एनबीए को फिर से सक्रिय करने के लिए पर्याप्त नहीं था, जो यहां बताया गया है। इसलिए, इस विचार के लिए नींव रखना कि एनबी पुनर्सक्रियन के लिए एफबीडीएस की आवश्यकता है। ब्रिटन पेपर के समय, एनबी विशिष्ट आणविक मार्कर अभी तक उपलब्ध नहीं थे और यह स्पष्ट है कि संस्कृति में 3 दिनों के बाद मस्तिष्क आकृति विज्ञान से समझौता किया जाता है। यहां, हम केवल संस्कृति मीडिया में बहिर्जात इंसुलिन जोड़कर मस्तिष्क स्पष्टीकरण में एनबीएस को फिर से सक्रिय करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करते हैं। सावधानी का एक महत्वपूर्ण नोट यह है कि संस्कृति में जोड़े गए इंसुलिन की मात्रा शारीरिक स्थितियों से कहीं अधिक है। इंसुलिन के उच्च स्तर से विवो स्थितियों की तुलना में विट्रो में मस्तिष्क सेल प्रकारों में पीआई 3-किनेज पाथवे गतिविधि के उच्च स्तर हो सकते हैं।
क्योंकि संस्कृति मीडिया को विभिन्न कारकों को जोड़कर आसानी से हेरफेर किया जा सकता है, इस तकनीक का उपयोग बाहरी सिग्नलिंग और एनबी क्विसेंस, प्रवेश और निकास के बारे में भविष्य की परिकल्पनाओं को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए भी किया जा सकता है, या तो आरएनएआई या दवा-आधारित। बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए, ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग करना सबसे अच्छा होगा जो फ्लोरोसेंट पत्रकारों को व्यक्त करते हैं। यह एंटीबॉडी स्टेनिंग को बाईपास करने की अनुमति दे सकता है, जो समय-गहन है। सामान्य तौर पर, अभ्यास के बाद, कोई भी 30 मिनट में प्रत्येक 3 दिमाग की 10 संस्कृतियों को स्थापित कर सकता है। एक सप्ताह में, 150 अलग-अलग स्थितियों को स्क्रीन करना उचित हो सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।
Acknowledgments
हम वित्तपोषण (CNK) के साथ-साथ NIH / NIGMS (R01-GM120421 और R35-GM141886) के लिए डॉक्टरेट कार्यक्रम के लिए LSAMP ब्रिज को स्वीकार करते हैं। हम चित्रा 1 के लिए डॉ कॉनर Sipe के आभारी हैं। हम सभी Siegrist प्रयोगशाला के सदस्यों को उनके निरंतर समर्थन और मेंटरशिप के लिए भी धन्यवाद देते हैं। हम विशेष रूप से पांडुलिपि के सावधानीपूर्वक पढ़ने और टिप्पणियां प्रदान करने के लिए छवी सूद और गैरी टीटर्स को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
References
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376 (2015).
- Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
- Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
- Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
- Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
- Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
- Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343 (2017).
- Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413 (2018).
- Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721 (2020).
- Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
- Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270 (2012).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
- Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).
