Органоиды, полученные от пациентов (PDO), являются мощным инструментом в трансляционных исследованиях рака, отражая как генетическую, так и фенотипическую гетерогенность заболевания и реакцию на персонализированную противораковую терапию. Здесь подробно описан консолидированный протокол для генерации первичных PDO рака мочевого пузыря человека в рамках подготовки к оценке фенотипических анализов и ответов на лекарства.
Современные платформы терапевтического тестирования in vitro не имеют отношения к патофизиологии опухолей, обычно используя линии раковых клеток, установленные как двумерные (2D) культуры на пластике тканевых культур. Существует острая потребность в более репрезентативных моделях сложности опухоли, которые могут точно предсказать терапевтический ответ и чувствительность. Разработка трехмерной (3D) культуры ex vivo органоидов пациента (PDO), полученных из свежих опухолевых тканей, направлена на устранение этих недостатков. Органоидные культуры могут использоваться в качестве суррогатов опухолей параллельно с рутинным клиническим лечением для информирования о терапевтических решениях путем выявления потенциальных эффективных вмешательств и указания методов лечения, которые могут быть бесполезными. Здесь эта процедура направлена на описание стратегий и подробного пошагового протокола для установления PDO рака мочевого пузыря из свежей, жизнеспособной клинической ткани. Наши устоявшиеся, оптимизированные протоколы практичны для создания 3D-культур для экспериментов с использованием ограниченного и разнообразного исходного материала непосредственно от пациентов или опухолевого материала ксенотрансплантата (PDX). Эта процедура также может быть использована большинством лабораторий, оснащенных стандартным оборудованием для посева тканей. Органоиды, полученные с использованием этого протокола, могут быть использованы в качестве суррогатов ex vivo для понимания как молекулярных механизмов, лежащих в основе урологической патологии рака, так и для оценки методов лечения для информирования клинического руководства.
Рак мочевого пузыря является наиболее распространенным раком мочевыводящих путей и десятым наиболее распространенным злокачественным новообразованием человека во всем мире1. Он охватывает генетически разнообразный и фенотипически сложный спектр заболевания2. Уротелиальные немышечно-инвазивные формы рака мочевого пузыря (NMIBC) являются наиболее распространенными диагнозами рака мочевого пузыря (70%-80%), и эти виды рака демонстрируют значительную биологическую гетерогенность и переменные клинические исходы 2,3,4. Пациенты с NMIBC обычно испытывают высокий риск рецидива заболевания (50-70%), и одна треть раковых заболеваний прогрессирует и развивается в значительно более агрессивный мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря (MIBC)2. Хотя 5-летняя выживаемость для NMIBC высока (>90%), эти пациенты должны проходить долгосрочное клиническое лечение5. С другой стороны, локально развитая (неоперабельная) или метастатическая MIBC обычно считается неизлечимой6. Следовательно, рак мочевого пузыря имеет одну из самых высоких затрат на пожизненное лечение в рамках лечения рака и является значительным бременем как для человека, так и для системы здравоохранения 3,7. Лежащие в основе генетические аберрации при прогрессирующем заболевании делают терапевтическое лечение рака мочевого пузыря клинической проблемой, а терапевтические варианты инвазивных уротелиальных опухолей только недавно улучшились с момента одобрения иммунотерапии как для прогрессирующего, так и для высокого риска NMIBC 8,9. В настоящее время принятие клинических решений руководствуется традиционными клиническими и гистопатологическими особенностями, несмотря на то, что отдельные опухоли рака мочевого пузыря демонстрируют большие различия в агрессивности заболевания и реакции на терапию10. Существует острая необходимость в ускорении исследований клинически полезных моделей для улучшения прогнозирования индивидуального прогноза пациента и определения эффективных методов лечения.
Трехмерные (3D) органоиды демонстрируют большой потенциал в качестве опухолевых моделей из-за их способности самоорганизовываться и рекапитулировать внутреннюю архитектуру in vivo и фармакогеномный профиль исходной опухоли, а также их способность отражать нативную клеточную функциональность исходной ткани, из которой они были получены 11,12,13 . Хотя установленные клеточные линии рака мочевого пузыря легко доступны, относительно экономичны, масштабируемы и просты в манипулировании, клеточные линии in vitro в значительной степени не могут имитировать спектр разнообразных генетических и эпигенетических изменений, наблюдаемых при клиническом раке мочевого пузыря12,14, и все они были установлены и поддерживались в условиях 2D, адгезивной культуры. Кроме того, клеточные линии, полученные из первичных и метастатических опухолей мочевого пузыря, имеют значительное генетическое расхождение с исходным опухолевым материалом. 8,15.
Альтернативным подходом является использование генетически модифицированных и канцерогенных моделей мышей. Однако, хотя эти модели повторяют некоторые из естественных онкогенных каскадов, участвующих в неоплазии человека (рассмотренных в ссылках 16,17,18), они не имеют гетерогенности опухоли, являются дорогостоящими, плохо представляют собой инвазивный и метастатический рак мочевого пузыря и не жизнеспособны для быстрого тестирования на наркотики, поскольку опухоли могут занять много месяцев для развития14,19 . Модели рака, полученные от пациентов (включая органоиды, условно перепрограммированные первичные клеточные культуры и ксенотрансплантаты), предоставляют бесценные возможности для понимания эффектов медикаментозного лечения до клинического лечения20. Несмотря на это, немногие группы обычно используют эти проксимальные модели пациента из-за ограниченного доступа к свежей первичной ткани пациента и обширной оптимизации, необходимой для воспроизводимого создания условий культуры органоидов пациента (PDO). В условиях in vivo онкогенные клетки могут взаимодействовать и взаимодействовать с различными композициями окружающих компонентов, включая стромальные клетки, ткани, инфильтрирующие иммунные клетки, и матрицу12. Аналогичным образом, для PDO, выращенных в 3D-формате, сложность сотовой / матричной может быть настроена для включения других соответствующих компонентов. PDO могут быть быстро сгенерированы и часто могут быть широко пройдены или криоконсервированы для последующего использования, несмотря на то, что имеют конечную продолжительность жизни 21,22,23. Фармакодинамика (т.е. реакция на лекарственное средство) может быть оценена с использованием множественных показаний, включая жизнеспособность и морфологию органоидов, а также характеристику мишеней иммуногистохимии или транскрипционных изменений.
Здесь описаны процедуры установления органоидов рака мочевого пузыря из материала пациента, собранного из трансуретральной резекции опухоли мочевого пузыря (TURBT) или хирургического удаления мочевого пузыря (радикальная цистэктомия). Метод создания PDO проиллюстрирован с использованием легкодоступных влажных лабораторных материалов и инструментов. Конечные точки включают изменения в морфологических характеристиках и жизнеспособности клеток. Они были измерены с использованием флуоресцентной микроскопии, анализов жизнеспособности in vitro (метаболической и целостности клеточных мембран) и гистопатологического анализа. На рисунке 1 показан рабочий процесс установления PDO рака мочевого пузыря человека из клинического материала, полученного во время плановой хирургии.
В то время как 3D-органоидные протоколы, полученные из ткани рака мочевого пузыря, все еще находятся в зачаточном состоянии, они являются областью активных исследований и клинических исследований. Здесь подробно описан оптимизированный протокол для успешного установления PDO рака мочев…
The authors have nothing to disclose.
Мы выражаем признательность за техническую помощь Института трансляционных исследований гистологии и Фонда биологических ресурсов. Это исследование было поддержано финансированием из премии Исследовательского фонда принцессы Александры (I.V., E.D.W.) и Программы быстрого перевода прикладных исследований Фонда медицинских исследований будущего (MRFF) (Центр персонализированного анализа рака (CPAC; Е.Д.В., И.В.). Институт трансляционных исследований получает поддержку от правительства Австралии.
1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
37°C incubator | |||
37°C water bath | |||
50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
70% (w/w) ethanol | |||
-80°C freezer | |||
96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
Computer system | |||
CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
Dry and wet ice | |||
Esky | |||
Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
Liquid nitrogen | |||
Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
Scale | |||
Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
Urine specimen jar | |||
Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |