Summary
В этом протоколе квантовые точки, конъюгированные с рекомбинантным всплеском SARS-CoV-2, позволяют клеточным анализам контролировать связывание шипов с hACE2 на плазматической мембране и последующий эндоцитоз связанных белков в цитоплазму.
Abstract
Разработка новых технологий клеточной флуоресцентной микроскопии облегчила высокопроизводительные методы скрининга для открытия лекарств. Квантовые точки представляют собой флуоресцентные наночастицы с отличными фотофизическими свойствами, проникнутыми яркой и стабильной фотолюминесценцией, а также узкими эмиссионными полосами. Квантовые точки имеют сферическую форму и при правильной модификации химического состава поверхности могут использоваться для сопряжения биомолекул для клеточных применений. Эти оптические свойства в сочетании со способностью функционализировать их с биомолекулами делают их отличным инструментом для исследования рецептор-лигандных взаимодействий и клеточного трафика. Здесь мы представляем метод, который использует квантовые точки для отслеживания связывания и эндоцитоза спайкового белка SARS-CoV-2. Этот протокол может быть использован в качестве руководства для экспериментаторов, желающих использовать квантовые точки для изучения белково-белковых взаимодействий и торговли в контексте клеточной физиологии.
Introduction
Флуоресцентная микроскопия позволяет исследователям заглянуть во внутреннюю работу клетки, используя специализированные красители1, генетически закодированные флуоресцентные белки2 и флуоресцентные наночастицы в виде квантовых точек (QD)3. Для глобальной пандемии коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2019 года (SARS-CoV-2) исследователи использовали флуоресцентную микроскопию, чтобы понять, как вирус взаимодействует с клеткой как на плазматической мембране, так и в цитоплазме. Например, исследователи смогли получить представление о связывании белка SARS-CoV-2 Spike на поверхности вириона с человеческим ангиотензинпревращающим ферментом 2 (hACE2) на поверхности клеток человека, последующей интернализацией через слияние на плазматической мембране и эндоцитозом белкового комплекса Spike: hACE24,5. Также было получено большое понимание выхода SARS-CoV-2 из клеток через лизосому с использованием клеточной флуоресцентной визуализации, уникальной особенности коронавирусов, которые, как ранее считалось, происходят через традиционное пузырьковое почкование из Гольджи, как и со многими другими вирусами6. Являясь основой почти всех аспектов биологических исследований, метод клеточной флуоресцентной микроскопии обязательно продвинулся в своей широте и области применения от визуализации со сверхвысоким разрешением целых животных до автоматизированной многопараметрической визуализации с высоким содержанием для скрининга лекарств. Здесь автоматизированная конфокальная микроскопия с высоким содержанием применяется для исследования проникновения в клетки SARS-CoV-2 с использованием флуоресцентных QD, конъюгированных с вирусным спайковым белком.
Анализ изображений с высоким содержанием, генерируемых платформами биологической визуализации, позволяет получить большую ценную биологическую информацию, чем отдельные параметры, такие как интенсивность всей скважины, которые можно было бы получить с помощью мультимодального считывателя пластин7. Разделяя объекты в поле зрения с помощью автоматизированных алгоритмов сегментации, каждый объект или совокупность объектов могут быть проанализированы по таким параметрам, как интенсивность, площадь и текстура в каждом доступном флуоресцентном канале8. Объединение многих измерений в многомерные наборы данных является полезным подходом для фенотипического профилирования. Когда желаемый фенотип известен, например, интернализация QD в форме пункты, можно использовать измерения, связанные с пунктой, такие как размер, количество и интенсивность, для оценки эффективности лечения.
Облачное программное обеспечение для анализа изображений с высоким содержанием может вместить большое разнообразие выходных данных приборов, включая платформу обработки изображений с высоким содержанием. Используя облачный сервер для хранения изображений и онлайн-анализа, пользователь может загружать свои данные либо с инструмента обработки изображений, либо с сетевого диска, на котором хранятся данные. Аналитическая часть протокола проводится в облачной программной среде, и данные могут быть экспортированы в различные форматы файлов для последующей визуализации данных.
Вирус SARS-CoV-2 состоит из неструктурных и структурных белков, которые помогают в его сборке и репликации. Спайк SARS-CoV-2 имеет два домена, называемых S1 и S2, причем S1 содержит рецептор-связывающий домен, ответственный за взаимодействия hACE2 в плазматической мембране9. Также было обнаружено, что Спайк взаимодействует с другими молекулами плазматической мембраны, которые могут действовать как корецепторы в дополнение к hACE210,11. По всей последовательности спайкового белка и особенно на границе раздела S1/S2 существуют участки расщепления протеазы, которые позволяют сращиваться на мембране после трансмембранной сериновой протеазы 2 (TMPRSS2)12. Различные рекомбинантные белки SARS-CoV-2 Spike были получены из отдельных рецепторсвязывающих доменов до S1, S2, S1 с S2 и целых тримеров шипов от нескольких коммерческих поставщиков для использования в исследовательской деятельности13.
В этой работе поверхность QD была функционализирована рекомбинантными шиповыми тримерами, которые содержат гистидиновую метку (QD-Spike). QD, производимые Отделом оптических наноматериалов Военно-морской исследовательской лаборатории, содержат ядро селенида кадмия и оболочку сульфида цинка14,15. Цинк на поверхности QD координирует остатки гистидина в рекомбинантном белке, образуя функционализированный QD, который по форме и функции напоминает вирусную частицу SARS-CoV-2. Генерация наночастиц и конъюгация белка были ранее описаны с использованием QD-конъюгированного рецепторсвязывающего домена15. Этот метод описывает препараты клеточной культуры, лечение QD, сбор изображений и протокол анализа данных, которые могут направлять исследователя в изучении активности SARS-CoV-2 Spike в физиологическом контексте клетки человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Клеточная линия HEK293T, используемая в этом исследовании, является увековеченной клеточной линией. В этом исследовании не использовались ни люди, ни животные.
1. Культивирование и посев клеток
- Внутри кабинета стерильной биобезопасности, в средствах индивидуальной защиты (включая лабораторные перчатки, лабораторный халат и защитные очки), подготовьте питательную среду для клеток, дополнив модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM) 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1% пенициллином / стрептомицином (P / S) и 250 мкг / мл G418.
- Для 500 мл среды добавьте 443,75 мл DMEM, 50 мл FBS, 5 мл P/S и 1,25 мл G418.
- Фильтруйте через колбу фильтра 0,2 мкм и сохраняйте стерильность, чтобы избежать бактериального загрязнения.
- Внутри шкафа стерильной биобезопасности засейте внутренние 60 лунок черной, с прозрачным дном, поли-D-лизиновой покрытой 96-луночной пластиной с 20 000 клеток в 100 мкл на лунку клеточной культуральной среды. Заполните наружные 36 скважин 100 мкл на скважину фосфатно-буферного соляного раствора (PBS).
- Чтобы подсчитать клетки, добавьте 2 мкл акридина оранжевого и йодидного пятна пропидия к 18 мкл клеточной суспензии.
- Загрузите 10 мкл этого раствора в одну сторону слайда подсчета клеток.
- Повторите шаги 1.2.1. и 1.2.2. , чтобы загрузить обе стороны слайда.
- Поместите слайд в автоматический счетчик ячеек.
- Выберите протокол подсчета флуоресценций и нажмите «Счетчик». Подсчитайте обе стороны слайда и вычислите среднее значение двух плотностей живых клеток.
- Чтобы рассчитать необходимый объем клеточной суспензии, разделите общее количество необходимых клеток на среднюю плотность клеток.
- Осмотрите скважины после посева под световым микроскопом, чтобы убедиться, что была достигнута надлежащая плотность и распределение.
- Инкубировать пластину на ночь в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.
2. Лечение клеток QD-Spike
- Получают 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) путем разведения в средах визуализации.
- Для 10 мл носителей изображений добавьте 130 мкл 7,5% BSA и перемешайте.
- В 12-скважинном коллекторе или пробирной пластине разбавьте запас QD-Spike (SARS-CoV-2, Isolate США-WA1/2020) до 20 нМ, используя 0,1% BSA в средах визуализации.
- Для 1 лунки QD-Spike добавьте 2,27 мкл 440 нМ QD-Spike к 47,73 мкл 0,1% среды визуализации BSA для конечной концентрации 20 нМ.
- Для получения шеститочечного последовательного разбавления 1:3 (в трех экземплярах) добавьте 14,26 мкл QD-Spike к 285,74 мкл 0,1% среды визуализации BSA, чтобы получить самую высокую концентрацию 20 нМ. Добавьте 100 мкл 20 нМ QD-Spike к 200 мкл 0,1% среды BSA, чтобы сделать второе разбавление 6,67 нМ QD-Spike. Повторите четыре раза, чтобы создать шесть точек концентрации.
- Используя многоканальный аспиратор, удалите все отработанные носители из каждой скважины. Используя многоканальную пипетку, вымойте один раз носителем для обработки изображений (100 мкл/лунка).
- Аспирировать 100 мкл среды визуализации и добавить обратно 50 мкл/лунку раствора QD-Spike.
- Инкубируют пластину в течение 3 ч в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5% CO2. Перейдите к шагу 4.
3. Фиксация и окрашивание ядер
- Внутри стерильного шкафа биобезопасности, в средствах индивидуальной защиты (включая лабораторные перчатки, лабораторное пальто и защитные очки), приготовьте 4% параформальдегида (PFA) в 0,1% носителей изображений BSA.
- Аспирировать 50 мкл QD-Spike из каждой скважины и добавить 100 мкл/лунку 4% PFA.
- Не дайте лункам высохнуть. Используйте автоматизированную многоканальную пипетку, чтобы избежать сушки скважин (рекомендуется).
- Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Промыть три раза 1x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS).
- Приготовьте темно-красный ядерный краситель, разбавляя раствор запаса 5 мМ до разбавления 1:1000 в PBS.
- Аспирировать PBS и добавить обратно 50 мкл/ лунку разреженного ядерного красителя.
- Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Трижды вымойте PBS.
- Визуализируйте пластину или уплотнение с помощью пластинчатого герметика для последующего получения изображения. Храните пластину при температуре 4 °C. Флуоресценция должна быть стабильной в течение нескольких недель и более.
4. Настройка сбора и визуализация
- Запустите программное обеспечение для платформы обработки изображений. Включите платформу обработки изображений с высоким содержанием, и индикатор в строке состояния должен быть включен. Если устройство не подключено, программное обеспечение перейдет в автономный режим анализа.
- Войдите на платформу обработки изображений.
- Создайте новый протокол сбора данных.
- Выберите Тип пластины в качестве 96-луночной прозрачной нижней визуализирующей пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор пластины в приборе может варьироваться и может быть настроен путем загрузки правильных определений пластин, которые включают размеры пластин, такие как высота, ширина и другие расстояния для определения расстояния между скважинами и фокусных точек. - Выберите оптический режим как конфокальный и увеличение как 40-кратное погружение в воду.
- Выберите Биннинг как 1.
- Выберите каналы и длины волн флуоресцентного возбуждения/излучения, как описано в шагах 4.3.5-4.3.8. Сделайте снимок, когда выбраны параметры, чтобы просмотреть изображение и убедиться, что настройки соответствуют.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цифровой фазовый контраст (DPC) позволит визуализировать живые клетки без клеточного пятна или флуоресцентного красителя. Не рекомендуется для фиксированных клеток. - Выберите режим для ЦОД, например Высокая контрастность, чтобы создать четко определенные тела клеток. Сделайте снимок, чтобы убедиться, что этот параметр подходит, как показано в окне изображения.
- Выберите канал FITC для использования с клеточной линией ACE2-GFP, которая позволяет визуализировать трафик ACE2 внутри ячейки.
- Чтобы создать пользовательский канал для канала QD, выберите выпадающее меню треугольника для канала и выберите возбуждение в диапазоне 405 нм и излучение в диапазоне 608 нм.
- Если клетки были зафиксированы и использовался темно-красный ядерный краситель, выберите дальний красный канал с излучением более 630 нм, чтобы дополнительно очертить тело клетки и действовать как клеточная маска.
- Выберите скважину с сильным цитоплазматическим сигналом QD, чтобы установить время экспозиции, мощность лазера и положение Z-высоты. Выполните действия, описанные в разделах 4.3.10-4.3.13.
- Проверьте, создает ли высота по умолчанию изображение, в котором ячейки находятся в нужной фокальной плоскости. Если эндоцитозированная пункта является органеллой-мишенью, Z-положение будет ниже, чем если бы плазматическая мембрана была органеллой-мишенью.
- Выберите время экспозиции, при котором получается яркое изображение с уровнями серого, по крайней мере, в три раза превышающими фоновый сигнал. Обычно это от 100 до 300 мс. При 20 нМ уровень серого должен составлять примерно 6000 а.е. при времени экспозиции 200 мс и мощности лазера 80%.
- Проверьте уровни серого, щелкнув правой кнопкой мыши изображение, созданное с помощью функции «Снимок» в каждом канале, и выбрав «Показать интенсивность». Затем щелкните левой кнопкой мыши интересующий объект или фон, чтобы просмотреть уровень серого для этого пикселя.
- Отрегулируйте мощность лазера, чтобы точно настроить интенсивность интересующих объектов.
- Выберите Тип пластины в качестве 96-луночной прозрачной нижней визуализирующей пластины.
- Сохраните протокол сбора.
- Переключитесь на Пункт Запустить эксперимент и введите Имя пластины.
- Запустите эксперимент.
5. Анализ данных
- Импортируйте данные в программное обеспечение для обработки изображений.
- После получения всех изображений экспортируйте измерения в программное обеспечение для обработки изображений. Для этого необходимо установить сервер и создать учетную запись. Создайте экран для экспорта данных в программное обеспечение для обработки изображений.
- В программном обеспечении для обработки изображений выберите Анализ изображений , чтобы начать построение протокола анализа.
- Загрузите измерения из эксперимента с изображениями, щелкнув правой кнопкой мыши файл в списке экранов и выбрав Выбрать. Табличка с картой изображенных скважин и связанных с ними полей должна быть видна в левом нижнем углу окна.
- Выберите колодец с яркими цитоплазматическими пятнами QD, чтобы начать сегментацию изображения.
- В стандартном блоке входного изображения выберите Коррекция плоского поля.
- Добавьте следующий стандартный блок в протокол, выбрав Найти ядра.
- Здесь используйте DPC или дальний красный канал в качестве маркера ядер.
- Сначала выберите метод, который точно сегментирует объекты, а затем выполните тонкую настройку сегментации с помощью раскрывающегося меню и настройки ползунков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая сегментация точно определяет область интереса (ROI) для ядра, клетки и пятен. Только пиксели, которые являются положительными для маркера, должны быть захвачены в пределах отдельной рентабельности инвестиций. Фоновый сигнал должен быть исключен. Если фон фиксируется в ROI, чувствительность метода может быть уменьшена, или порог интенсивности может быть увеличен для увеличения жесткости алгоритма сегментации. Это применимо ко всем стандартным блокам Find.
- Затем добавьте строительный блок «Найти цитоплазму» для идентификации цитоплазмы.
- В этом случае используйте канал ACE2-GFP для цитоплазматической сегментации.
- Выберите метод, который лучше всего идентифицирует цитоплазму каждой клетки.
- Затем добавьте стандартный блок «Найти пятна», чтобы определить пунктуту QD-Spike.
- Выберите ядра в качестве популяции ROI.
- Выберите ячейку в качестве области ROI. Это захватывает пункту во всей клетке.
- Выберите метод, который лучше всего идентифицирует QD puncta в каждой ячейке.
- После того, как все объекты на изображении были сегментированы и точно идентифицированы в этой скважине, выберите другие скважины, чтобы обеспечить, чтобы строительные блоки и настройки могли быть в целом применены к другим скважинам и другим условиям.
- Добавьте свойства вычисления интенсивности для всех сегментированных объектов (ядер, цитоплазмы/клеток и пятен).
- Добавьте параметр Рассчитать свойства морфологии для всех сегментированных объектов (ядер, цитоплазмы/клеток и пятен).
- Добавьте свойства вычисления текстуры для всех сегментированных объектов (ядер, цитоплазмы/клеток и пятен).
- Определите результаты, выбрав параметры для каждой популяции, включая ядра и пятна. Количество объектов может быть использовано в качестве косвенной меры жизнеспособности клеток.
6. Экспорт данных
- Нажмите на Пакетный анализ. Дождитесь завершения анализа, прежде чем переходить к следующему шагу (шаг 6.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пакетный анализ позволяет серверу программного обеспечения для анализа изображений загружать протокол анализа, используя выбранные измерения для удаленного анализа данных. - Экспортируйте набор данных на локальный компьютер или сетевой диск.
- Подключите программное обеспечение для анализа изображений к вспомогательному приложению на компьютере, загрузив и открыв файл подключения.
- Выберите тип файла результатов (.txt, .csv, .html или собственный XML).
- Выберите параметры папки файлов в раскрывающемся меню.
7. Анализ данных в электронной таблице
- Откройте экспортированный файл. Если это файл .csv, сохраните его в формате .xls, чтобы разрешить использование сводных таблиц. Если путь к файлу слишком длинный, сохраните файл .xls выше в иерархии папок, чтобы избежать ошибок при сохранении.
- Добавьте в электронную таблицу столбцы, обозначающие условия для каждой скважины. Например, тип клеток, варианты QD-Spike, концентрации QD-Spike, время инкубации и т.д.
- Выберите функцию Сводная таблица и постройте таблицу, используя добавленные условия в виде строк, а измеряемые параметры в виде столбцов. Выберите расчет для каждого параметра, т.е. Среднее, Стандартное отклонение, Медиана, Мин, Макс или Количество.
- Нормализуйте данные для контроля образцов, включая неконъюгированные QD как 0% и самую высокую концентрацию QD-Spike как 100%.
ПРИМЕЧАНИЕ: При оценке эффективности ингибиторов, таких как нейтрализующие антитела, нормализуйте данные до клеток, обработанных только средой (100% эффективность) и QD-Spike без ингибитора (эффективность 0%). - Построение данных в графическом программном обеспечении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После лечения QD будут интернализованы, поскольку наночастица будет связываться с ACE2 на плазматической мембране и индуцировать эндоцитоз. Используя ACE2-GFP экспрессирующую клеточную линию, транслокация как QD, так и ACE2 может быть визуализирована с помощью флуоресцентной микроскопии. После интернализации два сигнала QD и ACE2 демонстрируют сильную колокализацию. Из этих изображений можно выполнить сегментацию изображения и последующий анализ для извлечения соответствующих параметров, таких как количество пятен (рисунок 1, рисунок 2B). Рисунок 1А представляет собой монтаж клеток, обработанных различными концентрациями QD-Spike или среды только в качестве контроля. Использовались три канала, в том числе цифровой фазовый контраст, FITC и пользовательский канал QD с возбуждением при 405 нм и излучением при 608 нм. ЦОД предоставляет изображение общей формы ячейки. Изображение ЦОД дает приблизительное представление всей морфологии клетки. Область интересов пересекается с сигналом ЦОД и достаточна для обнаружения интернализованных QD. Канал FITC показывает, как ACE2-GFP меняет локализацию и накапливается в регионах, которые колокализуются с помощью QD-Spike. Поскольку концентрация QD-Spike уменьшается, QD больше не видны, а сигнал ACE2-GFP аналогичен контролю. Канал слияния демонстрирует колокализацию ACE2-GFP с QD-Spike. Эти объекты представляют собой смесь пятен и более крупных скоплений, которые могут быть сегментированы с помощью аналитического программного обеспечения. Тонкая настройка метода программного анализа, используемого для сегментации изображений, может быть использована для сегментации интересующих объектов.
Здесь был проведен эксперимент «концентрация-реакция» с шестью различными концентрациями QD-Spike, начиная с 20 нМ, для определения оптимальных концентраций QD (рисунок 2A). QD могут использоваться до 2,22 нМ и по-прежнему показывают привязку и интернализацию. Тем не менее, рекомендуется использовать концентрации 20 нМ или выше для обеспечения надежного ответа.
Во время конъюгации с QD может произойти агрегация белка. Основная проблема с агрегатами заключается в том, что они будут накапливаться поверх ячеек и вызывать артефакты на этапе сегментации изображения. Агрегаты не смогут проникать в клетки, а наночастицы в целом уже не будут напоминать вирусную частицу (рисунок 3). Агрегаты могут быть замечены в растворе QD в виде ярких, слипшихся осадков.
Этот анализ также может быть использован для оценки биологических препаратов, таких как нейтрализующие антитела, которые блокируют проникновение вируса. QD инкубировали с нейтрализующими антителами (рисунок 4A), начиная с 30 мкг/мл, в течение 30 мин при комнатной температуре перед добавлением к клеткам. Использовались антитела, поднятые против эталонного штамма Вашингтона, SARS-CoV-2 RBD. Они блокировали связывание, интернализацию и вызывали снижение измеренного количества пятен по сравнению с клетками, обработанными только QD (рисунок 4B).
Рисунок 1: Анализ изображений с высоким содержанием и сегментация клеток ACE2-GFP, обработанных QD608-Spike. Репрезентативные изображения точной сегментации. Во-первых, ядра сегментируются из канала, содержащего ядерный маркер, для создания популяции ROI. Из популяции ROI область ROI, описывающая клетку, сегментируется с использованием канала ACE2-GFP. Наконец, пятна QD608-Spike сегментированы из области ROI cell. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: QD608-Spike связывает hACE2 и эндоцитозируется в клетках hACE2-GFP HEK293T. (A) Монтаж изображений hACE2-GFP (желтый) HEK293T клеток, обработанных несколькими концентрациями QD608-Spike (пурпурный) или только среда. Цифровой фазовый контраст (голубой) использовался для визуализации тела клетки. Шкала: 20 мкм. (B) Анализ высокого содержания QD608-Spike Spot Counts нормализован до 20 нМ QD608-Spike (100%) и контроль (0%). N = тройные скважины. Полосы погрешностей указывают на стандартное отклонение (S.D.). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Агрегированный QD608-Spike не интернализуется в ячейки hACE2-GFP HEK293T. Монтаж изображений клеток hACE2-GFP HEK293T, обработанных 10 нМ QD608-Spike или только средой. Шкала: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Нейтрализующие антитела блокируют эндоцитоз QD608-Spike в клетках hACE2-GFP HEK293T. (A) Монтаж изображений клеток hACE2-GFP (желтый) HEK293T, обработанных QD608-Spike (пурпурный), предварительно инкубированный с уменьшением концентрации нейтрализующих антител, с использованием цифрового фазового контраста (голубой) для идентификации клеточных тел. Шкала: 20 мкм. (B) Анализ высокого содержания QD608-Spike Spot Counts нормализован до контроля только мультимедиа (100%) и 10 нМ QD608-Spike (только 0%). N = тройные скважины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный в этой статье, обеспечивает необходимые шаги для визуализации функционализированных QD в клетках человека с использованием высокопроизводительной конфокальной микроскопии. Этот метод лучше всего подходит для клеток, где эндоцитоз является основным путем проникновения вируса, а не активность TMPRSS2 и слияния мембран, поскольку он позволяет изучать СПАЙК SARS-CoV-2 и эндоцитоз hACE2. Из-за характера модели QD и C-терминала His-tag на коммерчески доступном тримере Spike, любое расщепление доменов Spike S1 и S2 TMPRSS2 оставит QD прикрепленным только к домену S212. Это может препятствовать интернализации, учитывая, что RBD находится в S1. Поэтому, если последовательность событий на поверхности ячейки была точной, где hACE2 связан, а затем TMPRSS2 расщепляет Спайк, ожидается отрицательный сигнал без интернализации.
Поскольку этот протокол имеет дело с визуализацией клеточных процессов, культивируемые клетки должны быть разрешающими для вирусной инфекции с экспрессией hACE2. hACE2 может быть временно трансфектирован в клетки, или может быть сгенерирована стабильная клеточная линия, экспрессирующая hACE217. Рекомендуется проверять экспрессию и локализацию hACE2 с помощью иммунофлуоресценции с антителами против hACE2, если hACE2 не имеет флуоресцентной белковой метки, такой как GFP, которую можно наблюдать с помощью микроскопии. GFP-меченый hACE2 дает дополнительное преимущество визуализации трафика hACE2 после эндоцитоза QD-Spike. Некоторые клеточные линии с эндогенной экспрессией hACE2 могут быть использованы, но это должно быть подтверждено с помощью иммуноцитохимии. В некоторых случаях эндогенная экспрессия не обеспечивает достаточного количества партнеров связывания hACE2 для QD-Spike и может привести к сигналу, который плохо обнаруживается с помощью высокопроизводительной конфокальной микроскопии.
Одним из важнейших шагов в протоколе является закупка высококачественных QD, сопряженных с рекомбинантным His-помеченным SARS-CoV-2 Spike. Предпосылкой для этого является правильно очищенный белок, который может быть конъюгирован с QDs, не вызывая агрегации. Агрегированные QD будут иметь несколько проблем, которые мешают успешному эксперименту. Поэтому тестирование QD-Spike с использованием инструментов анализа (например, УФ-видимой спектроскопии, просвечивающей электронной микроскопии или динамического рассеяния света) перед полным экспериментированием настоятельно рекомендуется для сохранения ценных ресурсов при тестировании драгоценных реагентов16. Во время маркировки QD со всплеском, определенные концентрации QD и Spike смешиваются для достижения определенного соотношения молекул. Смешиваются только QD и Spike, и оба раствора высоко очищены. Для оценки маркировки QD акриламидный гель может быть отлит и загружен только QD, а также QD-конъюгирован со Spike, что приводит к более тяжелым молекулярно-весовым диапазонам.
QD, используемые в этом протоколе, имеют флуоресцентный спектр возбуждения/излучения, настроенный на излучение 608 нм после УФ-возбуждения (≤405 нм), поскольку большинство QD имеют высокое поглощение вблизи УФ-диапазона, что приводит к высокой фотолюминесценции18. Это нетрадиционная комбинация возбуждения и излучения, которая требует, чтобы микроскоп имел настраиваемые каналы. Многие традиционные конфокальные микроскопы могут быть настроены с правильными фильтрами и лазерными линиями для достижения этого возбуждения / излучения. Альтернативно, возбуждение QD на первом максимуме поглощения, приблизительно на расстоянии от 10 до 20 нм от пика излучения (например, 592 нм для QD608, используемого здесь), также сможет обеспечить достаточную фотолюминесценцию.
Облачное программное обеспечение, используемое в этом протоколе анализа высокого содержания, использует схему именования, основанную на предыдущих шагах. Например, первыми сегментированными объектами являются ядра, которые создают популяцию, называемую ядрами. После этого клетка или цитоплазма могут быть идентифицированы как область ROI в ядрах популяции. Терминология, используемая в программном обеспечении для анализа изображений, задает название популяции объектов, сегментированных с использованием строительного блока ядра, как ядра. Тем не менее, они не обязательно должны быть ядрами и могут быть клеточными телами, если нет ядерного красителя. Эта схема именования также может быть изменена и настроена в каждом выходном имени стандартного блока.
Наш протокол не учитывал мембранные взаимодействия, но это можно было сделать, добавив дополнительное мембранное пятно, которое не зависит от трафика ACE2-GFP. Чтобы блокировать неспецифическое связывание, 0,1% BSA включают в пробирную среду (DMEM + 0,1% BSA), а клетки также выращивают в 10% FBS. Мутантные спайк-белки могли быть использованы, но мы были ограничены коммерчески доступными спайк-белками. В этом случае мутантный не-ACE2 связывающий спайк белок SARS-CoV-2 был недоступен.
Метод наночастиц QD представляет собой мощную технологию для изучения связывания и интернализации вирусов, которые полагаются на опосредованную Spike запись. Этот анализ может быть использован для высокопроизводительного скрининга аналогичным образом, как показано на рисунке 4, для перепрофилирования и идентификации мощных противовирусных препаратов, которые блокируют клеточный вход. Хотя этот протокол продемонстрировал только использование QD, конъюгированных с эталонным штаммом Washington WA-1 SARS-CoV-2, этот анализ может быть легко адаптирован для изучения связывающих свойств вновь возникающих вариантов, таких как альфа, бета, гамма и дельта, путем использования их соответствующих спайковых белков, конъюгированных с QD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержано Программой внутренних исследований Национального центра продвижения трансляционных наук, NIH. Военно-морская исследовательская лаборатория предоставила финансирование через свой внутренний Институт нанонауки. Препарат реагентов поддерживался через базовый фонд NRL COVID-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), New York, N.Y. 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
