Confocale beeldvorming met hoge doorvoer van Quantum Dot-geconjugeerde SARS-CoV-2 Spike Trimers om binding en endocytose in HEK293T-cellen te volgen

Summary

In dit protocol stellen quantum dots geconjugeerd aan recombinant SARS-CoV-2 spike celgebaseerde assays in staat om spikebinding aan hACE2 aan het plasmamembraan en daaropvolgende endocytose van de gebonden eiwitten in het cytoplasma te controleren.

Abstract

De ontwikkeling van nieuwe technologieën voor cellulaire fluorescentiemicroscopie heeft screeningmethoden met hoge doorvoer voor het ontdekken van geneesmiddelen vergemakkelijkt. Quantum dots zijn fluorescerende nanodeeltjes met uitstekende fotofysische eigenschappen doordrenkt met heldere en stabiele fotoluminescentie en smalle emissiebanden. Quantum dots zijn bolvormig en kunnen met de juiste modificatie van de oppervlaktechemie worden gebruikt om biomoleculen te conjugeren voor cellulaire toepassingen. Deze optische eigenschappen, gecombineerd met het vermogen om ze te functionaliseren met biomoleculen, maken ze een uitstekend hulpmiddel voor het onderzoeken van receptor-ligandinteracties en cellulaire handel. Hier presenteren we een methode die quantum dots gebruikt om de binding en endocytose van SARS-CoV-2 spike-eiwit te volgen. Dit protocol kan worden gebruikt als een gids voor experimentalisten die quantum dots willen gebruiken om eiwit-eiwitinteracties en mensenhandel te bestuderen in de context van cellulaire fysiologie.

Introduction

Fluorescentiemicroscopie stelt onderzoekers in staat om in de innerlijke werking van de cel te kijken met behulp van gespecialiseerde ^{kleurstoffen1}, genetisch gecodeerde fluorescerende ^eiwitten2 en fluorescerende nanodeeltjes in de vorm van quantum dots (QDs)³. Voor de wereldwijde pandemie van het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus van 2019 (SARS-CoV-2) hebben onderzoekers fluorescentiemicroscopie gebruikt om te begrijpen hoe het virus interageert met de cel, zowel bij het plasmamembraan als in het cytoplasma. Onderzoekers hebben bijvoorbeeld inzicht kunnen krijgen in de binding van het SARS-CoV-2 Spike-eiwit op het oppervlak van het virion aan het menselijke angiotensine-converterende enzym 2 (hACE2) op het oppervlak van menselijke cellen, daaropvolgende internalisatie via fusie aan het plasmamembraan en endocytose van het Spike: hACE2-eiwitcomplex4,5. Er zijn ook geweldige inzichten verkregen in de SARS-CoV-2-uitgang van cellen via het lysosoom met behulp van cellulaire fluorescentiebeeldvorming, een uniek kenmerk van coronavirussen waarvan eerder werd gedacht dat ze optraden via traditionele blaasjes die ontluiken uit de Golgi, zoals het is met veel andere ^virussen6. Een steunpilaar van bijna alle aspecten van biologisch onderzoek, de cellulaire fluorescentiemicroscopietechniek is noodzakelijkerwijs gevorderd in zijn breedte en toepassingsgebied van superresolutie beeldvorming van hele dieren tot geautomatiseerde multi-parametrische beeldvorming met een hoog gehalte voor geneesmiddelenscreening. Hier wordt geautomatiseerde confocale microscopie met een hoog gehalte toegepast op de studie van SARS-CoV-2-celinvoer met behulp van fluorescerende QD's geconjugeerd aan het virale spike-eiwit.

High-content analyse van beelden gegenereerd door biologische beeldvormingsplatforms maakt een grotere extractie van waardevolle biologische inzichten mogelijk dan afzonderlijke parameters zoals de intensiteit van de hele put, die men zou verkrijgen met behulp van een multimodale plaatlezer7. Door de objecten in een gezichtsveld te scheiden met behulp van geautomatiseerde segmentatiealgoritmen, kan elk object of een populatie objecten worden geanalyseerd op parameters zoals intensiteit, oppervlakte en textuur in elk beschikbaar fluorescentiekanaal8. Het combineren van veel metingen in multivariate datasets is een nuttige benadering voor fenotypische profilering. Wanneer het gewenste fenotype bekend is, zoals QD-internalisatie in de vorm van puncta, kan men de metingen met betrekking tot puncta zoals grootte, aantal en intensiteit gebruiken om de werkzaamheid van een behandeling te beoordelen.

Cloudgebaseerde high content imaging-analysesoftware is geschikt voor een grote verscheidenheid aan instrumentgegevensuitvoer, waaronder het high content imaging-platform. Door een cloudgebaseerde server te gebruiken voor beeldopslag en online analyse, kan de gebruiker zijn gegevens uploaden vanaf het beeldvormingsinstrument of vanaf de netwerkschijf waar de gegevens zijn opgeslagen. Het analysegedeelte van het protocol wordt uitgevoerd binnen de cloudsoftwareomgeving en gegevens kunnen in verschillende bestandsindelingen worden geëxporteerd voor downstream-gegevensvisualisatie.

Het SARS-CoV-2-virus bestaat uit niet-structurele en structurele eiwitten die helpen bij de assemblage en replicatie ervan. SARS-CoV-2-piek heeft twee domeinen genaamd S1 en S2, waarbij S1 het receptorbindende domein bevat dat verantwoordelijk is voor hACE2-interacties bij het ^{plasmamembraan9}. Spike blijkt ook te interageren met andere moleculen in het plasmamembraan die naast ^hACE210,11 als co-receptoren kunnen fungeren. Gedurende de spike-eiwitsequentie en met name op de S1/S2-interface zijn er proteasesplitsingsplaatsen die fusie op het membraan mogelijk maken na het transmembraan serineprotease 2 (TMPRSS2)¹². Verschillende recombinante SARS-CoV-2 Spike-eiwitten zijn geproduceerd uit individuele receptorbindende domeinen, tot S1, S2, S1 met S2 en hele spike trimers van meerdere commerciële leveranciers voor gebruik in ^{onderzoeksactiviteiten13}.

In dit werk werd het oppervlak van QD's gefunctionaliseerd met recombinante spike trimers die een histidine tag (QD-Spike) bevatten. De QD's geproduceerd door Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section bevatten een cadmiumselenidekern en een zinksulfideschaal14,15. Het zink op het QD-oppervlak coördineert de histidineresiduen in het recombinante eiwit om een gefunctionaliseerde QD te vormen die qua vorm en functie lijkt op een SARS-CoV-2-virusdeeltje. De generatie van de nanodeeltjes en eiwitconjugatie werd eerder beschreven met behulp van het QD-geconjugeerde ^{receptorbindingsdomein15}. Deze methode beschrijft de celkweekpreparaten, QD-behandeling, beeldacquisitie en data-analyseprotocol dat een onderzoeker kan begeleiden bij het bestuderen van SARS-CoV-2 Spike-activiteit in de fysiologische context van een menselijke cel.

Protocol

De HEK293T-cellijn die in deze studie wordt gebruikt, is een vereeuwigde cellijn. In deze studie werden geen menselijke of dierlijke proefpersonen gebruikt.

1. Cel kweken en zaaien

1. In een steriele bioveiligheidskast, met persoonlijke beschermingsmiddelen (inclusief laboratoriumhandschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril), bereidt u celkweekmedium voor door Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aan te vullen met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptomycine (P / S) en 250 μg / ml G418.
   1. Voeg voor 500 ml media 443,75 ml DMEM, 50 ml FBS, 5 ml P/S en 1,25 ml G418 toe.
   2. Filtreer door een filterkolf van 0,2 μm en behoud de steriliteit om bacteriële besmetting te voorkomen.
2. Zaai in een steriele bioveiligheidskast de binnenste 60 putten van een zwarte, heldere bodem, poly-D-lysine gecoate 96-well plaat met 20.000 cellen in 100 μL per put celkweekmedium. Vul de buitenste 36 putten met 100 μL per put fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
   1. Om de cellen te tellen, voegt u 2 μL acridine orange en propidiumjodidekleuring toe aan 18 μL celsuspensie.
   2. Laad 10 μL van deze oplossing in één kant van een celtelschuif.
   3. Herhaal stap 1.2.1. en 1.2.2. om beide zijden van de dia te laden.
   4. Plaats de schuif in een geautomatiseerde celteller.
   5. Selecteer het protocol voor het tellen van fluorescentie en druk op Tellen. Tel beide zijden van de dia en bereken het gemiddelde van de twee levend-celdichtheden.
   6. Om het benodigde volume celsuspensie te berekenen, deelt u het totale aantal benodigde cellen door de gemiddelde celdichtheid.
3. Inspecteer de putten na het zaaien onder een lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat de juiste dichtheid en verdeling zijn bereikt.
4. Incubeer de plaat een nacht in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% _CO2.

2. Behandeling van cellen met QD-Spike

1. Bereid 0,1% runderserumalbumine (BSA) voor door verdunning in beeldvormende media.
   1. Voeg voor 10 ml beeldmedia 130 μL 7,5% BSA toe en meng.
2. Verdun in een 12-well reservoir of assayplaat de 440 nM QD-Spike (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) voorraad tot 20 nM met behulp van 0,1% BSA in beeldvormingsmedia.
   1. Voeg voor 1 put QD-Spike 2,27 μL van 440 nM QD-Spike toe aan 47,73 μL van 0,1% BSA-beeldvormingsmedia voor een uiteindelijke concentratie van 20 nM.
   2. Om een zespunts 1:3 seriële verdunning (in drievoud) te genereren, voegt u 14,26 μL QD-Spike toe aan 285,74 μL 0,1% BSA-beeldvormingsmedia om de hoogste concentratie van 20 nM te maken. Voeg 100 μL 20 nM QD-Spike toe aan 200 μL 0,1% BSA-media om de tweede verdunning van 6,67 nM QD-Spike te maken. Herhaal vier keer om de zes concentratiepunten te genereren.
3. Gebruik een meerkanaals aspirator om alle gebruikte media uit elke put te verwijderen. Gebruik een meerkanaalspipet en was eenmaal met beeldvormende media (100 μL/put).
4. Zuig 100 μL beeldvormende media op en voeg 50 μL/put QD-Spike-oplossing toe.
5. Incubeer de plaat gedurende 3 uur in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% _CO2. Ga verder met stap 4.

3. Fixatie en kernkleuring

1. In een steriele bioveiligheidskast, met persoonlijke beschermingsmiddelen (inclusief laboratoriumhandschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril), bereidt u 4% paraformaldehyde (PFA) voor in 0,1% BSA-beeldvormingsmedia.
2. Zuig 50 μL QD-Spike uit elke put en voeg 100 μL /put van 4% PFA toe.
   1. Laat de putten niet uitdrogen. Gebruik een geautomatiseerde meerkanaalspipet om droging van de putten te voorkomen (aanbevolen).
3. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
4. Was drie keer met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
5. Bereid de dieprode kernkleurstof door de 5 mM-stamoplossing te verdunnen tot 1:1000 verdunning in PBS.
6. Zuig de PBS uit en voeg 50 μL/put verdunde kernkleurstof toe.
7. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
8. Drie keer wassen met PBS.
9. Stel de plaat of afdichting voor met behulp van een platensealer voor beeldvorming op een later tijdstip. Bewaar de plaat bij 4 °C. Fluorescentie moet enkele weken of langer stabiel zijn.

4. Acquisitie set-up en imaging

1. Start de software voor het imaging platform. Schakel het beeldverwerkingsplatform met hoge inhoud in en het lampje op de statusbalk moet branden. Als het apparaat niet is aangesloten, gaat de software in de offline analysemodus.
2. Log in op het imaging platform.
3. Maak een nieuw acquisitieprotocol.
   1. Selecteer Plaattype als 96-goed heldere bodembeeldplaat.
      OPMERKING: De plaatselectie in het instrument kan variëren en kan worden aangepast door de juiste plaatdefinities te laden die plaatafmetingen zoals hoogte, breedte en andere afstanden omvatten om goed afstand en brandpunten te definiëren.
   2. Selecteer Optische modus als confocaal en vergroting als 40x onderdompeling in water.
   3. Selecteer Binning als 1.
   4. Kies de kanalen en fluorescerende excitatie-/emissiegolflengten zoals beschreven in stap 4.3.5-4.3.8. Maak een momentopname wanneer de instellingen zijn geselecteerd om de afbeelding te bekijken en zorg ervoor dat de instellingen geschikt zijn.
      OPMERKING: Digital Phase Contrast (DPC) maakt visualisatie van levende cellen mogelijk zonder een celvlek of fluorescerende kleurstof. Het wordt niet aanbevolen voor vaste cellen.
   5. Selecteer de modus voor DPC, zoals Hoog contrast, om goed gedefinieerde cellichamen te produceren. Maak een momentopname om te bevestigen dat deze instelling geschikt is, zoals te zien is in het afbeeldingsvenster.
   6. Selecteer het FITC-kanaal voor gebruik met de ACE2-GFP-cellijn waarmee ACE2-handel in de cel kan worden gevisualiseerd.
   7. Als u een aangepast kanaal voor het QD-kanaal wilt maken, selecteert u het vervolgkeuzemenu driehoek voor het kanaal en kiest u de excitatie in het bereik van 405 nm en de emissie in het bereik van 608 nm.
   8. Als cellen werden gefixeerd en een dieprode kernkleurstof werd gebruikt, selecteert u het verrode kanaal met een emissie van meer dan 630 nm om het cellichaam verder af te bakenen en als een celmasker te fungeren.
   9. Selecteer een put met een sterk cytoplasmatisch QD-signaal om de belichtingstijd, het laservermogen en de Z-hoogtepositie in te stellen. Volg de stappen van 4.3.10-4.3.13.
   10. Controleer of de standaardhoogte een afbeelding oplevert waarbij de cellen zich in het gewenste brandpuntsvlak bevinden. Als de endocytosed puncta het doelorganel zijn, zal de Z-positie lager zijn dan wanneer het plasmamembraan het doelorganel is.
   11. Kies een belichtingstijd die een helder beeld oplevert met grijswaarden die minstens drie keer groter zijn dan het achtergrondsignaal. Dit is meestal tussen de 100 en 300 ms. Bij 20 nM moeten de grijswaarden ongeveer 6000 a.u. zijn met een belichtingstijd van 200 ms en een laservermogen van 80%.
   12. Controleer de grijswaarden door met de rechtermuisknop op de afbeelding te klikken die is geproduceerd met de functie Momentopname in elk kanaal en Intensiteit weergeven te selecteren. Klik vervolgens met de linkermuisknop op het object of de achtergrond om het grijsniveau voor die pixel weer te geven.
   13. Pas het laservermogen aan om de intensiteit van de objecten van interesse nauwkeurig af te stellen.
4. Sla het acquisitieprotocol op.
5. Schakel over naar Experiment uitvoeren en voer de naam van de plaat in.
6. Voer het experiment uit.

5. Data-analyse

1. Importeer gegevens in de beeldbewerkingssoftware.
   1. Nadat u alle afbeeldingen hebt verkregen, exporteert u metingen naar de beeldvormingssoftware. Hiervoor moet een server worden opgezet en een account worden aangemaakt. Maak een scherm voor de gegevens die moeten worden geëxporteerd naar de beeldbewerkingssoftware.
2. Selecteer in de beeldbewerkingssoftware Beeldanalyse om te beginnen met het bouwen van het analyseprotocol.
3. Laad de metingen uit het beeldvormingsexperiment door met de rechtermuisknop op het bestand in de lijst met schermen te klikken en op Selecteren te klikken. De plaatkaart van afgebeelde putten en de bijbehorende velden moet zichtbaar zijn in de linkerbenedenhoek van het venster.
4. Kies een put met heldere cytoplasmatische QD-vlekken om te beginnen met beeldsegmentatie.
5. Selecteer in het Building Block Input Image de optie Vlakveldcorrectie.
6. Voeg de volgende bouwsteen toe aan het protocol door Zoek kernen te selecteren.
   1. Gebruik hier de DPC of het verrode kanaal als de nuclei-marker.
   2. Selecteer de methode waarmee de objecten eerst nauwkeurig worden gesegmenteerd en pas vervolgens de segmentatie aan met behulp van het vervolgkeuzemenu en pas de schuifregelaars aan.
      OPMERKING: Goede segmentatie definieert nauwkeurig het interessegebied (ROI) voor de kern, cel en vlekken. Alleen de pixels die positief zijn voor de marker moeten worden vastgelegd binnen een individuele ROI. Achtergrondsignaal moet worden uitgesloten. Als de achtergrond wordt vastgelegd in de ROI, kan de gevoeligheid van de methode worden verlaagd of kan de intensiteitsdrempel worden verhoogd om de strengheid van het segmentatiealgoritme te vergroten. Dit is van toepassing op alle Find-bouwstenen.
7. Voeg vervolgens de Find Cytoplasm Building Block toe om het cytoplasma te identificeren.
   1. Gebruik in dit geval het ACE2-GFP-kanaal voor cytoplasmatische segmentatie.
   2. Selecteer de methode die het cytoplasma van elke cel het beste identificeert.
8. Voeg vervolgens het Building Block Find Spots toe om de QD-Spike puncta te identificeren.
   1. Selecteer de Kernen als de ROI-populatie.
   2. Selecteer de cel als roi-regio. Dit vangt de puncta op in de hele cel.
   3. Selecteer de methode die de QD-puncta in elke cel het beste identificeert.
9. Zodra alle objecten in de afbeelding zijn gesegmenteerd en nauwkeurig zijn geïdentificeerd in deze put, kiest u andere putten om ervoor te zorgen dat de bouwstenen en instellingen over het algemeen kunnen worden toegepast op de andere putten en andere omstandigheden.
10. Voeg de eigenschappen intensiteit berekenen toe voor alle gesegmenteerde objecten (kernen, cytoplasma/cellen en vlekken).
11. Voeg de morfologie-eigenschappen berekenen toe voor alle gesegmenteerde objecten (kernen, cytoplasma/cellen en vlekken).
12. Voeg de textuureigenschappen berekenen toe voor alle gesegmenteerde objecten (kernen, cytoplasma/cellen en vlekken).
13. Definieer de resultaten door de parameters voor elke populatie te selecteren, inclusief kernen en vlekken. Het aantal objecten kan worden gebruikt als een indirecte maat voor de levensvatbaarheid van cellen.

6. Gegevens exporteren

1. Klik op Batchanalyse. Wacht tot de analyse is voltooid voordat u doorgaat naar de volgende stap (stap 6.2).
   OPMERKING: Met de batchanalyse kan de softwareserver voor beeldanalyse het analyseprotocol laden met behulp van de geselecteerde metingen om de gegevens op afstand te analyseren.
2. Exporteer de gegevensset naar een lokale computer of netwerkstation.
   1. Verbind de beeldanalysesoftware met een helpertoepassing op de computer door een verbindingsbestand te downloaden en te openen.
   2. Selecteer het bestandstype van de resultaten (.txt, .csv, .html of Native XML).
   3. Kies de instellingen voor bestandsmappen in het vervolgkeuzemenu.

7. Analyseer de gegevens in een spreadsheet

1. Open het geëxporteerde bestand. Als het een .csv bestand is, slaat u het op als een .xls bestandsindeling om het gebruik van draaitabellen in te schakelen. Als het bestandspad te lang is, slaat u het .xls bestand hoger in de mappenhiërarchie op om fouten bij het opslaan te voorkomen.
2. Voeg kolommen toe aan de spreadsheet die de voorwaarden voor elk putje aangeven. Bijvoorbeeld het celtype, QD-Spike varianten, QD-Spike concentraties, incubatietijd, etc.
3. Kies de functie Draaitabel en bouw de tabel met de toegevoegde voorwaarden als Rijen en de gemeten parameters als Kolommen. Selecteer de berekening voor elke parameter, d.w.z. Gemiddelde, Standaarddeviatie, Mediaan, Min, Max of Aantal.
4. Normaliseer de gegevens om monsters te controleren, inclusief niet-geconjugeerde QD's als 0% en de hoogste concentratie QD-Spike als 100%.
   OPMERKING: Bij het beoordelen van de werkzaamheid van remmers zoals neutraliserende antilichamen, normaliseer de gegevens naar met media behandelde cellen (100% werkzaamheid) en QD-Spike zonder remmer (0% werkzaamheid).
5. Plot de gegevens in grafische software.

Representative Results

Na behandeling zullen de QD's worden geïnternaliseerd omdat het nanodeeltje zich bindt aan ACE2 op het plasmamembraan en endocytose induceert. Met behulp van een ACE2-GFP-expressiecellijn kan de translocatie van zowel QD's als ACE2 worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. Eenmaal geïnternaliseerd, vertonen de twee QD- en ACE2-signalen een sterke colocalisatie. Uit deze beelden kan beeldsegmentatie en daaropvolgende analyse worden uitgevoerd om relevante parameters zoals spot count te extraheren (Figuur 1, Figuur 2B). Figuur 1A is een montage van cellen die zijn behandeld met verschillende concentraties QD-Spike of media alleen als controle. Er werden drie kanalen gebruikt, waaronder digitaal fasecontrast, FITC en het aangepaste QD-kanaal met excitatie bij 405 nm en emissie bij 608 nm. DPC geeft een afbeelding van de algemene celvorm. De DPC-afbeelding geeft een benaderende indicatie van de gehele celmorfologie. Het interessegebied overlapt met het DPC-signaal en is voldoende voor het detecteren van geïnternaliseerde QD's. Het FITC-kanaal toont de ACE2-GFP die de lokalisatie verandert en zich ophoopt in regio's die colocaliseren met QD-Spike. Naarmate de concentratie van QD-Spike afneemt, zijn de QD's niet langer zichtbaar en is het ACE2-GFP-signaal vergelijkbaar met besturing. Het merge kanaal demonstreert de colocalisatie van ACE2-GFP met QD-Spike. Deze objecten zijn een mengsel van vlekken en grotere ophopingen die met de analysesoftware kunnen worden gesegmenteerd. Fine-tuning van de software-analysemethode die wordt gebruikt voor beeldsegmentatie kan worden gebruikt om de objecten van belang te segmenteren.

Hier werd een concentratie-respons experiment met zes verschillende concentraties QD-Spike uitgevoerd, beginnend bij 20 nM, om optimale concentraties QD te bepalen (figuur 2A). QD's kunnen worden gebruikt zo laag als 2,22 nM en vertonen nog steeds binding en internalisatie. Het wordt echter aanbevolen om concentraties van 20 nM of hoger te gebruiken om een robuuste respons te garanderen.

Tijdens conjugatie met de QD kan eiwitaggregatie optreden. Het belangrijkste probleem met aggregaten is dat ze zich bovenop cellen ophopen en artefacten veroorzaken in de beeldsegmentatiestap. Aggregaten zullen geen cellen kunnen binnendringen en de nanodeeltjes als geheel zullen niet langer op een viraal deeltje lijken (figuur 3). Aggregaten kunnen in de QD-oplossing worden gezien als heldere, samengeklonterde neerslag.

Deze test kan ook worden gebruikt om biologische geneesmiddelen te beoordelen, zoals neutraliserende antilichamen die virale toegang blokkeren. QD's werden geïncubeerd met neutraliserende antilichamen (figuur 4A), beginnend bij 30 μg / ml, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voordat ze aan cellen werden toegevoegd. Antilichamen tegen de referentie Washington-stam, SARS-CoV-2 RBD, werden gebruikt. Ze blokkeerden binding, internalisatie en veroorzaakten een vermindering van het gemeten aantal vlekken in vergelijking met cellen die alleen met QD werden behandeld (figuur 4B).

Figuur 1: Beeldanalyse met hoog gehalte en segmentatie van ACE2-GFP-cellen behandeld met _QD608-Spike. Representatieve beelden van nauwkeurige segmentatie. Ten eerste worden kernen gesegmenteerd uit het kanaal met de nucleaire marker om een ROI-populatie te creëren. Uit de ROI-populatie wordt een ROI-regio waarin de cel wordt geschetst, gesegmenteerd met behulp van het ACE2-GFP-kanaal. Ten slotte worden _{QD608-Spike-spots} gesegmenteerd vanuit de Cell ROI-regio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: _QD608-Spike bindt hACE2 en wordt gefinocyteerd in hACE2-GFP HEK293T-cellen. (A) Beeldmontage van hACE2-GFP (geel) HEK293T-cellen behandeld met verschillende concentraties _QD608-Spike (magenta) of alleen media. Digitaal fasecontrast (cyaan) werd gebruikt om het cellichaam te visualiseren. Schaalbalk: 20 μm. (B) Analyse van hoge inhoud van _QD608-Spike Spot Counts genormaliseerd tot 20 nM _QD608-Spike (100%) en de controle (0%). N = drievoudige putten. Foutbalken geven standaarddeviatie (S.D.) aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Geaggregeerde _QD608-Spike is niet geïnternaliseerd in hACE2-GFP HEK293T-cellen. Beeldmontage van hACE2-GFP HEK293T cellen behandeld met 10 nM _QD608-Spike of alleen media. Schaalbalk: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Neutraliserend antilichaam blokkeert endocytose van _QD608-Spike in hACE2-GFP HEK293T-cellen. (A) Beeldmontage van hACE2-GFP (geel) HEK293T-cellen behandeld met _QD608-Spike (magenta) vooraf geïncubeerd met afnemende concentraties neutraliserende antilichamen, met behulp van digitaal fasecontrast (cyaan) om cellichamen te identificeren. Schaalbalk: 20 μm. (B) Analyse met hoog gehalte van QD608-Spike-spottellingen genormaliseerd naar media-only controle (100%) en 10 nM _QD608-Spike alleen (0%). N = drievoudige putten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De methode die in dit artikel wordt beschreven, biedt de nodige stappen voor het in beeld brengen van gefunctionaliseerde QD's in menselijke cellen met behulp van confocale microscopie met hoge doorvoer. Deze methode is het meest geschikt voor cellen waar endocytose de belangrijkste route van virale binnenkomst is in plaats van de activiteit van TMPRSS2 en membraanfusie, omdat het de studie van SARS-CoV-2 Spike en hACE2 endocytose mogelijk maakt. Vanwege de aard van het QD-model en de C-terminal His-tag op de in de handel verkrijgbare Spike-trimer, zou elke TMPRSS2-splitsing van Spike S1- en S2-domeinen de QD alleen aan het S2-domein laten ^hangen12. Dit kan internalisatie voorkomen, aangezien de RBD wordt aangetroffen in S1. Daarom, als de volgorde van gebeurtenissen aan het celoppervlak nauwkeurig zou zijn, waar hACE2 is gebonden en vervolgens TMPRSS2 Spike splitst, wordt een negatief signaal zonder internalisatie verwacht.

Aangezien dit protocol zich bezighoudt met het afbeelden van cellulaire processen, moeten de gekweekte cellen tolerant zijn voor virale infectie met de expressie van hACE2. hACE2 kan tijdelijk worden getransfecteerd in cellen, of er kan een stabiele cellijn worden gegenereerd die hACE2 tot expressie ^brengt17. Het wordt aanbevolen om de hACE2-expressie en -lokalisatie te verifiëren met behulp van immunofluorescentie met antilichamen tegen hACE2, tenzij de hACE2 een fluorescerend eiwitlabel heeft, zoals GFP, dat kan worden waargenomen met behulp van microscopie. GFP-gelabelde hACE2 biedt het extra voordeel van het visualiseren van hACE2-handel na QD-Spike endocytose. Sommige cellijnen met endogene hACE2-expressie kunnen worden gebruikt, maar dit moet worden bevestigd met behulp van immunocytochemie. In sommige gevallen biedt de endogene expressie niet genoeg hACE2-bindingspartners voor QD-Spike en kan dit resulteren in een signaal dat slecht wordt gedetecteerd door confocale microscopie met hoge doorvoer.

Een cruciale stap in het protocol omvat de aanschaf van hoogwaardige QD's geconjugeerd aan de recombinant His-tagged SARS-CoV-2 Spike. De voorwaarde hiervoor is een goed gezuiverd eiwit dat kan worden geconjugeerd aan de QD's zonder aggregatie te veroorzaken. Geaggregeerde QD's hebben verschillende problemen die een succesvol experiment verhinderen. Daarom wordt het testen van QD-Spike met behulp van analysetools (bijv. UV-zichtbare spectroscopie, transmissie-elektronenmicroscopie of dynamische lichtverstrooiing) voorafgaand aan volledige experimenten ten zeerste aanbevolen om waardevolle bronnen te behouden bij het testen van kostbare ^reagentia16. Tijdens het labelen van QD's met spike worden specifieke concentraties QD en Spike gemengd om een specifieke verhouding van moleculen te bereiken. Alleen QD en Spike worden gemengd en beide oplossingen zijn sterk gezuiverd. Om de etikettering van QD's te beoordelen, kan een acrylamidegel worden gegoten en geladen met QD alleen en QD-geconjugeerd naar Spike, wat resulteert in zwaardere moleculaire gewichtsbanden.

De QD's die in dit protocol worden gebruikt, hebben een fluorescentie-excitatie/ emissiespectrum afgestemd op 608 nm emissie na UV-excitatie (≤405 nm), omdat de meeste QD's een hoge absorptie hebben in de buurt van het UV-bereik en hoge fotoluminescentie ^produceren18. Dit is een onconventionele combinatie van excitatie / emissie waarvoor een microscoop nodig is om aanpasbare kanalen te hebben. Veel traditionele confocale microscopen kunnen worden opgezet met de juiste filters en laserlijnen om deze excitatie / emissie te bereiken. Als alternatief zal excitatie van de QD bij het eerste absorptiemaximum, ongeveer 10 tot 20 nm verwijderd van de emissiepiek (bijv. 592 nm voor _QD608 die hier wordt gebruikt), ook in staat zijn om voldoende fotoluminescentie te produceren.

De cloudgebaseerde software die in dit analyseprotocol met hoge inhoud wordt gebruikt, maakt gebruik van een naamgevingsschema dat voortbouwt op eerdere stappen. De eerste objecten die worden gesegmenteerd zijn bijvoorbeeld kernen, die een populatie creëren die Kernen wordt genoemd. Hierna kan de cel of het cytoplasma worden geïdentificeerd als een ROI-regio binnen de populatiekernen. De terminologie die wordt gebruikt in de beeldanalysesoftware stelt de naam van de populatie van objecten gesegmenteerd met behulp van de kernbouwsteen in als Kernen. Ze hoeven echter niet noodzakelijkerwijs kernen te zijn en kunnen cellichamen zijn als er geen nucleaire kleurstof beschikbaar is. Dit naamgevingsschema kan ook worden gewijzigd en aangepast binnen elke uitvoernaam van de bouwsteen.

Ons protocol hield geen rekening met membraaninteracties, maar dit kon worden gedaan door een extra membraanvlek toe te voegen die onafhankelijk is van ACE2-GFP-handel. Om niet-specifieke binding te blokkeren, wordt 0,1% BSA opgenomen in de testmedia (DMEM + 0,1% BSA) en worden de cellen ook gekweekt in 10% FBS. Gemuteerde spike-eiwitten konden worden gebruikt, maar we waren beperkt tot commercieel verkrijgbare spike-eiwitten. In dit geval was er geen SARS-CoV-2 mutant niet-ACE2 bindend Spike-eiwit beschikbaar.

De QD-nanodeeltjesmethode presenteert een krachtige technologie om de binding en internalisatie van virussen te bestuderen die afhankelijk zijn van Spike-gemedieerde invoer. Deze test kan worden gebruikt voor high-throughput screening op een analoge manier, zoals weergegeven in figuur 4, om krachtige antivirale middelen die cellulaire toegang blokkeren opnieuw te gebruiken en te identificeren. Hoewel dit protocol alleen het gebruik van QD's aantoonde die geconjugeerd zijn aan de Washington WA-1-referentiestam van SARS-CoV-2, kan deze test gemakkelijk worden aangepast om de bindende eigenschappen van nieuw opkomende varianten zoals Alpha, Beta, Gamma en Delta te bestuderen door het gebruik van hun respectieve spike-eiwitten geconjugeerd aan QD's.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
32% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714	Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%
7.5% Bovine Serum Albumin	Gibco	15260-037	Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain	Logos Biosystems	F23001	Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike
Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine	Greiner	655946	Used to support cell culture, DMEM supplement
Characterized Fetal Bovine Serum	Cytiva/HyClone	SH30071.03	Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1
Columbus Analyzer	Perkin Elmer	NA	Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye
DRAQ5 (5 mM)	ThermoFisher Scientific	62252	Basal media for HEK293T cell culture
Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red	Gibco	11995-065	Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365
Excel	Microsoft	NA	Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement
G418	InvivoGen	ant-gn-5	Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP
HEK293T hACE2-GFP	Codex Biosolutions	CB-97100-203	Automated cell counter
Luna Automated Cell Counter	Logos Biosystems	NA	Used for fluorescence cell counting
Luna Cell Counting Slides	Logos Biosystems	L12001	High-content imaging platform
Opera Phenix	Perkin Elmer	NA	Imaging media, used for incubating cells with quantum dots
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	11058-021	Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying
PBS -/-	Gibco	10010-023	Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0
Prism	GraphPad	NA	Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)	custom made by Naval Research Laboratory		Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab	Sino Biological	40592-MM57	Used to dissociate cells from flask during passaging
TrypLE Express	Gibco	12605-010