Summary
Bu protokolde, rekombinant SARS-CoV-2 spike'a konjuge edilen kuantum noktaları, hücre bazlı testlerin, plazma zarındaki hACE2'ye ve ardından bağlı proteinlerin sitoplazmaya endositozunu izlemek için hücre bazlı tahlilleri izlemesini sağlar.
Abstract
Hücresel floresan mikroskobu için yeni teknolojilerin geliştirilmesi, ilaç keşfi için yüksek verimli tarama yöntemlerini kolaylaştırmıştır. Kuantum noktaları, parlak ve kararlı fotolüminesansın yanı sıra dar emisyon bantları ile aşılanmış mükemmel fotofiziksel özelliklere sahip floresan nanopartiküllerdir. Kuantum noktaları şekil olarak küreseldir ve yüzey kimyasının uygun modifikasyonu ile hücresel uygulamalar için biyomolekülleri konjuge etmek için kullanılabilir. Bu optik özellikler, onları biyomoleküllerle işlevselleştirme yeteneği ile birleştiğinde, onları reseptör-ligand etkileşimlerini ve hücresel kaçakçılığı araştırmak için mükemmel bir araç haline getirir. Burada, SARS-CoV-2 spike proteininin bağlanmasını ve endositozunu izlemek için kuantum noktaları kullanan bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, protein-protein etkileşimlerini ve hücresel fizyoloji bağlamında kaçakçılığı incelemek için kuantum noktalarını kullanmak isteyen deneyciler için bir rehber olarak kullanılabilir.
Introduction
Floresan mikroskobu, araştırmacıların özel boyalar1, genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri2 ve kuantum noktaları (QD'ler)3 şeklinde floresan nanopartiküller kullanarak hücrenin iç işleyişine bakmalarını sağlar. 2019'un şiddetli akut solunum sendromu koronavirüsü (SARS-CoV-2) küresel pandemisi için araştırmacılar, virüsün hem plazma zarında hem de sitoplazmada hücre ile nasıl etkileşime girdiğini anlamak için floresan mikroskobu kullandılar. Örneğin, araştırmacılar, viryonun yüzeyindeki SARS-CoV-2 Spike proteininin, insan hücrelerinin yüzeyindeki insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2'ye (hACE2) bağlanması, plazma zarında füzyon yoluyla daha sonra içselleştirilmesi ve Spike: hACE2 protein kompleksinin endositozu hakkında bilgi edinebildiler4,5. SARS-CoV-2'nin hücresel floresan görüntüleme kullanılarak lizozom yoluyla hücrelerden çıkışı hakkında da büyük bilgiler edinilmiştir; bu, daha önce diğer birçok virüste olduğu gibi, Golgi'den geleneksel vezikül tomurcuklanması yoluyla meydana geldiği düşünülen koronavirüslerin benzersiz bir özelliğidir6. Biyolojik araştırmanın hemen hemen tüm yönlerinin dayanak noktası olan hücresel floresan mikroskopi tekniği, tüm hayvanların süper çözünürlüklü görüntülemesinden, ilaç taraması için otomatik yüksek içerikli multi-parametrik görüntülemeye kadar uygulamaların genişliğinde ve kapsamında mutlaka ilerlemiştir. Burada, viral spike proteinine konjuge floresan QD'ler kullanılarak SARS-CoV-2 hücre girişinin incelenmesine otomatik yüksek içerikli konfokal mikroskopi uygulanır.
Biyolojik görüntüleme platformları tarafından üretilen görüntülerin yüksek içerikli analizi, değerli biyolojik içgörülerin, çok modlu bir plaka okuyucu kullanılarak elde edilebilecek tam kuyu yoğunluğu gibi tek parametrelerden daha fazla çıkarılmasına olanak tanır7. Otomatik segmentasyon algoritmaları kullanılarak bir görüş alanındaki nesneler ayrılarak, her nesne veya nesne popülasyonu, mevcut her floresan kanalındaki yoğunluk, alan ve doku gibi parametreler için analiz edilebilir8. Birçok ölçümü çok değişkenli veri kümelerinde birleştirmek, fenotipik profil oluşturma için yararlı bir yaklaşımdır. Puntta şeklinde QD içselleştirme gibi istenen fenotip bilindiğinde, bir tedavinin etkinliğini değerlendirmek için boyut, sayı ve yoğunluk gibi puncta ile ilgili ölçümler kullanılabilir.
Bulut tabanlı yüksek içerikli görüntüleme analiz yazılımı, yüksek içerikli görüntüleme platformu da dahil olmak üzere çok çeşitli cihaz veri çıkışlarını barındırabilir. Görüntü depolama ve çevrimiçi analiz için bulut tabanlı bir sunucu kullanarak, kullanıcı verilerini görüntüleme cihazından veya verilerin depolandığı ağ sürücüsünden yükleyebilir. Protokolün analiz kısmı bulut yazılım ortamında gerçekleştirilir ve veriler, aşağı akış veri görselleştirmesi için çeşitli dosya biçimlerinde dışa aktarılabilir.
SARS-CoV-2 virüsü, montajına ve replikasyonuna yardımcı olan yapısal olmayan ve yapısal proteinlerden oluşur. SARS-CoV-2 spike, plazma zarındaki hACE2 etkileşimlerinden sorumlu reseptör bağlayıcı alanı içeren S1 ile S1 ve S2 adı verilen iki alana sahiptir9. Spike'ın ayrıca plazma zarında hACE210,11'e ek olarak ko-reseptörler olarak işlev görebilecek diğer moleküllerle etkileşime girdiği bulunmuştur. Spike protein dizisi boyunca ve özellikle S1 / S2 arayüzünde, transmembran serin proteaz 2 (TMPRSS2) 12'den sonra membranda füzyonu sağlayan proteaz bölünme bölgeleri vardır. Araştırma faaliyetlerinde kullanılmak üzere bireysel reseptör bağlanma alanlarından S1, S2, S1'e ve araştırma faaliyetlerinde kullanılmak üzere birden fazla ticari satıcıdan tüm başak düzelticilere çeşitli rekombinant SARS-CoV-2 Spike proteinleri üretilmiştir13.
Bu çalışmada, QD'lerin yüzeyi, histidin etiketi (QD-Spike) içeren rekombinant spike trimers ile işlevselleştirilmiştir. Deniz Araştırma Laboratuvarı Optik Nanomalzemeler Bölümü tarafından üretilen QD'ler bir kadmiyum selenit çekirdeği ve bir çinko sülfür kabuğu içerir14,15. QD yüzeyindeki çinko, form ve işlev olarak SARS-CoV-2 viral parçacığına benzeyen işlevselleştirilmiş bir QD oluşturmak için rekombinant protein içindeki histidin kalıntılarını koordine eder. Nanopartiküllerin ve protein konjugasyonunun oluşumu daha önce QD-konjuge reseptör bağlanma alanı kullanılarak tanımlanmıştır15. Bu yöntem, bir insan hücresinin fizyolojik bağlamında SARS-CoV-2 Spike aktivitesini incelemede bir araştırmacıya rehberlik edebilecek hücre kültürü preparatlarını, QD tedavisini, görüntü elde etmeyi ve veri analizi protokolünü açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan HEK293T hücre hattı ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattıdır. Bu çalışmada insan veya hayvan denek kullanılmamıştır.
1. Hücre kültürü ve tohumlama
- Steril bir biyogüvenlik kabini içinde, kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar eldivenleri, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlükleri dahil) giyerek, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ve 250 μg / mL G418 ile destekleyerek hücre kültürü ortamı hazırlayın.
- 500 mL ortam için 443,75 mL DMEM, 50 mL FBS, 5 mL P/S ve 1,25 mL G418 ekleyin.
- 0,2 μm'lik bir filtre şişesinden süzün ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için steriliteyi koruyun.
- Steril bir biyogüvenlik kabini içinde, hücre kültürü ortamının kuyucuğu başına 100 μL'de 20.000 hücreli siyah, açık tabanlı, poli-D-lizin kaplı 96 delikli bir plakanın iç 60 kuyucuğuna tohum atın. Dış 36 kuyucuğu fosfat tamponlu salin (PBS) kuyusu başına 100 μL ile doldurun.
- Hücreleri saymak için, 18 μL hücre süspansiyonuna 2 μL akridin portakalı ve propidiyum iyodür boyası ekleyin.
- Bu çözeltinin 10 μL'sini hücre sayma slaytının bir tarafına yükleyin.
- 1.2.1 numaralı adımları yineleyin. ve 1.2.2. slaytın her iki tarafını da yüklemek için.
- Slaytı otomatik bir hücre sayacına yerleştirin.
- Floresan sayma protokolünü seçin ve Count tuşuna basın. Slaytın her iki tarafını da sayın ve iki canlı hücre yoğunluğunun ortalamasını hesaplayın.
- Gerekli hücre süspansiyonunun hacmini hesaplamak için, gereken toplam hücre sayısını ortalama hücre yoğunluğuna bölün.
- Uygun yoğunluk ve dağılımın sağlandığından emin olmak için tohumlamadan sonra kuyuları ışık mikroskobu altında inceleyin.
- Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
2. QD-Spike ile hücrelerin tedavisi
- Görüntüleme ortamlarında seyrelterek %0.1 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın.
- 10 mL görüntüleme ortamı için 130 μL %7,5 BSA ekleyin ve karıştırın.
- 12 kuyulu bir rezervuarda veya tahlil plakasında, görüntüleme ortamlarında %0,1 BSA kullanarak 440 nM QD-Spike (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) stoğunu 20 nM'ye kadar seyreltin.
- 1 kuyucuk QD-Spike için, 20 nM'lik son konsantrasyon için 47.73 μL % 0.1 BSA görüntüleme ortamına 2.27 μL 440 nM QD-Spike ekleyin.
- Altı noktalı 1:3 seri seyreltme (üçlü olarak) oluşturmak için, 20 nM'lik en yüksek konsantrasyonu elde etmek üzere 285,74 μL %0,1 BSA görüntüleme ortamına 14,26 μL QD-Spike ekleyin. 6,67 nM QD-Spike'ın ikinci seyreltmesini yapmak için 200 μL %0,1 BSA ortamına 100 μL 20 nM QD-Spike ekleyin. Altı konsantrasyon noktasını oluşturmak için dört kez tekrarlayın.
- Çok kanallı bir aspiratör kullanarak, harcanan tüm medyayı her bir kuyucuktan çıkarın. Çok kanallı pipet kullanarak görüntüleme ortamıyla (100 μL/kuyucuk) bir kez yıkayın.
- 100 μL görüntüleme ortamını aspire edin ve 50 μL/kuyucuk QD-Spike çözeltisini geri ekleyin.
- Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de %5 CO2 ile 3 saat boyunca inkübe edin. 4. adıma geçin.
3. Fiksasyon ve çekirdek boyama
- Steril bir biyogüvenlik kabini içinde, kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar eldivenleri, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlükleri dahil) giyerek,% 0.1 BSA görüntüleme ortamında% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın.
- Her bir kuyucuktan 50 μL QD-Spike aspire edin ve% 4 PFA'lık 100 μL / kuyucuk ekleyin.
- Kuyuların kurumasına izin vermeyin. Kuyucukların kurumasını önlemek için otomatik çok kanallı pipet kullanın (önerilir).
- Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın.
- 5 mM stok çözeltisini PBS'de 1:1000 seyreltmeye kadar seyrelterek koyu kırmızı nükleer boyayı hazırlayın.
- PBS'yi aspire edin ve 50 μL/kuyucuk seyreltilmiş nükleer boya ekleyin.
- Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- PBS ile üç kez yıkayın.
- Daha sonraki bir tarihte görüntülemek için bir plaka kapatıcı kullanarak plakayı veya contayı görüntüleyin. Plakayı 4 °C'de saklayın. Floresan birkaç hafta veya daha uzun süre stabil olmalıdır.
4. Satın alma kurulumu ve görüntüleme
- Görüntüleme platformu için yazılımı başlatın. Yüksek içerikli görüntüleme platformunu açtığınızda durum çubuğundaki ışık yanmalıdır. Makine bağlı değilse, yazılım çevrimdışı analiz moduna geçecektir.
- Görüntüleme platformuna giriş yapın.
- Yeni bir alma protokolü oluşturun.
- 96 kuyu netliğinde alt görüntüleme plakası olarak Plaka Türü'nü seçin.
NOT: Cihazdaki plaka seçimi değişebilir ve kuyu aralığını ve odak noktalarını tanımlamak için yükseklik, genişlik ve diğer mesafeler gibi plaka boyutlarını içeren doğru plaka tanımları yüklenerek özelleştirilebilir. - Konfokal olarak Optik Mod'u ve 40x suya daldırma olarak büyütmeyi seçin.
- Binning'i 1 olarak seçin.
- Kanalları ve floresan uyarım/emisyon dalga boylarını adım 4.3.5-4.3.8'de açıklandığı gibi seçin. Görüntüyü görüntülemek ve ayarların uygun olduğundan emin olmak için ayarlar seçildiğinde anlık görüntü alın.
NOT: Dijital Faz Kontrastı (DPC), hücre lekesi veya floresan boya olmadan canlı hücrelerin görselleştirilmesine izin verecektir. Sabit hücreler için önerilmez. - İyi tanımlanmış hücre gövdeleri üretmek için Yüksek Kontrast gibi DPC Modu'nu seçin. Görüntü penceresinde görüldüğü gibi bu ayarın uygun olduğunu onaylamak için anlık görüntü alın.
- Hücre içindeki ACE2 trafiğinin görselleştirilmesine olanak tanıyan ACE2-GFP hücre satırıyla kullanılmak üzere FITC Kanalı'nı seçin.
- QD kanalı için özel bir kanal oluşturmak üzere kanal için üçgen açılır menüyü seçin ve 405 nm aralığında uyarmayı ve 608 nm aralığında emisyonu seçin.
- Hücreler sabitlendiyse ve koyu kırmızı bir nükleer boya kullanıldıysa, hücre gövdesini daha da tanımlamak ve bir hücre maskesi görevi görmek için 630 nm'den daha büyük emisyona sahip uzak kırmızı kanalı seçin.
- Pozlama süresini, lazer gücünü ve Z-yükseklik konumunu ayarlamak için güçlü bir sitoplazmik QD sinyaline sahip bir kuyu seçin. 4.3.10-4.3.13 arasındaki adımları izleyin.
- Varsayılan yüksekliğin, hücrelerin istenen odak düzleminde olduğu bir görüntü üretip üretmediğini kontrol edin. Endositozlu puncta hedef organel ise, Z-pozisyonu plazma zarının hedef organel olmasından daha düşük olacaktır.
- Arka plan sinyalinden en az üç kat daha büyük gri seviyelere sahip parlak bir görüntü üreten bir pozlama süresi seçin. Bu genellikle 100 ila 300 ms arasındadır. 20 nM'de, gri seviyeler 200 ms'lik bir maruz kalma süresi ve% 80'lik bir lazer gücü kullanılarak yaklaşık 6000 a.u. olmalıdır.
- Her kanaldaki Anlık Görüntü özelliğiyle üretilen görüntüye sağ tıklayıp Yoğunluğu Göster'i seçerek gri düzeyleri kontrol edin. Ardından, ilgilenilen nesneye veya arka plana sol tıklayarak o pikselin gri düzeyini görüntüleyin.
- İlgilenilen nesnelerin yoğunluğuna ince ayar yapmak için lazer gücünü ayarlayın.
- 96 kuyu netliğinde alt görüntüleme plakası olarak Plaka Türü'nü seçin.
- Edinme protokolünü kaydedin.
- Denemeyi Çalıştır'a geçin ve Plaka Adı'nı girin.
- Denemeyi çalıştırın.
5. Veri analizi
- Verileri görüntüleme yazılımına aktarın.
- Tüm görüntüleri aldıktan sonra, ölçümleri görüntüleme yazılımına aktarın. Bu, bir sunucunun kurulmasını ve bir hesabın oluşturulmasını gerektirir. Görüntüleme yazılımına aktarılacak veriler için bir ekran oluşturun.
- Görüntüleme yazılımında, analiz protokolünü oluşturmaya başlamak için Görüntü Analizi'ni seçin.
- Ekranlar listesindeki dosyaya sağ tıklayıp Seç'e tıklayarak görüntüleme deneyindeki ölçümleri yükleyin. Görüntülenen kuyuların ve bunlarla ilişkili alanların plaka haritası, pencerenin sol alt köşesinde görünür olmalıdır.
- Görüntü segmentasyonuna başlamak için parlak sitoplazmik QD lekeleri olan bir kuyu seçin.
- Giriş Görüntüsü Yapı Taşı'nda, Düz Alan Düzeltme'yi seçin.
- Çekirdek Bul'u seçerek bir sonraki yapı taşını protokole ekleyin.
- Burada, Çekirdek işaretçisi olarak DPC veya uzak kırmızı kanalı kullanın.
- Önce nesneleri doğru şekilde segmentlere ayıran yöntemi seçin ve ardından açılır menüyü kullanarak ve kaydırıcıları ayarlayarak segmentasyona ince ayar yapın.
NOT: İyi segmentasyon, çekirdek, hücre ve noktalar için ilgi bölgesini (ROI) doğru bir şekilde tanımlar. Yalnızca işaretleyici için pozitif olan pikseller tek bir YG içinde yakalanmalıdır. Arka plan sinyali hariç tutulmalıdır. Arka plan yatırım getirisinde yakalanırsa, yöntemin duyarlılığı azaltılabilir veya segmentasyon algoritmasının sıkılığını artırmak için yoğunluk eşiği artırılabilir. Bu, tüm Bul yapı taşları için geçerlidir.
- Ardından, sitoplazmayı tanımlamak için Sitoplazma Yapı Bloğunu Bul'u ekleyin.
- Bu durumda, sitoplazmik segmentasyon için ACE2-GFP kanalını kullanın.
- Her hücrenin sitoplazmasını en iyi tanımlayan yöntemi seçin.
- Ardından, QD-Spike punktasını tanımlamak için Find Spots Yapı Bloğu'nu ekleyin.
- ROI popülasyonu olarak Nuclei'yi seçin.
- YG bölgesi olarak Hücre'yi seçin. Bu, tüm hücre içindeki puncta'yı yakalar.
- Her hücredeki QD puncta'yı en iyi tanımlayan yöntemi seçin.
- Görüntüdeki tüm nesneler bu kuyuda doğru bir şekilde bölümlere ayrıldıktan ve tanımlandıktan sonra, yapı taşlarının ve ayarların genellikle diğer kuyucuklara ve diğer koşullara uygulanabilmesini sağlamak için diğer kuyucukları seçin.
- Tüm bölümlere ayrılmış nesneler (çekirdekler, sitoplazma/hücreler ve noktalar) için Yoğunluk Özelliklerini Hesapla'yı ekleyin.
- Tüm parçalanmış nesneler (çekirdekler, sitoplazma/hücreler ve noktalar) için Morfoloji Özelliklerini Hesapla'yı ekleyin.
- Tüm segmentlere ayrılmış nesneler (çekirdekler, sitoplazma/hücreler ve noktalar) için Doku Özelliklerini Hesapla'yı ekleyin.
- Çekirdekler ve noktalar dahil olmak üzere her popülasyon için parametreleri seçerek sonuçları tanımlayın. Nesnelerin sayısı, hücre canlılığının dolaylı bir ölçüsü olarak kullanılabilir.
6. Verileri dışa aktarma
- Toplu analiz'e tıklayın. Sonraki adıma (adım 6.2) geçmeden önce analizin bitmesini bekleyin.
NOT: Toplu analiz, görüntü analizi yazılım sunucusunun, verileri uzaktan analiz etmek için seçilen ölçümleri kullanarak analiz protokolünü yüklemesine olanak tanır. - Veri kümesini yerel bir bilgisayara veya ağ sürücüsüne aktarın.
- Bir bağlantı dosyası indirip açarak görüntü analiz yazılımını bilgisayardaki bir yardımcı uygulamaya bağlayın.
- Sonuç dosyası türünü seçin (.txt, .csv, .html veya Yerel XML).
- Açılır menüden Dosya Klasörü ayarlarını seçin.
7. Bir elektronik tablodaki verileri analiz edin
- Dışa aktarılan dosyayı açın. .csv bir dosyaysa, pivot tabloların kullanımını etkinleştirmek için dosyayı .xls dosya biçiminde kaydedin. Dosya yolu çok uzunsa, kaydetme hatalarını önlemek için .xls dosyayı klasör hiyerarşisinde daha yükseğe kaydedin.
- E-tabloya, her bir kuyu kutusunun koşullarını belirleyen sütunlar ekleyin. Örneğin, hücre tipi, QD-Spike varyantları, QD-Spike konsantrasyonları, kuluçka süresi vb.
- Pivot Tablo işlevini seçin ve eklenen koşulları Satırlar ve ölçülen parametreleri Sütunlar olarak kullanarak tabloyu oluşturun. Her parametre için hesaplamayı seçin, yani Ortalama, Standart Sapma, Medyan, Min, Maks veya Sayım.
- Konjuge edilmemiş QD'ler %0 ve en yüksek QD-Spike konsantrasyonu %100 olarak dahil olmak üzere numuneleri kontrol etmek için verileri normalleştirin
NOT: Nötralize edici antikorlar gibi inhibitörlerin etkinliğini değerlendiriyorsanız, verileri yalnızca medya ile tedavi edilen hücrelere (% 100 etkinlik) ve inhibitörsüz QD-Spike'a (% 0 etkinlik) normalleştirin. - Verileri grafik yazılımında çizin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tedavi üzerine, nanopartikül plazma zarındaki ACE2'ye bağlanacağı ve endositozu indükleyeceği için QD'ler içselleştirilecektir. Bir ACE2-GFP eksprese eden hücre hattı kullanılarak, hem QD'lerin hem de ACE2'nin translokasyonu, floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir. İçselleştirildikten sonra, iki QD ve ACE2 sinyali güçlü kolokalizasyon gösterir. Bu görüntülerden, spot sayısı gibi ilgili parametreleri çıkarmak için görüntü segmentasyonu ve müteakip analizler yapılabilir (Şekil 1, Şekil 2B). Şekil 1A , farklı konsantrasyonlarda QD-Spike veya medya ile sadece bir kontrol olarak muamele edilen hücrelerin bir montajıdır. Dijital faz kontrastı, FITC ve 405 nm'de uyarma ve 608 nm'de emisyon ile özel QD kanalı dahil olmak üzere üç kanal kullanıldı. DPC, genel hücre şeklinin bir görüntüsünü sağlar. DPC görüntüsü, tüm hücre morfolojisinin yaklaşık bir göstergesini sağlar. İlgi alanı DPC sinyaliyle örtüşür ve içselleştirilmiş QD'leri tespit etmek için yeterlidir. FITC kanalı, ACE2-GFP'nin lokalizasyonu değiştirdiğini ve QD-Spike ile birlikte lokalize olan bölgelerde biriktiğini gösterir. QD-Spike konsantrasyonu azaldıkça, QD'ler artık görünmez ve ACE2-GFP sinyali kontrole benzer. Birleştirme kanalı, ACE2-GFP'nin QD-Spike ile birlikte lokalizasyonunu gösterir. Bu nesneler, analiz yazılımı ile bölümlere ayrılabilen noktaların ve daha büyük birikimlerin bir karışımıdır. Görüntü segmentasyonu için kullanılan yazılım analizi yönteminin ince ayarı, ilgilenilen nesneleri segmentlere ayırmak için kullanılabilir.
Burada, optimal QD konsantrasyonlarını belirlemek için 20 nM'den başlayarak altı farklı QD-Spike konsantrasyonu ile bir konsantrasyon-yanıt deneyi gerçekleştirildi (Şekil 2A). QD'ler 2.22 nM'ye kadar düşük bir seviyede kullanılabilir ve yine de bağlama ve içselleştirme gösterir. Bununla birlikte, sağlam bir yanıt sağlamak için 20 nM veya daha yüksek konsantrasyonların kullanılması önerilir.
QD'ye konjugasyon sırasında, protein agregasyonu meydana gelebilir. Agregalarla ilgili ana sorun, hücrelerin üstünde birikmeleri ve görüntü segmentasyonu adımında eserlere neden olmalarıdır. Agregalar hücrelere giremeyecek ve nanopartiküller bir bütün olarak artık viral bir parçacığa benzemeyecek (Şekil 3). Agregalar, QD çözeltisinde parlak, kümelenmiş çökeltiler olarak tespit edilebilir.
Bu tahlil, viral girişi bloke eden nötralize edici antikorlar gibi biyolojik değerleri değerlendirmek için de kullanılabilir. QD'ler, hücrelere eklenmeden önce oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 30 μg / mL'den başlayarak nötralize edici antikorlarla inkübe edildi (Şekil 4A). Referans Washington suşu SARS-CoV-2 RBD'ye karşı yükseltilen antikorlar kullanıldı. Bağlanmayı, içselleştirmeyi bloke ettiler ve ölçülen nokta sayısında, yalnızca QD ile tedavi edilen hücrelere kıyasla bir azalmaya neden oldular (Şekil 4B).
Şekil 1: QD608-Spike ile tedavi edilen ACE2-GFP hücrelerinin yüksek içerikli görüntü analizi ve segmentasyonu. Doğru segmentasyonun temsili görüntüleri. İlk olarak, çekirdekler bir ROI popülasyonu oluşturmak için nükleer belirteci içeren kanaldan bölümlere ayrılır. ROI popülasyonundan, hücreyi özetleyen bir ROI bölgesi, ACE2-GFP kanalı kullanılarak bölümlere ayrılmıştır. Son olarak, QD608-Spike noktaları Hücre ROI bölgesinden bölümlere ayrılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: QD608-Spike, hACE2'ye bağlanır ve hACE2-GFP HEK293T hücrelerinde endositozlanır. (A) Birkaç QD608-Spike (macenta) konsantrasyonu veya sadece medya ile muamele edilmiş hACE2-GFP (sarı) HEK293T hücrelerinin görüntü montajı. Hücre gövdesini görselleştirmek için dijital faz kontrastı (camgöbeği) kullanıldı. Ölçek çubuğu: 20 μm. (B) QD608-Spike Spot Sayımlarının yüksek içerikli analizi, 20 nM QD608-Spike (%100) ve kontrol (%0) olarak normalleştirilmiştir. N = üçlü kuyular. Hata çubukları standart sapmayı gösterir (S.D.). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Agrega QD608-Spike, hACE2-GFP HEK293T hücrelerine içselleştirilmez. 10 nM QD608-Spike veya yalnızca medya ile muamele edilmiş hACE2-GFP HEK293T hücrelerinin görüntü montajı. Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Nötralize edici antikor, hACE2-GFP HEK293T hücrelerinde QD608-Spike'ın endositozunu bloke eder. (A) Hücre cisimciklerini tanımlamak için dijital faz kontrastı (camgöbeği) kullanılarak, nötralize edici antikorların azalan konsantrasyonları ile önceden inkübe edilmiş QD608-Spike (macenta) ile muamele edilmiş hACE2-GFP (sarı) HEK293T hücrelerinin görüntü montajı. Ölçek çubuğu: 20 μm. (B) QD608-Spike Spot Sayımlarının yüksek içerikli analizi, yalnızca medya kontrolüne (%100) ve 10 nM QD608-Spike only (%0) olarak normalleştirilmiştir. N = üçlü kuyular. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede açıklanan yöntem, yüksek verimli konfokal mikroskopi kullanarak insan hücrelerinde işlevselleştirilmiş QD'lerin görüntülenmesi için gerekli adımları sağlar. Bu yöntem, SARS-CoV-2 Spike ve hACE2 endositozunun incelenmesini mümkün kıldığı için, endositozun TMPRSS2 ve membran füzyonunun aktivitesinden ziyade viral girişin ana yolu olduğu hücreler için en uygun yöntemdir. QD modelinin ve ticari olarak temin edilebilen Spike trimerindeki C-terminal His-etiketinin doğası gereği, Spike S1 ve S2 etki alanlarının herhangi bir TMPRSS2 bölünmesi, QD'yi yalnızca S2 etki alanına bağlı olarak bırakır12. Bu, RBD'nin S1'de bulunduğu göz önüne alındığında, içselleştirmeyi önleyebilir. Bu nedenle, hücre yüzeyindeki olayların sırası, hACE2'nin bağlandığı ve daha sonra TMPRSS2'nin Spike'ı parçaladığı kesin olsaydı, içselleştirme olmadan negatif bir sinyal beklenirdi.
Bu protokol görüntüleme hücresel süreçleri ile ilgilendiğinden, kültürlenmiş hücreler hACE2 ekspresyonu ile viral enfeksiyona izin vermelidir. hACE2 geçici olarak hücrelere aktarılabilir veya hACE2'yi eksprese eden kararlı bir hücre hattı oluşturulabilir17. hACE2'nin mikroskopi kullanılarak gözlemlenebilen GFP gibi bir floresan protein etiketine sahip olmadığı sürece, hACE2'ye karşı antikorlarla immünofloresan kullanarak hACE2 ekspresyonunun ve lokalizasyonunun doğrulanması önerilir. GFP etiketli hACE2, QD-Spike endositozunu takiben hACE2 kaçakçılığını görselleştirmenin ek yararını sağlar. Endojen hACE2 ekspresyonuna sahip bazı hücre hatları kullanılabilir, ancak bu immünositokimya kullanılarak doğrulanmalıdır. Bazı durumlarda, endojen ekspresyon QD-Spike için yeterli hACE2 bağlanma ortağı sağlamaz ve yüksek verimli konfokal mikroskopi tarafından zayıf bir şekilde tespit edilen bir sinyalle sonuçlanabilir.
Protokoldeki kritik bir adım, rekombinant His-CoV-2 Spike'a konjuge edilmiş yüksek kaliteli QD'lerin tedarikini içerir. Bunun için ön koşul, agregasyona neden olmadan QD'lere konjuge edilebilen uygun şekilde saflaştırılmış bir proteindir. Toplu QD'lerin başarılı bir denemeyi engelleyen birkaç sorunu olacaktır. Bu nedenle, QD-Spike'ın tam deneyden önce analiz araçları (örneğin, UV-görünür spektroskopi, transmisyon elektron mikroskobu veya dinamik ışık saçılması) kullanılarak test edilmesi, değerli reaktiflerin test edilmesi durumunda değerli kaynakların korunması için şiddetle tavsiye edilir16. QD'lerin spike ile etiketlenmesi sırasında, belirli bir molekül oranını elde etmek için spesifik QD ve Spike konsantrasyonları karıştırılır. Sadece QD ve Spike karıştırılır ve her iki çözelti de yüksek oranda saflaştırılır. QD'lerin etiketlenmesini değerlendirmek için, bir akrilamid jeli dökülebilir ve tek başına QD ile yüklenebilir, ayrıca Spike'a QD konjuge edilebilir, bu da daha ağır moleküler ağırlık bantlarına neden olur.
Bu protokolde kullanılan QD'ler, UV uyarımını (≤405 nm) takiben 608 nm emisyona ayarlanmış bir floresan uyarımı/emisyon spektrumuna sahiptir, çünkü çoğu QD, yüksek fotolüminesans üreten UV aralığının yakınında yüksek emilime sahiptir18. Bu, özelleştirilebilir kanallara sahip olmak için mikroskop gerektiren geleneksel olmayan bir uyarma / emisyon kombinasyonudur. Birçok geleneksel konfokal mikroskop, bu uyarma / emisyonu elde etmek için doğru filtreler ve lazer çizgileri ile kurulabilir. Alternatif olarak, QD'nin emisyon zirvesinden yaklaşık 10 ila 20 nm uzaktaki ilk absorpsiyon maksimumunda uyarılması (örneğin, burada kullanılan QD608 için 592 nm), yeterli fotolüminesans üretebilecektir.
Bu yüksek içerikli analiz protokolünde kullanılan bulut tabanlı yazılım, önceki adımlara dayanan bir adlandırma şeması kullanır. Örneğin, bölümlere ayrılan ilk nesneler, Nuclei adı verilen bir popülasyon oluşturan çekirdeklerdir. Bunu takiben, hücre veya sitoplazma, popülasyon Çekirdekleri içinde bir ROI bölgesi olarak tanımlanabilir. Görüntü analizi yazılımında kullanılan terminoloji, çekirdek yapı taşı kullanılarak Nuclei olarak bölümlere ayrılan nesnelerin popülasyonunun adını belirler. Bununla birlikte, mutlaka çekirdek olmaları gerekmez ve nükleer boya mevcut değilse hücre gövdeleri olabilirler. Bu adlandırma şeması ayrıca her yapı taşı çıktı adı içinde değiştirilebilir ve özelleştirilebilir.
Protokolümüz membran etkileşimlerini hesaba katmadı, ancak bu, ACE2-GFP kaçakçılığından bağımsız ek bir membran boyası ekleyerek yapılabilir. Spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için,% 0.1 BSA tahlil ortamına dahil edilir (DMEM +% 0.1 BSA) ve hücreler% 10 FBS'de de yetiştirilir. Mutant spike proteinleri kullanılabilirdi, ancak ticari olarak temin edilebilen spike proteinleri ile sınırlıydık. Bu durumda, bir SARS-CoV-2 mutant olmayan ACE2 bağlayıcı Spike proteini mevcut değildi.
QD nanopartikül yöntemi, Spike aracılı girişe dayanan virüslerin bağlanmasını ve içselleştirilmesini incelemek için güçlü bir teknoloji sunar. Bu tahlil, hücresel girişi engelleyen güçlü antiviralleri yeniden kullanmak ve tanımlamak için Şekil 4'te gösterildiği gibi benzer bir şekilde yüksek verimli tarama için kullanılabilir. Bu protokol sadece SARS-CoV-2'nin Washington WA-1 referans suşuna konjuge QD'lerin kullanımını gösterirken, bu tahlil, QD'lere konjuge edilmiş ilgili başak proteinlerinin kullanımı yoluyla Alfa, Beta, Gama ve Delta gibi yeni ortaya çıkan varyantların bağlanma özelliklerini incelemek için kolayca uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma kısmen Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi, NIH'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Deniz Araştırma Laboratuvarı, dahili Nanobilim Enstitüsü aracılığıyla finansman sağladı. Reaktif hazırlığı NRL COVID-19 temel fonu aracılığıyla desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), New York, N.Y. 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
