Konfokal billeddannelse med høj gennemstrømning af kvantepunkt-konjugerede SARS-CoV-2 spike-trimmere til at spore binding og endocytose i HEK293T-celler

Summary

I denne protokol muliggør kvantepunkter konjugeret til rekombinant SARS-CoV-2-spike cellebaserede assays at overvåge spikebinding til hACE2 ved plasmamembranen og efterfølgende endocytose af de bundne proteiner i cytoplasmaet.

Abstract

Udviklingen af nye teknologier til cellulær fluorescensmikroskopi har lettet screeningsmetoder med høj kapacitet til lægemiddelopdagelse. Kvantepunkter er fluorescerende nanopartikler med fremragende fotofysiske egenskaber gennemsyret af lys og stabil fotoluminescens samt smalle emissionsbånd. Kvanteprikker er sfæriske i form, og med den rette modifikation af overfladekemien kan de bruges til at konjugere biomolekyler til cellulære applikationer. Disse optiske egenskaber kombineret med evnen til at funktionalisere dem med biomolekyler gør dem til et glimrende værktøj til at undersøge receptor-ligandinteraktioner og cellulær handel. Her præsenterer vi en metode, der bruger kvanteprikker til at spore bindingen og endocytosen af SARS-CoV-2 spike-protein. Denne protokol kan bruges som en vejledning til eksperimentalister, der ønsker at bruge kvantepunkter til at studere protein-protein-interaktioner og menneskehandel i forbindelse med cellulær fysiologi.

Introduction

Fluorescensmikroskopi gør det muligt for forskere at kigge ind i cellens indre arbejde ved hjælp af specialiserede ^{farvestoffer1}, genetisk kodede fluorescerende ^proteiner2 og fluorescerende nanopartikler i form af kvantepunkter (QD'er)³. For det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus i 2019 (SARS-CoV-2) globale pandemi har forskere anvendt fluorescensmikroskopi til at forstå, hvordan virussen interagerer med cellen både ved plasmamembranen og i cytoplasmaet. For eksempel har forskere været i stand til at få indsigt i bindingen af SARS-CoV-2 Spike-proteinet på virionens overflade til humant angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) på overfladen af humane celler, efterfølgende internalisering via fusion ved plasmamembranen og endocytose af Spike: hACE2-proteinkomplekset4,5. Der er også opnået stor indsigt i SARS-CoV-2-udgang fra celler via lysosomet ved hjælp af cellulær fluorescensbilleddannelse, et unikt træk ved coronavirus, der tidligere blev anset for at forekomme via traditionel vesikel, der spirer fra Golgi, som det er med mange andre ^vira6. En grundpille i næsten alle aspekter af biologisk forskning, den cellulære fluorescensmikroskopiteknik har nødvendigvis udviklet sig i sin bredde og anvendelsesområde fra superopløsningsbilleddannelse af hele dyr til automatiseret multiparametrisk billeddannelse med højt indhold til lægemiddelscreening. Her anvendes automatiseret konfokalmikroskopi med højt indhold til undersøgelsen af SARS-CoV-2-celleindgang ved hjælp af fluorescerende QD'er konjugeret til det virale spikeprotein.

Højindholdsanalyse af billeder genereret af biologiske billeddannelsesplatforme giver mulighed for større udvinding af værdifuld biologisk indsigt end enkeltparametre såsom helbrøndeintensitet, som man ville opnå ved hjælp af en multimodal ^pladelæser7. Ved at adskille objekterne i et synsfelt ved hjælp af automatiserede segmenteringsalgoritmer kan hvert objekt eller en population af objekter analyseres for parametre som intensitet, areal og tekstur i hver tilgængelig ^{fluorescenskanal8}. Kombination af mange målinger i multivariate datasæt er en nyttig tilgang til fænotypisk profilering. Når den ønskede fænotype er kendt, såsom QD-internalisering i form af puncta, kan man bruge målingerne relateret til puncta såsom størrelse, antal og intensitet til at vurdere effekten af en behandling.

Cloudbaseret billedanalysesoftware med højt indhold kan rumme et stort udvalg af instrumentdataudgange, herunder billedbehandlingsplatformen med højt indhold. Ved at bruge en skybaseret server til billedlagring og onlineanalyse kan brugeren uploade sine data fra enten billedbehandlingsinstrumentet eller fra det netværksdrev, hvor dataene er gemt. Analysedelen af protokollen udføres i cloud-softwaremiljøet, og data kan eksporteres i en række filformater til downstream-datavisualisering.

SARS-CoV-2-viruset består af ikke-strukturelle og strukturelle proteiner, der hjælper med dets samling og replikation. SARS-CoV-2 spike har to domæner kaldet S1 og S2, hvor S1 indeholder det receptorbindende domæne, der er ansvarlig for hACE2-interaktioner ved ^{plasmamembranen9}. Spike har også vist sig at interagere med andre molekyler ved plasmamembranen, der kan fungere som co-receptorer ud over ^hACE210,11. I hele spikeproteinsekvensen og især ved S1/S2-grænsefladen er der proteasespaltningssteder, der muliggør fusion ved membranen efter transmembranserinprotease 2 (TMPRSS2)¹². Forskellige rekombinante SARS-CoV-2 Spike-proteiner er blevet produceret fra individuelle receptorbindingsdomæner til S1, S2, S1 med S2 og hele spike-trimere fra flere kommercielle leverandører til brug i ^{forskningsaktiviteter13}.

I dette arbejde blev overfladen af QD'er funktionaliseret med rekombinante spike trimers, der indeholder et histidin tag (QD-Spike). QD'erne produceret af Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section indeholder en cadmiumselenidkerne og en ^{zinksulfidskal14,15}. Zinket på QD-overfladen koordinerer histidinresterne i det rekombinante protein for at danne en funktionaliseret QD, der ligner en SARS-CoV-2 viral partikel i form og funktion. Dannelsen af nanopartiklerne og proteinkonjugeringen blev tidligere beskrevet ved anvendelse af det QD-konjugerede receptorbindingsdomæne15. Denne metode beskriver cellekulturpræparater, QD-behandling, billedoptagelse og dataanalyseprotokol, der kan guide en forsker i at studere SARS-CoV-2 Spike-aktivitet i den fysiologiske sammenhæng med en menneskelig celle.

Protocol

HEK293T-cellelinjen, der anvendes i denne undersøgelse, er en udødeliggjort cellelinje. Ingen mennesker eller dyr blev anvendt i denne undersøgelse.

1. Celledyrkning og såning

1. Inde i et sterilt biosikkerhedsskab, iført personlige værnemidler (herunder laboratoriehandsker, laboratoriefrakke og sikkerhedsbriller), skal du forberede cellekulturmedium ved at supplere Dulbeccos modified Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt kvægserum (FBS), 1% penicillin / streptomycin (P / S) og 250 μg / ml G418.
   1. For 500 ml medier tilsættes 443,75 ml DMEM, 50 ml FBS, 5 ml P/S og 1,25 ml G418.
   2. Filtrer gennem en 0,2 μm filterkolbe, og oprethold steriliteten for at undgå bakteriel kontaminering.
2. Inde i et sterilt biosikkerhedsskab frøes de indvendige 60 brønde af en sort, klarbundet, poly-D-lysinbelagt 96-brønds plade med 20.000 celler i 100 μL pr. Brønd cellekulturmedium. De ydre 36 brønde fyldes med 100 μL pr. brønd fosfatbufret saltvand (PBS).
   1. For at tælle cellerne tilsættes 2 μL acridin orange og propidiumiodid plet til 18 μL cellesuspension.
   2. Læg 10 μL af denne opløsning i den ene side af et celletællende dias.
   3. Gentag trin 1.2.1. og 1.2.2. for at indlæse begge sider af diaset.
   4. Placer diaset i en automatiseret celletæller.
   5. Vælg fluorescenstællingsprotokollen, og tryk på Tæl. Tæl begge sider af diaset, og beregn gennemsnittet af de to levende celletætheder.
   6. For at beregne det krævede volumen af cellesuspension skal du dividere det samlede antal celler, der er nødvendige, med den gennemsnitlige celletæthed.
3. Undersøg brøndene efter såning under et lysmikroskop for at sikre, at der opnås korrekt tæthed og fordeling.
4. Inkuber pladen natten over i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5 % _CO2.

2. Behandling af celler med QD-Spike

1. Forbered 0,1% bovin serumalbumin (BSA) ved fortynding i billeddannende medier.
   1. Til 10 ml billedmedier tilsættes 130 μL 7,5 % BSA og blandes.
2. I et 12-brønds reservoir eller analyseplade fortyndes 440 nM QD-Spike (SARS-CoV-2, Isolater USA-WA1/2020) bestanden til 20 nM ved hjælp af 0,1% BSA i billeddannende medier.
   1. For 1 brønd QD-Spike tilsættes 2,27 μL 440 nM QD-Spike til 47,73 μL 0,1% BSA-billeddannelsesmedier for en endelig koncentration på 20 nM.
   2. For at generere en sekspunkts 1: 3 seriel fortynding (i tre eksemplarer) tilsættes 14,26 μL QD-Spike til 285,74 μL 0,1% BSA-billeddannelsesmedier for at lave den højeste koncentration på 20 nM. Tilsæt 100 μL 20 nM QD-Spike til 200 μL 0,1% BSA-medier for at foretage den anden fortynding af 6,67 nM QD-Spike. Gentag fire gange for at generere de seks koncentrationspunkter.
3. Brug en flerkanals aspirator til at fjerne alle brugte medier fra hver brønd. Brug en flerkanalspipette til at vaske en gang med billedmedier (100 μL/brønd).
4. Aspirat 100 μL billedmedier og tilsæt 50 μL / brønd QD-Spike-opløsning.
5. Inkuber pladen i 3 timer i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5 % _CO2. Fortsæt til trin 4.

3. Fiksering og kernefarvning

1. Inde i et sterilt biosikkerhedsskab, iført personlige værnemidler (herunder laboratoriehandsker, laboratoriefrakke og sikkerhedsbriller), skal du forberede 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1% BSA-billeddannelsesmedier.
2. Aspirer 50 μL QD-Spike fra hver brønd og tilsæt 100 μL/brønd på 4% PFA.
   1. Lad ikke brøndene tørre ud. Brug en automatiseret flerkanalspipette for at undgå tørring af brøndene (anbefales).
3. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
4. Vask tre gange med 1x fosfatbufret saltvand (PBS).
5. Forbered det dybrøde kernefarvestof ved at fortynde 5 mM stamopløsningen til 1:1000 fortynding i PBS.
6. Aspirer PBS ud og tilsæt 50 μL / brønd fortyndet nukleart farvestof.
7. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
8. Vask tre gange med PBS.
9. Forestil dig pladen eller tætningen ved hjælp af en pladeforsegler til billeddannelse på et senere tidspunkt. Opbevar pladen ved 4 °C. Fluorescens skal være stabil i flere uger eller mere.

4. Opsætning og billeddannelse af anskaffelse

1. Start softwaren til billedbehandlingsplatformen. Tænd for billedbehandlingsplatformen med højt indhold, og lyset på statuslinjen skal være tændt. Hvis maskinen ikke er tilsluttet, går softwaren i offline analysetilstand.
2. Log ind på billedbehandlingsplatformen.
3. Opret en ny anskaffelsesprotokol.
   1. Vælg Pladetype som 96-brønds klar bundbilledplade.
      BEMÆRK: Pladevalget i instrumentet kan variere og kan tilpasses ved at indlæse de korrekte pladedefinitioner, der inkluderer pladedimensioner såsom højde, bredde og andre afstande for at definere brøndafstand og fokuspunkter.
   2. Vælg Optisk tilstand som konfokal og forstørrelse som 40x vandnedsænkning.
   3. Vælg Binning som 1.
   4. Vælg kanaler og fluorescerende excitations-/emissionsbølgelængder som beskrevet i trin 4.3.5-4.3.8. Tag et øjebliksbillede, når indstillingerne er valgt for at se billedet, og sørg for, at indstillingerne er passende.
      BEMÆRK: Digital Phase Contrast (DPC) tillader visualisering af levende celler uden celleplet eller fluorescerende farvestof. Det anbefales ikke til faste celler.
   5. Vælg Tilstand for DPC, f.eks. Høj kontrast, for at producere veldefinerede cellelegemer. Tag et øjebliksbillede for at bekræfte, at denne indstilling er passende, som det ses i billedvinduet.
   6. Vælg FITC-kanalen til brug med ACE2-GFP-cellelinjen, der tillader visualisering af ACE2-handel i cellen.
   7. Hvis du vil oprette en brugerdefineret kanal til QD-kanalen, skal du vælge rullemenuen trekant for kanalen og vælge excitationen i området 405 nm og emission i området 608 nm.
   8. Hvis celler blev fastgjort, og der blev anvendt et dybt rødt nukleart farvestof, skal du vælge den langt røde kanal med emission større end 630 nm for yderligere at afgrænse cellelegemet og fungere som en cellemaske.
   9. Vælg en brønd med et stærkt cytoplasmatisk QD-signal for at indstille eksponeringstiden, lasereffekten og Z-højdepositionen. Følg trin fra 4.3.10-4.3.13.
   10. Kontroller, om standardhøjden producerer et billede, hvor cellerne er i det ønskede brændplan. Hvis den endocytoserede puncta er målorganellen, vil Z-positionen være lavere, end hvis plasmamembranen er målorganellen.
   11. Vælg en eksponeringstid, der giver et lyst billede med gråniveauer, der er mindst tre gange større end baggrundssignalet. Dette er typisk mellem 100 og 300 ms. Ved 20 nM skal gråniveauerne være ca. 6000 a.u. ved hjælp af en eksponeringstid på 200 ms og lasereffekt på 80%.
   12. Kontroller grå niveauer ved at højreklikke på det billede, der er produceret med funktionen Snapshot i hver kanal, og vælge Vis intensitet. Venstreklik derefter på objektet af interesse eller baggrund for at se det grå niveau for den pågældende pixel.
   13. Juster lasereffekten for at finjustere intensiteten af de objekter, der er af interesse.
4. Gem anskaffelsesprotokollen.
5. Skift til Kør eksperiment, og indtast pladenavnet.
6. Kør eksperimentet.

5. Analyse af data

1. Importer data til billedbehandlingssoftwaren.
   1. Når du har erhvervet alle billeder, skal du eksportere målinger til billedbehandlingssoftwaren. Dette kræver, at der oprettes en server, og at der oprettes en konto. Opret en skærm, hvor de data, der skal eksporteres til billedbehandlingssoftwaren.
2. I billedbehandlingssoftwaren skal du vælge Billedanalyse for at begynde at opbygge analyseprotokollen.
3. Indlæs målingerne fra billeddannelseseksperimentet ved at højreklikke på filen på skærmlisten og klikke på Vælg. Pladekortet over afbildede brønde og deres tilhørende felter skal være synligt i nederste venstre hjørne af vinduet.
4. Vælg en brønd med lyse cytoplasmatiske QD-pletter for at starte billedsegmentering.
5. Vælg Flatfield Correction i byggestenen Inputbillede.
6. Føj den næste byggesten til protokollen ved at vælge Find kerner.
   1. Her skal du bruge DPC eller far-rød kanal som kernemarkør.
   2. Vælg den metode, der segmenterer objekterne nøjagtigt først, og finjuster derefter segmenteringen ved hjælp af rullemenuen og justering af skyderne.
      BEMÆRK: God segmentering definerer nøjagtigt interesseområdet (ROI) for kernen, cellen og pletterne. Kun de pixels, der er positive for markøren, skal registreres i et individuelt investeringsafkast. Baggrundssignal bør udelukkes. Hvis baggrunden er fanget i ROI, kan metodens følsomhed reduceres, eller intensitetstærsklen kan øges for at øge strengheden af segmenteringsalgoritmen. Dette gælder for alle Find byggesten.
7. Tilføj derefter Find cytoplasma-byggestenen for at identificere cytoplasmaet.
   1. I dette tilfælde skal du bruge ACE2-GFP-kanalen til cytoplasmatisk segmentering.
   2. Vælg den metode, der bedst identificerer cytoplasmaet i hver celle.
8. Tilføj derefter byggesten find pletter for at identificere QD-Spike-punctaen.
   1. Vælg kernerne som ROI-population.
   2. Vælg cellen som ROI-område. Dette fanger puncta i hele cellen.
   3. Vælg den metode, der bedst identificerer QD-puncta i hver celle.
9. Når alle objekterne i billedet er blevet segmenteret og identificeret nøjagtigt i denne brønd, skal du vælge andre brønde for at sikre, at byggestenene og indstillingerne generelt kan anvendes på de andre brønde og andre forhold.
10. Tilføj Beregn intensitetsegenskaber for alle segmenterede objekter (kerner, cytoplasma / celler og pletter).
11. Tilføj Beregn morfologiegenskaber for alle segmenterede objekter (kerner, cytoplasma / celler og pletter).
12. Tilføj Beregn teksturegenskaber for alle segmenterede objekter (kerner, cytoplasma/celler og pletter).
13. Definer resultater ved at vælge parametrene for hver population, herunder kerner og pletter. Antallet af objekter kan bruges som et indirekte mål for cellelevedygtighed.

6. Eksportér data

1. Klik på Batchanalyse. Vent på, at analysen er færdig, før du fortsætter til næste trin (trin 6.2).
   BEMÆRK: Batchanalysen gør det muligt for billedanalysesoftwareserveren at indlæse analyseprotokollen ved hjælp af de valgte målinger til at analysere dataene eksternt.
2. Eksporter datasættet til en lokal computer eller et lokalt netværksdrev.
   1. Tilslut billedanalysesoftwaren til et hjælpeprogram på computeren ved at downloade og åbne en forbindelsesfil.
   2. Vælg resultatfiltypen (.txt, .csv, .html eller Native XML).
   3. Vælg indstillingerne for filmappe i rullemenuen.

7. Analyser dataene i et regneark

1. Åbn den eksporterede fil. Hvis det er en .csv fil, skal du gemme den som et .xls filformat for at muliggøre brugen af pivottabeller. Hvis filstien er for lang, skal du gemme .xls filen højere oppe i mappehierarkiet for at undgå fejl ved lagring.
2. Føj kolonner til regnearket, der angiver betingelserne for hver brønd. For eksempel celletypen, QD-Spike-varianter, QD-Spike-koncentrationer, inkubationstid osv.
3. Vælg funktionen Pivottabel , og opret tabellen ved hjælp af de tilføjede betingelser som Rækker og de målte parametre som Kolonner. Vælg beregningen for hver parameter, dvs. Gennemsnit, Standardafvigelse, Median, Min, Max eller Antal.
4. Normaliser dataene for at kontrollere prøver, herunder ukonjugerede QD'er som 0% og den højeste koncentration af QD-Spike som 100%.
   BEMÆRK: Hvis du vurderer effekten af hæmmere, såsom neutraliserende antistoffer, normaliseres dataene til medier-kun behandlede celler (100% effektivitet) og QD-Spike uden inhibitor (0% effektivitet).
5. Plot dataene i grafsoftware.

Representative Results

Efter behandling vil QD'erne blive internaliseret, da nanopartiklen vil binde sig til ACE2 på plasmamembranen og inducere endocytose. Ved hjælp af en ACE2-GFP-ekspressorcellelinje kan translokation af både QD'er og ACE2 visualiseres ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Når de er internaliseret, viser de to QD- og ACE2-signaler stærk colokalisering. Fra disse billeder kan billedsegmentering og efterfølgende analyse udføres for at udtrække relevante parametre såsom spotantal (figur 1, figur 2B). Figur 1A er en montage af celler, der kun behandles med forskellige koncentrationer af QD-Spike eller medier som en kontrol. Tre kanaler blev brugt, herunder digital fasekontrast, FITC og den brugerdefinerede QD-kanal med excitation ved 405 nm og emission ved 608 nm. DPC giver et billede af den generelle celleform. DPC-billedet giver en omtrentlig indikation af hele cellemorfologien. Interesseområdet overlapper DPC-signalet og er tilstrækkeligt til at detektere internaliserede QD'er. FITC-kanalen viser ACE2-GFP, der ændrer lokalisering og akkumulering i områder, der colokaliserer med QD-Spike. Da koncentrationen af QD-Spike falder, er QD'erne ikke længere synlige, og ACE2-GFP-signalet ligner kontrol. Fletningskanalen demonstrerer colokaliseringen af ACE2-GFP med QD-Spike. Disse objekter er en blanding af pletter og større akkumuleringer, der kan segmenteres med analysesoftwaren. Finjustering af softwareanalysemetoden, der bruges til billedsegmentering, kan bruges til at segmentere de objekter, der er af interesse.

Her blev der udført et koncentrationsresponseksperiment med seks forskellige koncentrationer af QD-Spike, startende ved 20 nM, for at bestemme optimale koncentrationer af QD (figur 2A). QD'er kan bruges så lavt som 2,22 nM og viser stadig binding og internalisering. Det anbefales dog at anvende koncentrationer på 20 nM eller højere for at sikre et robust respons.

Under konjugering til QD kan proteinaggregering forekomme. Hovedproblemet med aggregater er, at de akkumuleres oven på celler og forårsager artefakter i billedsegmenteringstrinnet. Aggregater vil ikke være i stand til at komme ind i celler, og nanopartiklerne som helhed vil ikke længere ligne en viral partikel (figur 3). Aggregater kan ses i QD-opløsningen som lyse, klumpede bundfald.

Dette assay kan også bruges til at vurdere biologiske lægemidler, såsom neutraliserende antistoffer, der blokerer viral indtræden. QD'er blev inkuberet med neutraliserende antistoffer (figur 4A), startende ved 30 μg / ml, i 30 minutter ved stuetemperatur før tilsætning til celler. Antistoffer rejst mod referencen Washington stamme, SARS-CoV-2 RBD, blev anvendt. De blokerede binding, internalisering og forårsagede en reduktion i det målte spotantal sammenlignet med celler, der kun blev behandlet med QD (figur 4B).

Figur 1: Billedanalyse med højt indhold og segmentering af ACE2-GFP-celler behandlet med _QD608-Spike. Repræsentative billeder af nøjagtig segmentering. For det første segmenteres kerner fra kanalen, der indeholder den nukleare markør for at skabe en ROI-population. Fra ROI-populationen segmenteres et ROI-område, der skitserer cellen, ved hjælp af ACE2-GFP-kanalen. Endelig segmenteres _{QD608-Spike-pletter} fra Cell ROI-regionen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: _QD608-Spike binder hACE2 og endocytoseres i hACE2-GFP HEK293T-celler. (A) Billedmontage af hACE2-GFP (gul) HEK293T-celler behandlet med flere koncentrationer af _QD608-Spike (magenta) eller kun medier. Digital fasekontrast (cyan) blev brugt til at visualisere cellelegemet. Skalabjælke: 20 μm. (B) Analyse med højt indhold af _QD608-Spike Spot Counts normaliseret til 20 nM _QD608-Spike (100%) og kontrollen (0%). N = tredobbelte brønde. Fejllinjer angiver standardafvigelse (S.D.). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Aggregeret _QD608-Spike internaliseres ikke i hACE2-GFP HEK293T-celler. Billedmontage af hACE2-GFP HEK293T-celler behandlet med 10 nM _QD608-Spike eller kun medier. Skalabjælke: 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Neutraliserende antistof blokerer endocytose af _QD608-Spike i hACE2-GFP HEK293T-celler. (A) Billedmontage af hACE2-GFP (gul) HEK293T-celler behandlet med _QD608-Spike (magenta) præinkueret med faldende koncentrationer af neutraliserende antistoffer ved hjælp af digital fasekontrast (cyan) til identifikation af cellelegemer. Skalabjælke: 20 μm. (B) Analyse med højt indhold af _QD608-Spike Spot Counts normaliseret til kun mediekontrol (100%) og 10 nM _QD608-Spike kun (0%). N = tredobbelte brønde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Metoden beskrevet i denne artikel giver de nødvendige trin til billeddannelse af funktionaliserede QD'er i humane celler ved hjælp af konfokal mikroskopi med høj gennemstrømning. Denne metode er bedst egnet til celler, hvor endocytose er den vigtigste indgangsvej snarere end aktiviteten af TMPRSS2 og membranfusion, da den muliggør undersøgelse af SARS-CoV-2 Spike og hACE2 endocytose. På grund af QD-modellens karakter og C-terminal His-tag på den kommercielt tilgængelige Spike-trimer vil enhver TMPRSS2-spaltning af Spike S1- og S2-domæner kun efterlade QD'en knyttet til ^{S2-domænet12}. Dette kan forhindre internalisering, da RBD findes i S1. Derfor, hvis sekvensen af begivenheder på celleoverfladen var præcis, hvor hACE2 er bundet, og derefter TMPRSS2 spalter Spike, forventes et negativt signal uden internalisering.

Da denne protokol beskæftiger sig med billeddannelse af cellulære processer, skal de dyrkede celler være tilladelige for virusinfektion med ekspression af hACE2. hACE2 kan transfekteres forbigående til celler, eller der kan genereres en stabil cellelinje, der udtrykker ^hACE217. Det anbefales at verificere hACE2-ekspression og lokalisering ved hjælp af immunofluorescens med antistoffer mod hACE2, medmindre hACE2 har et fluorescerende proteinmærke såsom GFP, der kan observeres ved hjælp af mikroskopi. GFP-mærket hACE2 giver den ekstra fordel at visualisere hACE2-handel efter QD-Spike-endocytose. Nogle cellelinjer med endogen hACE2-ekspression kan anvendes, men dette bør bekræftes ved hjælp af immunocytokemi. I nogle tilfælde giver det endogene udtryk ikke nok hACE2-bindende partnere til QD-Spike og kan resultere i et signal, der dårligt detekteres ved konfokal mikroskopi med høj gennemstrømning.

Et kritisk trin i protokollen inkluderer indkøb af QD'er af høj kvalitet, der er konjugeret til den rekombinante His-taggede SARS-CoV-2 Spike. Forudsætningen for dette er et korrekt oprenset protein, der kan konjugeres til QD'erne uden at forårsage aggregering. Aggregerede QD'er vil have flere problemer, der forhindrer et vellykket eksperiment. Derfor anbefales test af QD-Spike ved hjælp af analyseværktøjer (f.eks. UV-synlig spektroskopi, transmissionselektronmikroskopi eller dynamisk lysspredning) inden fuld eksperimentering for at bevare værdifulde ressourcer, hvis man tester dyrebare reagenser16. Under mærkning af QD'er med spike blandes specifikke koncentrationer af QD og Spike for at opnå et specifikt forhold mellem molekyler. Kun QD og Spike blandes, og begge opløsninger er stærkt rensede. For at vurdere mærkningen af QD'er kan en acrylamidgel støbes og fyldes med QD alene såvel som QD-konjugeret til Spike, hvilket resulterer i tungere molekylvægtsbånd.

QD'erne, der anvendes i denne protokol, har et fluorescensexcitations- / emissionsspektrum indstillet til 608 nm emission efter UV-excitation (≤405 nm), da de fleste QD'er har høj absorption nær UV-området, der producerer høj fotoluminescens18. Dette er en ukonventionel excitation / emission kombination, der kræver et mikroskop for at have tilpasselige kanaler. Mange traditionelle konfokale mikroskoper kan opsættes med de rigtige filtre og laserlinjer for at opnå denne excitation/emission. Alternativt vil excitation af QD ved det første absorptionsmaksimum, ca. 10 til 20 nm væk fra emissionstoppen (f.eks. 592 nm for _QD608, der anvendes her), også være i stand til at producere tilstrækkelig fotoluminescens.

Den skybaserede software, der bruges i denne analyseprotokol med højt indhold, bruger et navngivningsskema, der bygger på tidligere trin. For eksempel er de første objekter, der er segmenteret, kerner, som skaber en befolkning kaldet kerner. Herefter kan cellen eller cytoplasmaet identificeres som en ROI-region inden for populationskernerne. Den terminologi, der anvendes i billedanalysesoftwaren, angiver navnet på populationen af objekter segmenteret ved hjælp af kernebyggestenen som kerner. De behøver dog ikke nødvendigvis at være kerner og kan være cellelegemer, hvis der ikke er noget nukleart farvestof til rådighed. Dette navngivningsskema kan også ændres og tilpasses inden for hvert byggestensoutputnavn.

Vores protokol tog ikke højde for membraninteraktioner, men dette kunne gøres ved at tilføje en ekstra membranplet, der er uafhængig af ACE2-GFP-handel. For at blokere uspecifik binding er 0,1% BSA inkluderet i analysemediet (DMEM + 0,1% BSA), og cellerne dyrkes også i 10% FBS. Mutant spike-proteiner kunne bruges, men vi var begrænset til kommercielt tilgængelige spikeproteiner. I dette tilfælde var et SARS-CoV-2-mutant ikke-ACE2-bindende Spike-protein ikke tilgængeligt.

QD nanopartikelmetoden præsenterer en kraftfuld teknologi til at studere binding og internalisering af vira, der er afhængige af Spike-medieret indgang. Dette assay kan bruges til screening med høj gennemstrømning på en analog måde, som vist i figur 4, til at genbruge og identificere potente antivirale midler, der blokerer cellulær indgang. Mens denne protokol kun demonstrerede brugen af QD'er konjugeret til Washington WA-1-referencestammen af SARS-CoV-2, kan dette assay let tilpasses til at studere bindingsegenskaberne for nyligt fremkomne varianter som Alpha, Beta, Gamma og Delta ved brug af deres respektive spikeproteiner konjugeret til QD'er.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
32% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714	Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%
7.5% Bovine Serum Albumin	Gibco	15260-037	Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain	Logos Biosystems	F23001	Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike
Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine	Greiner	655946	Used to support cell culture, DMEM supplement
Characterized Fetal Bovine Serum	Cytiva/HyClone	SH30071.03	Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1
Columbus Analyzer	Perkin Elmer	NA	Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye
DRAQ5 (5 mM)	ThermoFisher Scientific	62252	Basal media for HEK293T cell culture
Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red	Gibco	11995-065	Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365
Excel	Microsoft	NA	Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement
G418	InvivoGen	ant-gn-5	Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP
HEK293T hACE2-GFP	Codex Biosolutions	CB-97100-203	Automated cell counter
Luna Automated Cell Counter	Logos Biosystems	NA	Used for fluorescence cell counting
Luna Cell Counting Slides	Logos Biosystems	L12001	High-content imaging platform
Opera Phenix	Perkin Elmer	NA	Imaging media, used for incubating cells with quantum dots
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	11058-021	Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying
PBS -/-	Gibco	10010-023	Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0
Prism	GraphPad	NA	Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)	custom made by Naval Research Laboratory		Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab	Sino Biological	40592-MM57	Used to dissociate cells from flask during passaging
TrypLE Express	Gibco	12605-010