Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Konfektavbildning av Quantum Dot-Konjugert SARS-CoV-2 spike trimers for å spore binding og endokytose i HEK293T-celler

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63202

Summary

I denne protokollen, kvanteprikker konjugert til rekombinant SARS-CoV-2 spike aktivere cellebaserte analyser for å overvåke spike binding til hACE2 ved plasmamembranen og påfølgende endokytose av de bundne proteiner i cytoplasma.

Abstract

Utviklingen av ny teknologi for cellulær fluorescensmikroskopi har lagt til rette for screeningmetoder med høy gjennomstrømning for narkotikaoppdagelse. Kvanteprikker er fluorescerende nanopartikler med utmerkede fotofysiske egenskaper gjennomsyret av lys og stabil fotoluminescens samt smale utslippsbånd. Kvanteprikke er sfæriske i form, og med riktig modifikasjon av overflatekjemien kan brukes til å konjugere biomolekyler for cellulære applikasjoner. Disse optiske egenskapene, kombinert med evnen til å funksjonalisere dem med biomolekyler, gjør dem til et utmerket verktøy for å undersøke reseptor-ligand interaksjoner og cellulær menneskehandel. Her presenterer vi en metode som bruker kvanteprikker for å spore binding og endokytose av SARS-CoV-2 spike protein. Denne protokollen kan brukes som en veiledning for eksperimentalister som ønsker å bruke kvanteprikkene til å studere proteinproteininteraksjoner og menneskehandel i sammenheng med cellulær fysiologi.

Introduction

Fluorescensmikroskopi gjør det mulig for forskere å kikke inn i cellens indre arbeid ved hjelp av spesialiserte fargestoffer1, genetisk kodede fluorescerende proteiner2 og fluorescerende nanopartikler i form av kvanteprikker (QDs)3. For det alvorlige akutte respiratoriske syndromet coronavirus i 2019 (SARS-CoV-2) global pandemi, har forskere brukt fluorescensmikroskopi for å forstå hvordan viruset samhandler med cellen både ved plasmamembranen og i cytoplasma. For eksempel har forskere vært i stand til å få innsikt i bindingen av SARS-CoV-2 Spike-proteinet på virionens overflate til menneskelig angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) på overflaten av menneskelige celler, etterfølgende internalisering via fusjon ved plasmamembranen og endokytose av Spike:hACE2 proteinkomplekset4,5. Stor innsikt har også blitt oppnådd i SARS-CoV-2-utgående fra celler via lysosomet ved hjelp av cellulær fluorescensavbildning, et unikt trekk ved koronavirus som tidligere ble antatt å oppstå via tradisjonell vesicle spirende fra Golgi, som det er med mange andre virus6. En bærebjelke i nesten alle aspekter av biologisk forskning, den cellulære fluorescensmikroskopiteknikken har nødvendigvis avansert i bredden og omfanget av applikasjoner fra superoppløselig avbildning av hele dyr til automatisert multiparametrisk bildebehandling med høyt innhold for narkotikascreening. Her brukes automatisert konfektmikroskopi med høyt innhold på studiet av SARS-CoV-2-celleinngang ved hjelp av fluorescerende QDer som er konjugert til det virale piggproteinet.

Høyinnholdsanalyse av bilder generert av biologiske bildeplattformer gir større utvinning av verdifull biologisk innsikt enn enkeltparametere som hel brønnintensitet, som man vil oppnå ved hjelp av en multimodal plateleser7. Ved å skille objektene i et synsfelt ved hjelp av automatiserte segmenteringsalgoritmer, kan hvert objekt eller en populasjon av objekter analyseres for parametere som intensitet, område og tekstur i hver tilgjengelige fluorescenskanal8. Å kombinere mange målinger i multivariate datasett er en nyttig tilnærming for fenotypisk profilering. Når ønsket fenotype er kjent, for eksempel QD internalisering i form av puncta, kan man bruke målingene relatert til puncta som størrelse, antall og intensitet for å vurdere effekten av en behandling.

Skybasert programvare for bildebehandling med høyt innhold kan romme et stort utvalg av instrumentdatautganger, inkludert bildeplattformen med høyt innhold. Ved å bruke en skybasert server for bildelagring og online analyse, kan brukeren laste opp dataene sine fra enten bildeinstrumentet eller fra nettverksstasjonen der dataene er lagret. Analysedelen av protokollen utføres i skyprogramvaremiljøet, og data kan eksporteres i en rekke filformater for nedstrøms datavisualisering.

SARS-CoV-2-viruset består av ikke-strukturelle og strukturelle proteiner som hjelper til med montering og replikering. SARS-CoV-2 spike har to domener kalt S1 og S2, med S1 som inneholder reseptorbindingsdomenet som er ansvarlig for hACE2-interaksjoner ved plasmamembranen9. Spike har også vist seg å samhandle med andre molekyler ved plasmamembranen som kan fungere som koreseptorer i tillegg til hACE210,11. Gjennom piggproteinsekvensen og spesielt ved S1/S2-grensesnittet er det protease spaltingssteder som muliggjør fusjon ved membranen etter transmembrane serinprotease 2 (TMPRSS2)12. Ulike rekombinante SARS-CoV-2 Spike-proteiner er produsert fra individuelle reseptorbindingsdomener, til S1, S2, S1 med S2 og hele spike trimers fra flere kommersielle leverandører for bruk i forskningsaktiviteter13.

I dette arbeidet ble overflaten av QDs funksjonalisert med rekombinante spike trimers som inneholder en histidin tag (QD-Spike). QD-ene produsert av Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section inneholder en kadmium selenidkjerne og et sinksulfidskall14,15. Sinken på QD-overflaten koordinerer histidinrester i det rekombinante proteinet for å danne en funksjonalisert QD som ligner en SARS-CoV-2 viral partikkel i form og funksjon. Genereringen av nanopartikler og proteinkonjugering ble tidligere beskrevet ved hjelp av QD-konjugert reseptorbindingsdomene15. Denne metoden beskriver cellekulturpreparatene, QD-behandling, bildeinnhenting og dataanalyseprotokoll som kan veilede en forsker i å studere SARS-CoV-2 Spike-aktivitet i den fysiologiske konteksten til en menneskelig celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HEK293T-cellelinjen som brukes i denne studien er en udødeliggjort cellelinje. Ingen personer eller dyrepersoner ble brukt i denne studien.

1. Cellekultur og såing

  1. Inne i et sterilt biosikkerhetsskap, iført personlig verneutstyr (inkludert labhansker, labfrakk og vernebriller), klargjør cellekulturmediet ved å supplere Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% fosterbovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (P/S) og 250 μg/ml G418.
    1. For 500 ml medier, tilsett 443,75 ml DMEM, 50 ml FBS, 5 ml P/S og 1,25 ml G418.
    2. Filtrer gjennom en 0,2 μm filterflaske og oppretthold steriliteten for å unngå bakteriell forurensning.
  2. Inne i et sterilt biosikkerhetsskap, frø interiøret 60 brønner av en svart, klarbunn, poly-D-lysin belagt 96-brønns plate med 20.000 celler i 100 μL per brønn av cellekultur medium. Fyll de ytre 36 brønnene med 100 μL per brønn fosfatbufret saltvann (PBS).
    1. For å telle cellene, tilsett 2 μL acridine oransje og propidiumjodidflekk til 18 μL celleoppheng.
    2. Last 10 μL av denne løsningen inn i den ene siden av et celletellingslysbilde.
    3. Gjenta trinn 1.2.1. og 1.2.2. for å laste inn begge sider av lysbildet.
    4. Plasser lysbildet i en automatisert celleteller.
    5. Velg fluorescenstellingsprotokollen, og trykk på Antall. Tell begge sider av lysbildet, og beregn gjennomsnittet av de to live-celletetthetene.
    6. Hvis du vil beregne ønsket volum av celleoppheng, deler du det totale antallet celler som trengs av den gjennomsnittlige celletettheten.
  3. Inspiser brønnene etter sådd under et lysmikroskop for å sikre at riktig tetthet og fordeling er oppnådd.
  4. Inkuber platen over natten i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.

2. Behandling av celler med QD-Spike

  1. Forbered 0,1% bovint serumalbumin (BSA) ved å fortynne i bildemedier.
    1. For 10 ml bildemedier tilsettes 130 μL 7,5 % BSA og blandes.
  2. I et 12-brønns reservoar eller analyseplate fortynner du 440 nM QD-Spike (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) lager til 20 nM ved hjelp av 0,1% BSA i bildemedier.
    1. For 1 brønn QD-Spike, tilsett 2,27 μL 440 nM QD-Spike til 47,73 μL 0,1% BSA bildemedier for en endelig konsentrasjon på 20 nM.
    2. For å generere en sekspunkts 1:3 seriell fortynning (i triplikat), tilsett 14,26 μL QD-Spike til 285,74 μL 0,1% BSA-bildemedier for å gjøre den høyeste konsentrasjonen på 20 nM. Tilsett 100 μL 20 nM QD-Spike til 200 μL 0,1% BSA-medier for å gjøre den andre fortynning av 6,67 nM QD-Spike. Gjenta fire ganger for å generere de seks konsentrasjonspunktene.
  3. Bruk en flerkanals aspirator til å fjerne alle brukte medier fra hver brønn. Bruk en flerkanals pipette og vask én gang med bildemedier (100 μL/brønn).
  4. Aspirer 100 μL bildemedier og legg til 50 μL/brønn QD-Spike-oppløsning.
  5. Inkuber platen i 3 timer i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2. Fortsett til trinn 4.

3. Fiksering og nuklei flekker

  1. Inne i et sterilt biosikkerhetsskap, iført personlig verneutstyr (inkludert laboratoriehansker, labfrakk og vernebriller), lag 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1% BSA-bildemedier.
  2. Aspirer 50 μL QD-Spike fra hver brønn og tilsett 100 μL/brønn på 4% PFA.
    1. Ikke la brønnene tørke ut. Bruk en automatisert flerkanals pipette for å unngå tørking av brønnene (anbefales).
  3. Inkuber i 15 min ved romtemperatur.
  4. Vask tre ganger med 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
  5. Forbered det dype røde kjernefysiske fargestoffet ved å fortynne 5 mM lagerløsningen til 1:1000 fortynning i PBS.
  6. Aspirer ut PBS og legg tilbake 50 μL / brønn med fortynnet kjernefargestoff.
  7. Inkuber i 30 min ved romtemperatur.
  8. Vask tre ganger med PBS.
  9. Se for deg platen eller forseglingen ved hjelp av en plateforsegler for avbildning på et senere tidspunkt. Oppbevar platen ved 4 °C. Fluorescens bør være stabil i flere uker eller mer.

4. Oppkjøpsoppsett og bildebehandling

  1. Start programvaren for bildeplattformen. Slå på bildeplattformen med høyt innhold, og lyset på statuslinjen skal være på. Hvis maskinen ikke er tilkoblet, vil programvaren gå inn i frakoblet analysemodus.
  2. Logg inn på bildeplattformen.
  3. Opprett en ny anskaffelsesprotokoll.
    1. Velg Platetype som 96-brønns klar bunnavbildningsplate.
      MERK: Platevalget i instrumentet kan variere og kan tilpasses ved å laste inn de riktige platedefinisjonene som inkluderer platedimensjoner som høyde, bredde og andre avstander for å definere brønnavstand og kontaktpunkter.
    2. Velg Optisk modus som konfikal og forstørrelse som 40x vann nedsenking.
    3. Velg Binning som 1.
    4. Velg kanaler og fluorescerende eksitasjons-/utslippsbølgelengder som beskrevet i trinn 4.3.5-4.3.8. Ta et øyeblikksbilde når innstillingene er valgt for å vise bildet og sikre at innstillingene passer.
      MERK: Digital fasekontrast (DPC) vil tillate visualisering av levende celler uten celleflekk eller fluorescerende fargestoff. Det anbefales ikke for faste celler.
    5. Velg Modus for DPC, for eksempel Høykontrast, for å produsere veldefinerte celletekster. Ta et øyeblikksbilde for å bekrefte at denne innstillingen er riktig, som vist i bildevinduet.
    6. Velg FITC-kanalen for bruk med ACE2-GFP-cellelinjen som tillater visualisering av ACE2-smugling i cellen.
    7. For å lage en tilpasset kanal for QD-kanalen, velg rullegardinmenyen for trekant for kanalen og velg eksitasjon i 405 nm-serien og utslippet i 608 nm-serien.
    8. Hvis celler ble fikset og et dypt rødt kjernefysisk fargestoff ble brukt, velg den ytre røde kanalen med utslipp større enn 630 nm for å avgrense cellekroppen ytterligere og fungere som cellemaske.
    9. Velg en brønn med et sterkt cytoplasmisk QD-signal for å stille inn eksponeringstid, laserkraft og Z-høydeposisjon. Følg trinnene fra 4.3.10-4.3.13.
    10. Kontroller om standardhøyden gir et bilde der cellene er i ønsket brennplan. Hvis den endokytosede punctaen er målorganellen, vil Z-posisjonen være lavere enn om plasmamembranen er målorganellen.
    11. Velg en eksponeringstid som gir et klart bilde med gråtoner som er minst tre ganger større enn bakgrunnssignalet. Dette er vanligvis mellom 100 og 300 ms. Ved 20 nM skal de grå nivåene være ca. 6000 a.u. ved hjelp av en eksponeringstid på 200 ms og lasereffekt på 80%.
    12. Kontroller gråtoner ved å høyreklikke bildet som produseres med Snapshot-funksjonen i hver kanal, og velge Vis intensitet. Deretter venstreklikker du på objektet av interesse eller bakgrunn for å se det grå nivået for den pikselen.
    13. Juster laserkraften for å finjustere intensiteten til gjenstandene av interesse.
  4. Lagre anskaffelsesprotokollen.
  5. Bytt til Kjør eksperiment og skriv inn platenavnet.
  6. Kjør eksperimentet.

5. Dataanalyse

  1. Importer data til bildebehandlingsprogramvaren.
    1. Når du har anskaffet alle bildene, eksporterer du målinger til bildebehandlingsprogramvaren. Dette krever at det opprettes en server og at det opprettes en konto. Opprett et skjermbilde for dataene som skal eksporteres til bildebehandlingsprogramvaren.
  2. I bildebehandlingsprogramvaren velger du Bildeanalyse for å begynne å bygge analyseprotokollen.
  3. Last inn målingene fra bildebehandlingseksperimentet ved å høyreklikke på filen i skjermlisten og klikke på Velg. Platekartet over avbildede brønner og tilhørende felt skal være synlig nederst til venstre i vinduet.
  4. Velg en brønn med lyse cytoplasmiske QD-flekker for å starte bildesegmentering.
  5. Velg Flatfeltkorrigering i byggeblokken for inndatabildet.
  6. Legg til neste byggeblokk i protokollen ved å velge Søk etter nuclei.
    1. Her bruker du DPC eller fjernrød kanal som Nuclei-markøren.
    2. Velg metoden som segmenterer objektene nøyaktig først, og finjuster deretter segmenteringen ved hjelp av rullegardinmenyen og juster glidebryterne.
      MERK: God segmentering definerer nøyaktig interesseområdet (ROI) for kjernen, cellen og flekkene. Bare bildepunktene som er positive for markøren, bør fanges opp i en individuell avkastning. Bakgrunnssignal bør utelukkes. Hvis bakgrunnen fanges opp i avkastningen, kan følsomheten til metoden reduseres, eller intensitetsterskelen kan økes for å øke strengheten til segmenteringsalgoritmen. Dette gjelder for alle Finn byggeblokker.
  7. Deretter legger du til Find Cytoplasm Building Block for å identifisere cytoplasma.
    1. I dette tilfellet bruker du ACE2-GFP-kanalen for cytoplasmatisk segmentering.
    2. Velg metoden som best identifiserer cytoplasmaet for hver celle.
  8. Deretter legger du til Find Spots Building Block for å identifisere QD-Spike puncta.
    1. Velg Nuclei som roi-populasjon.
    2. Merk cellen som avkastningsområde. Dette fanger punctaen i hele cellen.
    3. Velg metoden som best identifiserer QD puncta i hver celle.
  9. Når alle objektene i bildet er segmentert og identifisert nøyaktig i denne brønnen, velger du andre brønner for å sikre at byggeklossene og innstillingene generelt kan brukes på de andre brønnene og andre forhold.
  10. Legg til beregn intensitetsegenskaper for alle segmenterte objekter (kjerner, cytoplasma/celler og flekker).
  11. Legg til beregn morfologiegenskaper for alle segmenterte objekter (kjerner, cytoplasma/celler og flekker).
  12. Legg til beregn teksturegenskaper for alle segmenterte objekter (kjerner, cytoplasma/celler og flekker).
  13. Definer resultater ved å velge parameterne for hver populasjon, inkludert kjerner og flekker. Antall objekter kan brukes som et indirekte mål på celle levedyktighet.

6. Eksportere data

  1. Klikk på Batch-analyse. Vent til analysen er ferdig før du går videre til neste trinn (trinn 6.2).
    MERK: Batchanalysen gjør det mulig for programvareserveren for bildeanalyse å laste inn analyseprotokollen ved hjelp av de valgte målingene for å analysere dataene eksternt.
  2. Eksporter datasettet til en lokal datamaskin eller nettverksstasjon.
    1. Koble bildeanalyseprogramvaren til et hjelpeprogram på datamaskinen ved å laste ned og åpne en tilkoblingsfil.
    2. Velg resultatfiltypen (.txt, .csv, .html eller opprinnelig XML).
    3. Velg innstillingene for filmappen med rullegardinmenyen.

7. Analyser dataene i et regneark

  1. Åpne den eksporterte filen. Hvis det er en .csv fil, lagrer du den som et .xls filformat for å aktivere bruk av pivottabeller. Hvis filbanen er for lang, lagrer du den .xls filen høyere oppe i mappehierarkiet for å unngå feil under lagring.
  2. Legg til kolonner i regnearket som angir betingelsene for hver brønn. For eksempel celletypen, QD-Spike-varianter, QD-Spike-konsentrasjoner, inkubasjonstid, etc.
  3. Velg pivottabellfunksjonen , og bygg tabellen ved hjelp av betingelsene som er lagt til som Rader, og de målte parameterne som Kolonner. Velg beregningen for hver parameter, det vil si Gjennomsnitt, Standardavvik, Median, Min, Maks eller Antall.
  4. Normaliser dataene for å kontrollere prøver, inkludert ukonjugiserte QDer som 0 % og den høyeste konsentrasjonen av QD-Spike som 100 %.
    MERK: Hvis du vurderer effekten av inhibitorer som nøytraliserende antistoffer, normaliser dataene til mediebehandlede celler (100 % effekt) og QD-Spike uten hemmer (0 % effekt).
  5. Plott dataene i grafer programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved behandling vil QDene bli internalisert da nanopartikkelen vil binde seg til ACE2 på plasmamembranen og indusere endokytose. Ved hjelp av en ACE2-GFP som uttrykker cellelinje, kan translokasjon av både QDs og ACE2 visualiseres ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Når de er internalisert, viser de to QD- og ACE2-signalene sterk colokalisering. Fra disse bildene kan bildesegmentering og etterfølgende analyse utføres for å trekke ut relevante parametere som spotantall (figur 1, figur 2B). Figur 1A er en montasje av celler som behandles med forskjellige konsentrasjoner av QD-Spike eller medier bare som en kontroll. Tre kanaler ble brukt, inkludert digital fasekontrast, FITC og den tilpassede QD-kanalen med eksitasjon ved 405 nm og utslipp ved 608 nm. DPC gir et bilde av den generelle cellefiguren. DPC-bildet gir en omtrentlig indikasjon på hele cellemorfologien. Interesseområdet overlapper med DPC-signalet og er tilstrekkelig for å oppdage internaliserte QDer. FITC-kanalen viser ACE2-GFP som endrer lokalisering og akkumulerer i regioner som colokaliserer med QD-Spike. Etter hvert som konsentrasjonen av QD-Spike reduseres, er QDene ikke lenger synlige og ACE2-GFP-signalet ligner på kontroll. Sammenslåingskanalen demonstrerer colokaliseringen av ACE2-GFP med QD-Spike. Disse objektene er en blanding av flekker og større akkumuleringer som kan segmenteres med analyseprogramvaren. Finjustering av programvareanalysemetoden som brukes til bildesegmentering, kan brukes til å segmentere objekter av interesse.

Her ble det utført et konsentrasjonsresponseksperiment med seks forskjellige konsentrasjoner av QD-Spike, fra 20 nM, for å bestemme optimale konsentrasjoner av QD (figur 2A). QD-er kan brukes så lavt som 2,22 nM og fortsatt vise binding og internalisering. Det anbefales imidlertid å bruke konsentrasjoner på 20 nM eller høyere for å sikre en robust respons.

Under konjugering til QD kan proteinaggregering forekomme. Hovedproblemet med aggregater er at de vil samle seg på toppen av celler og forårsake artefakter i bildesegmenteringstrinnet. Aggregater vil ikke kunne komme inn i celler, og nanopartiklene som helhet vil ikke lenger ligne en viral partikkel (figur 3). Aggregater kan oppdages i QD-løsningen som lyse, klumpede bunnfall.

Denne analysen kan også brukes til å vurdere biologer, for eksempel nøytraliserende antistoffer som blokkerer viral oppføring. QD-er ble inkubert med nøytraliserende antistoffer (figur 4A), fra 30 μg/ml, i 30 minutter ved romtemperatur før tilsetning til celler. Antistoffer reist mot referansen Washington-stammen, SARS-CoV-2 RBD, ble brukt. De blokkerte binding, internalisering og forårsaket en reduksjon i målt spotantall sammenlignet med celler som ble behandlet med bare QD (figur 4B).

Figure 1
Figur 1: Bildeanalyse av høyt innhold og segmentering av ACE2-GFP-celler behandlet med QD608-Spike. Representative bilder av nøyaktig segmentering. For det første segmenteres kjerner fra kanalen som inneholder atommarkøren for å skape en avkastningspopulasjon. Fra roi-populasjonen segmenteres et ROI-område som skisserer cellen ved hjelp av ACE2-GFP-kanalen. Til slutt er QD608-Spike flekker segmentert fra Cell ROI-regionen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: QD608-Spike binder hACE2 og er endocytosed i hACE2-GFP HEK293T celler. (A) Bildemontasje av hACE2-GFP (gul) HEK293T celler behandlet med flere konsentrasjoner av QD608-Spike (magenta) eller media-only. Digital fasekontrast (cyan) ble brukt til å visualisere cellekroppen. Skalalinje: 20 μm. (B) Høy innholdsanalyse av QD608-Spike Spot Counts normalisert til 20 nM QD608-Spike (100%) og kontrollen (0%). N = triplikatbrønner. Feilfelt angir standardavvik (S.D.). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Aggregerte QD608-Spike er ikke internalisert i hACE2-GFP HEK293T-celler. Bildemontasje av hACE2-GFP HEK293T celler behandlet med 10 nM QD608-Spike eller bare media-only. Skalalinje: 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Nøytraliserende antistoffblokker endokytose av QD608-Spike i hACE2-GFP HEK293T-celler. (A) Bildemontasje av hACE2-GFP (gul) HEK293T celler behandlet med QD608-Spike (magenta) forhåndsinkumert med synkende konsentrasjoner av nøytraliserende antistoffer, ved hjelp av digital fasekontrast (cyan) for å identifisere cellelegemer. Skalalinje: 20 μm. (B) Høy innholdsanalyse av QD608-Spike Spot Counts normalisert til kun media-kontroll (100%) og 10 nM QD608-Spike only (0%). N = triplikatbrønner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som er beskrevet i denne artikkelen, inneholder de nødvendige trinnene for avbildning av funksjonaliserte QDer i humane celler ved hjelp av konfektmikroskopi med høy gjennomstrømning. Denne metoden er best egnet for celler der endokytose er hovedveien for viral oppføring i stedet for aktiviteten til TMPRSS2 og membranfusjon, da den muliggjør studiet av SARS-CoV-2 Spike og hACE2 endokytose. På grunn av arten av QD-modellen og C-terminalen His-tag på den kommersielt tilgjengelige Spike trimer, vil enhver TMPRSS2-spalting av Spike S1- og S2-domener etterlate QD festet til S2-domenet bare12. Dette kan forhindre internalisering, gitt at RBD finnes i S1. Derfor, hvis hendelsesforløpet på celleoverflaten var presis, hvor hACE2 er bundet og deretter TMPRSS2 cleaves Spike, forventes et negativt signal uten internalisering.

Ettersom denne protokollen omhandler avbildning av cellulære prosesser, må de dyrkede cellene være tillatt for virusinfeksjon med uttrykk for hACE2. hACE2 kan oversettes midlertidig til celler, eller en stabil cellelinje som uttrykker hACE2 kan genereres17. Det anbefales å verifisere hACE2-uttrykk og lokalisering ved hjelp av immunfluorescens med antistoffer mot hACE2 med mindre hACE2 har en fluorescerende proteinkode som GFP som kan observeres ved hjelp av mikroskopi. GFP-merket hACE2 gir den ekstra fordelen av å visualisere hACE2-handel etter QD-Spike-endokytose. Noen cellelinjer med endogent hACE2-uttrykk kan brukes, men dette bør bekreftes ved hjelp av immunocytokjemi. I noen tilfeller gir det endogene uttrykket ikke nok hACE2 bindende partnere for QD-Spike og kan resultere i et signal som er dårlig oppdaget av konfokal mikroskopi med høy gjennomstrømning.

Et kritisk skritt i protokollen inkluderer anskaffelse av høykvalitets QD-er som er konjugert til den rekombinante His-tagged SARS-CoV-2 Spike. Forutsetningen for dette er et riktig renset protein som kan konjugeres til QDs uten å forårsake aggregering. Aggregerte QDer vil ha flere problemer som forhindrer et vellykket eksperiment. Derfor anbefales testing av QD-Spike ved hjelp av analyseverktøy (f.eks. UV-synlig spektroskopi, transmisjonselektronmikroskopi eller dynamisk lysspredning) før full eksperimentering på det sterkeste for å bevare verdifulle ressurser hvis du tester dyrebare reagenser16. Under merking av QDs med spike blandes spesifikke konsentrasjoner av QD og Spike for å oppnå et bestemt forhold mellom molekyler. Bare QD og Spike blandes, og begge løsningene er svært renset. For å vurdere merkingen av QDs, kan en akrylamidgel støpes og lastes med QD alene, samt QD-konjugert til Spike, noe som resulterer i tyngre molekylvektbånd.

QD-ene som brukes i denne protokollen har et fluorescenseksitasjons-/utslippsspekter innstilt til 608 nm-utslipp etter UV-eksitasjon (≤405 nm) siden de fleste QD-er har høy absorpsjon nær UV-serien som produserer høy fotoluminescens18. Dette er en ukonvensjonell eksitasjons-/utslippskombinasjon som krever at et mikroskop har kanaler som kan tilpasses. Mange tradisjonelle konfektmikroskoper kan settes opp med de riktige filtrene og laserlinjene for å oppnå denne eksitasjonen / utslippet. Alternativt vil eksitasjon av QD ved første absorpsjons maksimum, ca. 10 til 20 nm unna utslippstoppet (f.eks. 592 nm for QD608 som brukes her), også kunne produsere tilstrekkelig fotoluminescens.

Den skybaserte programvaren som brukes i denne analyseprotokollen med høyt innhold, bruker et navneskjema som bygger på tidligere trinn. De første objektene som segmenteres, er for eksempel kjerner, som oppretter en populasjon kalt Nuclei. Etter dette kan cellen eller cytoplasma identifiseres som en avkastningsregion i populasjonen Nuclei. Terminologien som brukes i bildeanalyseprogramvaren angir navnet på populasjonen av objekter segmentert ved hjelp av kjernebyggeblokken som Nuclei. Imidlertid trenger de ikke nødvendigvis å være kjerner og kan være cellelegemer hvis ingen kjernefysisk fargestoff er tilgjengelig. Dette navneoppsettet kan også endres og tilpasses innenfor hvert utdatanavn for byggeblokk.

Vår protokoll redegjorde ikke for membraninteraksjoner, men dette kunne gjøres ved å legge til en ekstra membranflekk som er uavhengig av ACE2-GFP-handel. For å blokkere ikke-spesifikk binding er 0,1% BSA inkludert i analysemediet (DMEM + 0,1% BSA), og cellene vokser også i 10% FBS. Mutant spike proteiner kunne brukes, men vi var begrenset til kommersielt tilgjengelige piggproteiner. I dette tilfellet var ikke et SARS-CoV-2 mutant ikke-ACE2-bindende Spike-protein tilgjengelig.

QD nanopartikkelmetoden presenterer en kraftig teknologi for å studere binding og internalisering av virus som er avhengige av Spike-mediert oppføring. Denne analysen kan brukes til screening med høy gjennomstrømning på en analog måte, som vist i figur 4, for å gjenbruke og identifisere potente antivirale stoffer som blokkerer cellulær oppføring. Selv om denne protokollen bare demonstrerte bruken av QD-er som ble konjugert til Washington WA-1-referansestammen til SARS-CoV-2, kan denne analysen enkelt tilpasses for å studere bindingsegenskapene til nye varianter som Alpha, Beta, Gamma og Delta gjennom bruk av deres respektive piggproteiner konjugert til QDs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble delvis støttet av Intramural Research Program ved National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Naval Research Laboratory ga støtte via sitt interne Nanoscience Institute. Reagensforberedelse ble støttet via NRL COVID-19 basisfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714 Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2%
Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%
7.5% Bovine Serum Albumin Gibco 15260-037 Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike
Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine Greiner 655946 Used to support cell culture, DMEM supplement
Characterized Fetal Bovine Serum Cytiva/HyClone SH30071.03 Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1
Columbus Analyzer Perkin Elmer NA Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye
DRAQ5 (5 mM) ThermoFisher Scientific 62252 Basal media for HEK293T cell culture
Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red Gibco 11995-065 Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365
Excel Microsoft NA Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement
G418 InvivoGen ant-gn-5 Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP
HEK293T hACE2-GFP Codex Biosolutions CB-97100-203 Automated cell counter
Luna Automated Cell Counter Logos Biosystems NA Used for fluorescence cell counting
Luna Cell Counting Slides Logos Biosystems L12001 High-content imaging platform
Opera Phenix Perkin Elmer NA Imaging media, used for incubating cells with quantum dots
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 11058-021 Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying
PBS -/- Gibco 10010-023 Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0
Prism GraphPad NA Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) custom made by Naval Research Laboratory Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab Sino Biological 40592-MM57 Used to dissociate cells from flask during passaging
TrypLE Express Gibco 12605-010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
  2. Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
  3. Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
  4. Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
  5. Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
  6. Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
  7. Buchser, W., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2012).
  8. Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
  9. Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
  10. Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
  11. Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
  12. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  13. Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), New York, N.Y. 1586-1592 (2020).
  14. Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
  15. Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
  16. Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
  17. Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
  18. Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).

Tags

Biologi utgave 182
Konfektavbildning av Quantum Dot-Konjugert SARS-CoV-2 spike trimers for å spore binding og endokytose i HEK293T-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tran, B. N., Oh, E., Susumu, K.,More

Tran, B. N., Oh, E., Susumu, K., Wolak, M., Gorshkov, K. High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells. J. Vis. Exp. (182), e63202, doi:10.3791/63202 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter